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모든 동물 사용은 캘거리 대학의 동물 관리위원회에 의해 감독되었습니다. 실험에 사용되는 CD1 마우스는 상용 벤더로부터 구입하였다.
1. 솔루션 준비
참고 RNA 분해를 방지하기 위해, 작업 벤치 및 RNase 오염 제거 솔루션으로 모든 장비를 스프레이합니다. RNase 가 없는 팁은 실험에 사용됩니다. 모든 솔루션은 RNase가 없는 물로 준비됩니다.
- DMSO에서 사이클로헨증 재고 용액(100 mg/mL)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
- RNase 가 없는 물에 75.3 g의 자당을 추가하고 부피를 100 mL로 토핑하여 2.2 M 자당 스톡 솔루션을 준비하십시오 (~16 그라데이션 준비용). 용액은 장기 저장을 위해 -20 °C로 보관 할 수 있습니다.
- 10x 염액(M NaCl 1개, 200m Tris-HCl, pH 7.5; 50m MgCl2)을준비한다.
- 자당 30g, 소금 용액 5mL를 함유한 60%(w/v) 자당 추적 용액을 준비하고 RNase 가 없는 물로 최대 50mL의 부피를 얹습니다.
- 선택적으로, 메모페놀 블루 또는 약 5 μL의 1% 브로모페놀 블루를 RNase 없는 물에 추가하여 추격 용액에 넣습니다. 1.6. 4 °C에서 솔루션을 저장합니다.
2. 자당 그라데이션 준비
참고: 자당 그라데이션을 준비하는 정확도는 일관되고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.
- 6개의 10-50% 자당 그라데이션을 준비하려면 표 1과같이 2.2M 자당 용액을 희석한다.
| 수크로오스 솔루션 | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 M 자당 | 2 mL | 4 mL | 6 mL | 8 mL | 10mL |
| 10X 염액 | 1.5 mL | 1.5 mL | 1.5 mL | 1.5 mL | 1.5 mL |
| 사이클로헤시미드 | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| 물 | 11.5 mL | 9.5 mL | 7.5 mL | 5.5 mL | 3.5 mL |
| 총 볼륨 | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL |
표 1: 자당 그라데이션의 준비를 위한 자당 희석.
참고: 항상 2개의 배수로 자당 그라데이션을 준비하여 초원심 분리 시 무게의 균형을 유지합니다.
- RNase 오염 제거 용액으로 금속 무딘 엔드 바늘을 닦아냅니다. RNase가 없는 물을 사용하여 초원심분리기 튜브, 튜브 및 주사기를 간략하게 헹구십시오. 남은 물이 자당 농도를 변화시킬 수 있기 때문에 튜브에 물 방울이 남아 있지 않을 정도로 튜브를 공기 건조시하십시오.
- 금속 바늘을 클램프 홀더와 원심분리관에 전동 스테이지에 놓습니다. 그라데이션을 일관되게 준비하기 위해, 초원심분리기 튜브와 주사기 펌프를 보유하기 위해 전동 단계를 포함하는 홈 조립 시스템이 사용되었습니다(그림1,자세한 내용은 9단계 참조).
- 30mL 주사기를 10% 자당10%의 ~16mL로 채우고(6개의 그라데이션에 충분), 주사기 펌프에 놓고 바늘에 연결합니다. 주사기, 튜브 및 바늘에 기포가 없는지 확인하십시오. 바늘에서 팁을 닦아 잔류 용액을 제거합니다.
- 바늘 끝이 하단에 튜브의 중심에 닿을 수 있도록 전동 스테이지를 위로 이동합니다.
- 주사기 펌프를 2.3mL의 부피에 대해 2mL/분의 유량으로 설정합니다.
- 10% 자당 용액의 2.3mL을 분배한 후, 전동 스테이지를 아래로 이동하고 6개의 그라데이션 모두에 대한 공정을 반복합니다.
- 반복 단계 2.4-2.7 튜브의 바닥에 20 % 자당 솔루션을 추가하고 30 %, 40 % 및 50 % 자당 솔루션이 유사하게 뒤따릅니다.
- 그라데이션을 준비한 후 파라핀 필름을 사용하여 초원심분리기 튜브를 밀봉하십시오.
- 튜브를 4°C로 하룻밤 동안 두어 서로 다른 자당 층이 함께 확산되어 연속그라데이션을 제공합니다.
3. 조직 해부
참고: 임신한 마우스는 5%의 이소플루란을 가진 마취에 선행된 자궁 경관 탈구에 의해 안락사되었습니다.
- 12일째에 CD1 마우스 배아를 수집하거나 필요에 따라 다른 시점을 수집하고, 세포 생존가능성을 유지하기 위해 얼음에 얼음처럼 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 함유한 Ø 10cm 플레이트에 배아를 놓습니다.
- 해부 범위하에서, 얼음 차가운 HBSS를 포함하는 Ø 6cm 판으로 1개의 태아를 전송합니다.
- 21-23 G 바늘을 사용하여 약 45° 각도로 눈을 관통하여 머리의 위치를 고정하고 힘을 적용하여 바늘이 플레이트에 고정되었는지 확인합니다(도2A).
- 5번 포셉을 사용하여 가운데에서 측면으로 피부와 두개골을 제거합니다.
- 후각 전구를 잘라 서 수막을 제거 하려면 집게를 사용 하 여 피질 조직을 노출.3.6.곡면 집게를 사용 하 여 얼음에 신경 물질 매체의 2-3 mL로 피질 조직을 잘라(그림 2B). 필요에 따라 다른 태아에서 피질 조직을 풀. 8-10 개의 배아에서 조직은 일반적으로 ~200 μg 총 RNA를 제공합니다.
4. 셀 리시스
- 조직 해부의 날에, 표 2에설명된 대로 신선한 세포 리시스 버퍼를 준비한다.
| 용액 | 최종 농도 | 음량 |
| 트리스-HCl (pH 7.5) | 20mM | 100 μL |
| KCl | 100mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| 트리톤 X-100 | 1% (v/v) | 500 μL |
| 디옥시콜레이트 나트륨 | 0.5% (/v) | 500 μL |
| 디티오스레이톨 (DTT) | 1 mM | 5 μL |
| 사이클로헤시미드 | 100 μg/mL | 5 μL |
| RNase 무료 물 | | 최대 5mL의 탑 |
| 합계 | 5 mL | 5 mL |
표 2: 다형성 용해 버퍼 준비.
참고: 프로테아제와 인산염 억제제를 곁들인 용해 완충제를 보충합니다.
- 100 μg/mL의 최종 농도에 해부 된 조직을 가진 신경 물질 배지에 사이클로헨시미드를 추가하고 10 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 사이클로헤시미드는 번역 신장을 차단하므로 리보솜런오프 15를방지합니다.
- 원심분리기는 500 x g에서 5분 동안 4°C에서 5분 동안, 상체를 폐기합니다.
- 100 μg/mL 사이클로헤시미드로 보충된 얼음-차가운 인산염 완충식염(PBS)으로 조직을 두 번 세척합니다.
- RNase 억제제 4μL로 보충된 셀 리시스 버퍼 500 μL을 추가합니다. 파이펫은 분해 완충제에서 조직을 다시 중단합니다. 인슐린 바늘을 사용하여 조직을 부드럽게 lyse하십시오.
- 2-3분마다 간단한 소용돌이로 10분 동안 얼음에 티슈를 배양합니다.
참고: 조직 분해를 방지하기 위해 모든 단계의 조직 리시스가 얼음 위에 수행되도록 하십시오.
- 4°C에서 5분 동안 2,000 x g의 원심분리기.
- 얼음에 새로운 원심 분리튜브에 상체를 전송합니다.
- 4°C에서 5분 동안 ~13,000 x g의 원심분리기.
- 얼음에 새로운 원심 분리튜브에 상체를 전송합니다.
- UV-Vis 분광광계를 사용하여 조직 용액의 RNA 농도를 측정합니다.
참고: 여러 샘플이 실험에 포함된 경우 변형을 최소화하기 위해 추가 셀 리시스 버퍼로 샘플을 동일한 농도로 희석합니다.
5. 샘플 로딩 및 초원심 분리
- 4°C에서 초원심분리로및 스윙 버킷을 미리 식히고 초원심분리기의 온도를 4°C로 설정한다.
- 조직의 20 μL을 총 RNA 입력으로 보관하십시오.
- 수크로오스 그라데이션 의 상단에 적재 샘플(50-300 μg RNA)을 초음파 심분리기 튜브의 벽에 천천히 분배합니다.
- 울트라 센드리후어 튜브를 스윙 버킷에 부드럽게 놓습니다. 정반대의 모든 버킷이 균형을 이루도록 합니다.
- 로터에 스윙 버킷을 로드합니다. 초원심분리기를 4°C에서 190,000xg(~39,000rpm)로 90분 간 설정합니다.
- 원심 분리 후 그라데이션을 얼음위에 부드럽게 놓습니다.
6. 분획 및 샘플 수집
참고: 홈 조립 분획, 기록 및 수집 시스템은 그라데이션에서 샘플을 분석하고 수집하는 데 사용됩니다(그림3,장치 구성 요소 참조).
- 튜브 피어서에 빈 초원심분리기 튜브를 놓고 바닥에서 바늘로 튜브를 부드럽게 관통합니다.
- UV 모니터를 켜고 디지털 신호 녹음 소프트웨어를 엽니다.
- 30mL 주사기를 60% 자당 추적 용액의 25mL로 채웁니다. 체이스 용액이 빈 튜브를 채우고 254 nm UV 모니터를 통과하여 검출을 위한 기준선을 설정하도록 주사기를 부드럽게 누릅니다.
- UV 모니터에서 자동 0을 눌러 감지 기준을 등록합니다. 녹화를 시작하려면 소프트웨어에서 재생을 누릅니다.
- 시스템이 기준선을 설정하면 소프트웨어에서 레코딩을 일시 중지하고 추적 솔루션을 철회합니다. 시스템에 잔류 추적 솔루션이 남아 있지 않은지 확인합니다.
참고: RNase 가 없는 물로 시스템을 헹구어 이전 실행에서 남은 잔류 자당 용액을 제거합니다.
- 하나의 샘플 튜브를 튜브 피어서에 로드합니다. 바닥에서 바늘로 튜브를 부드럽게 관통합니다.
- 소프트웨어에서 녹음을 시작합니다. 주사기 펌프(25mL의 부피의 경우 1mL/분의 유량)와 분획 수집기를 시작하여 다일부 분획을 수집합니다. 분수기 설정을 30초로 설정합니다.
참고: 각 실행 전에 주사기를 부드럽게 눌러 주사기나 튜브에 기포가 없는지 확인하여 체이스 용액이 바늘을 통해 지속적으로 흐르도록 합니다.
- 분획 수집기는 분획 수집기(각 500μL)로 분획을 수집합니다.
- 분획은 즉시 처리되거나 -80°C로 저장할 수 있습니다.
- 분수 수집 후, RNase가없는 물로 시스템을 헹구어 남은 자당을 제거합니다.
7. RNA 추출
- 각 분수에, 루시파라제 mRNA 스파이크 인 컨트롤의 10 ng를 추가합니다.
- 각 분획에 3권의 구니듐 하이드로콜라이드 기반 상업용 RNA 격리 시약을 추가합니다.
- 15 초 동안 잠시 소용돌이.
- 7.2에 사용된 용액과 호환되는 RNA 추출 키트를 사용하여 RNA를 추출한다.
8. 역 전사 및 실시간 PCR
- UV-Vis 분광광계를 사용하여 RNA의 농도를 측정합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따르면, cDNA 합성 키트를 사용하여 전사를 반전 하는 대상 RNA.
- 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 gapdh mRNA의 다각체 분포를 예로 들 수 있습니다. qPCR은 qPCR 검출 시스템과 qPCR 마스터믹스 시약을 사용하여 수행되었으며, 다음 사이클링 조건과 함께 10분 동안 95°C, 15s에 대한 95°C의 40사이클, 30대 60°C, 40대 72°C, 60s에 95°C를 기록했다.
- 증폭 플롯에서 임계값 주기(Ct) 값을 가져오고 ΔΔCt 방법을 사용하여 접이식 변화를 계산하는 데 사용됩니다.
9. 수크로오스 그라데이션 만들기 시스템 조립
참고: 자당 그라데이션메이커(그림 1)의각 구성 요소(표 3에설명된 대로)를 조립하는 단계를 따릅니다.
- 기본 브레드보드(A1)에 두 개의 수직 브래킷(A2)을 장착합니다.
- 두 개의 슬림한 직각 브래킷(B2)을 사용하여 선형 스테이지 액추에이터를 기본 브레드보드(A1)에 장착합니다.
- Ø12.7 mm 알루미늄 포스트(C2)의 세트크루를 사용하여 튜브 홀더의 스탠드로 튜브 홀더 베이스 브레드보드(C1)에 고정합니다.
- 직각 Ø1/2"를 Ø6mm 포스트 클램프(C3)에 포스트(C2) 및 미니 시리즈 광학 포스트(C4)로 조립합니다.
- 광학 포스트(C4)의 세트크루를 사용하여 작은 V 클램프(C5)를 튜브 홀더로 연결합니다.
- 원심분리기 튜브를 튜브 홀더에 넣고 각도를 조정하여 수직으로 만듭니다. 튜브의 위치를 표시하고 튜브를 지원하기 위해 기본 브레드 보드 (C1)에 받침대 포스트 홀더 (C6)를 장착합니다.
- 브레드보드(A1)의 반대편에는 Ø12.7mm 알루미늄 포스트(D1)의 세트크루를 사용하여 직각 Ø1/2"를 Ø6 mm 포스트 클램프(D2)에 사용하여 미니 시리즈 광학 포스트(D3)를 연결합니다.
- 미니어처 V 클램프(D4)를 무딘 엔드 바늘(D5)과 연결하여 포스트(D3)에 연결합니다. 클램프의 각도를 조정하여 바늘을 수직으로 설정하고, 바늘이 원심분리기 튜브를 충족하는지 확인하기 위해 포스트 의 길이를 조정한다.
- 액추에이터(B1)를 스테퍼 모터 드라이버(E1)에 연결하고 UNO 스타터 키트(E2)의 UNO R3 컨트롤러 보드및 조이스틱 모듈을 사용하여 액추에이터를 제어합니다. 전원 어댑터(예: 9-24 V AC/DC 조절 가능 전원 어댑터)를 사용하여 모터를 별도로 구동할 수 있습니다.
- 그라데이션 메이킹 스테이션 옆에 주사기 펌프(F)를 놓고 주사기를 바늘과 연결합니다.
- 조이스틱을 사용하여 튜브 홀더 스테이지를 위아래로 제어합니다.
| 구성 요소 | 항목 |
| B1 | 선형 단계 액추에이터 |
| E1 | 스테퍼 모터 드라이버 |
| E2 | UNO 프로젝트 슈퍼 스타터 키트 |
| A1 | 브레드보드 |
| A2 | 수직 브래킷 |
| B2 | 슬림한 직각 브래킷 |
| C1 | 미니 시리즈 브레드보드 |
| C5 | 소형 V 클램프 |
| D4 | 미니어처 V 클램프 |
| C2 | Ø12.7 mm 알루미늄 포스트 |
| C4, D3 | 미니 시리즈 광학 포스트 |
| D1 | Ø12.7 mm 알루미늄 포스트 |
| C3, D2 | 직각 Ø1/2"~ Ø6 mm 포스트 클램프 |
| C6 | 미니 시리즈 받침대 포스트 홀더 베이스 |
| D5 | 무딘 엔드 바늘 |
| F | 주사기 펌프 |
표 3: 그라데이션 만들기 시스템 구성 요소.
10. 시스템 어셈블리를 분수 및 감지(그림 2).
- 일반 둥근 턱 버렛 클램프를 사용하여 튜브 피어서에 UV 모니터의 광학 모듈을 장착합니다. 튜브의 한쪽 끝(길이 1cm 및 0.56mm 내부 직경)을 튜브 피어서의 커넥터에 연결하고 다른 쪽 끝은 광학 모듈의 유체 인 포트에 부착합니다. 유체 아웃 포트를 분수기에 연결합니다.
- 제조 업체의 설명서에 따라 UV 모니터의 제어 장치와 광학 모듈을 연결합니다.
- 제조업체매뉴얼에 따르면 브레이크아웃 케이블을 사용하여 신호 출력 소켓을 지상의 디지털 컨버터및 아날로그 입력 연결에 연결합니다.
- 일반 USB 케이블을 사용하여 디지털 컨버터를 랩톱에 연결하고 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 변환된 디지털 신호를 기록합니다.