Method Article

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 뇌의 적절한 개발은 신경 줄기 세포 증식 및 다른 신경 세포 유형으로 분화의 미세한 균형에 의존한다. 이 균형은 전사, 전사 후 및 번역을 포함하여 여러 수준에서 미세 조정되는 유전자 발현에 의해 엄격하게 제어됩니다. 이와 관련하여, 증거의 성장 몸은 신경 줄기 세포 운명 결정 조정에 번역 규제의 중요한 역할을 강조. 다일부 분획은 글로벌 및 개별 유전자 수준에서 mRNA 번역 상태의 평가를 위한 강력한 도구입니다. 여기에서, 우리는 발전마우스 대뇌 피질에서 세포의 번역 효율성을 평가하기 위하여 사내 polysome 프로파일링 파이프라인을 제시합니다. 우리는 자당 그라데이션 준비, 조직 용해, 초원심 분리 및 mRNA 번역 상태의 분획 기반 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 뇌의 발달 동안 신경 줄기 세포가 증식하고 분화하여 뉴런과 신경교1,2를 생성한다. 이 과정의 섭동은 많은 신경 발달 장애3,4에서볼 수 있듯이 뇌 구조 및 기능의 변경으로 이어질 수 있습니다. 신경 줄기 세포의 적절한 행동은 특정 유전자5의오케스트레이션된 발현을 요구한다. 이들 유전자의 후성유전학 및 전사적 대조가 집중적으로 연구되고 있는 반면, 최근 연구 결과에 따르면 다른 수준에서 유전자 조절은 신경줄기 세포 증식 및 분화6,7,8,9,10의조정에 기여한다는 것을 시사한다. 따라서, 번역 제어 프로그램을 해결 크게 신경 줄기 세포 운명 결정 및 뇌 개발의 기본 메커니즘의 우리의 이해를 향상 시킬 것 이다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 사용은 캘거리 대학의 동물 관리위원회에 의해 감독되었습니다. 실험에 사용되는 CD1 마우스는 상용 벤더로부터 구입하였다.

1. 솔루션 준비

참고 RNA 분해를 방지하기 위해, 작업 벤치 및 RNase 오염 제거 솔루션으로 모든 장비를 스프레이합니다. RNase 가 없는 팁은 실험에 사용됩니다. 모든 솔루션은 RNase가 없는 물로 준비됩니다.

  1. DMSO에서 사이클로헨증 재고 용액(100 mg/mL)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
  2. RNase 가 없는 물에 75.3 g의 자당을 추가하고 부피를 100 mL로 토핑하여 2.2 M 자당 스톡 솔루션을 준비하십시오 (~16 그라데이션 준비용). 용액은 장기 저장을 위해 -20 °C로 보관 할 수 있습니다.
  3. 10x 염액(M NaCl 1개, 200m Tris-HCl, pH 7.5; 50m MgCl2)을준비한다.
  4. 자당 30g, 소금 용액 5mL를 함유한 60%(w/v) 자당 추적 용액을 준비하고 RNase 가 없는 물로 최대 50mL의 부피를 얹습니다.
  5. 선택적으로, 메모페놀 블루 또는 약 5 μL의 1% 브로모페놀 블루를 RNase 없....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

데모로서, 75 μg RNA를 포함하는 피질 용액(8개의 배아로부터 풀링)은 자당 그라데이션에 의해 12개의 분획으로 분리되었다. 254nm에서 UV 흡광도의 피크는 40S 서브유닛, 60S 서브유닛, 80S 단조및 다일부(도4A)를포함하는 분획을 확인하였다. 큰 리보솜 서브유닛에 대한 서쪽 블롯에 의한 분획의 분석은, Rpl10은 60S 하위 유닛(분획 3), 단음(분수 4) 및 다일부(분획 5-12)(도4B)에서그 존재를 보였다. 대조적으로, 세포질 단백질 Gapdh 및 Csde1은 리보솜과 연관되지 않았지만 자유 RNA (분획 1)를 포함하는 분수에서 농축되었다(도 4B). 다른 분획에서 단백질의 분리와 일치, 우리는 gapdh와 sox2 mRNAs가 높은 무거운 폴리좀을 포함하는 분획에서 풍부했다는 것을 발견 (분획에서 3 개 이상.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다각형 프로파일링은 단일 유전자 및 게놈 전체 수준14 모두에서 번역 상태를 평가하는 데 일반적으로 사용되는 강력한 기술이다. 이 보고서에서는 홈어셈블 플랫폼과 개발 중인 마우스 피질을 분석하기 위한 응용 프로그램을 사용하여 다형성 프로파일링 프로토콜을 제시합니다. 이 비용 효율적인 플랫폼은 견고하고 재현 가능한 자당 그라데이션과 고감도의 다형성 프로파일링을 쉽게 조립하고 생성할 수 있습니다.

일관되고 좋은 품질의 자당 그라데이션의 준비는 재현 가능한 다형성 프로파일링결과(17)를얻는 데 중요하다는 점에 유의할 가치가 있다. 그라데이션 준비 중 10-50% 자당 솔루션의 부피의 변화는 다운스트림 분석에서 다각성 피크의 변화와 결과의 불일치를 야기할 수 있습니다. 더욱이, 바늘의 삽입 및 제거 도중 그라데이션을 방해하는 것은 그라데이션 준비의 불일치에 기여할 수 있었다. 다른 접근 방식 및 상용 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 NSERC 디스커버리 그랜트 (RGPIN/04246-2018에서 G.Y.에)에 의해 지원되었습니다. G.Y.는 캐나다 연구 위원장입니다. S.K.는 미틱스 글로벌잉크 대학원 펠로우십과 ACHRI 대학원 학생 장학금의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL RNA free 마이크로튜브AxygenMCT-150-C
10 cm dishGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
21-23G needleBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 mL 주사기BD302832
블런트 엔드 바늘VWR20068-781
브레드보드ThorlabsMB2530/M
브로모페놀 블루시그마115-39-9
CD1 마우스Charles River Laboratory
곡선 팁 집게Sigma#Z168785
CycloheximideSigma66-81-9
데이터 수집 소프트웨어 TracerDAQ측정 컴퓨팅
디지털 컨버터측정 컴퓨팅USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kitZymoR2070
Dithiothreitol (DTT)Bio-basic12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 forcepsSigma#F6521
분획 수집기Bio-RadModel 2110
HBSSWisent311-513-CL
선형 스테이지 액추에이터RattmmotorCBX1605-100A
Luciferase control RNAPromegaL4561
Maxima 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트Themo FisherM1681
소형 V-클램프ThorlabsVH1/M
미니 시리즈 브레드보드ThorlabsMSB7515/M
미니 시리즈 광학 포스트ThorlabsMS2R/M
미니 시리즈 페디스탈 포스트 홀더 베이스ThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
Neurobasal mediaGibco21103-049
Ø 12.7mm 알루미늄 포스트ThorlabsTRA150/M
파라필름BemisPM992
PerfeCTa SYBR 녹색 패스트믹스Quanta BioCA101414-274
인산염 완충 식염수(PBS)Wisent311-010-CL
PuromycinBioshop58-58-2
직각 클램프ThorlabsRA90/M
직각 &오슬래시; 1/2" to Ø 6mm 포스트 클램프ThorlabsRA90TR/M
Rnase AWAYMolecular BioProducts7002
RNase free tipsFrogga BioFT10, FT200, FT1000
RNase free waterWisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
슬림 직각 브래킷ThorlabsAB90B/M
소형 V-클램프ThorlabsVC1/M
나트륨 데옥시콜레이트시그마302-95-4
스테퍼 모터 드라이버SongHeTB6600
SucroseBioshop57501
SW 41 Ti 로터Beckman Coulter331362
주사기 펌프Harvard Apparatus70-4500
주사기 펌프Harvard Apparatus70-4500
Triton-X-100Bio-basic9002-93-1
TrizolThermofisher Scientific15596018
튜브 피어싱BrandelBR-184
초원심분리기Beckman CoulterL8-70M
초원심분리기 튜브Beckman Coulter331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027
UNO 프로젝트 슈퍼 스타터 키트ElegooEL-KIT-003
UV 모니터Bio-RadEM-1 Econo
수직 브래킷ThorlabsVB01A/M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

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