Method Article

Efficient and Scalable Generation of Human Ventral Midbrain Astrocytes from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

DOI:

10.3791/62095

⸱

October 2nd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 hiPSC에서 복부 중뇌 패턴의 성상세포를 재현 가능하게 생성하는 방법과 표현형 및 기능을 평가하기 위한 특성화를 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

파킨슨병의 경우, 복부 중뇌에 있는 도파민 뉴런의 진행성 기능 장애와 퇴행은 삶을 변화시키는 증상을 유발합니다. 신경 세포 변성은 성상세포에 의해 매개되는 비세포 자율 메커니즘을 포함하여 파킨슨병에서 다양한 원인을 가지고 있습니다. 중추신경계(CNS) 전반에 걸쳐 성상세포(astrocyte)는 신경 환경에서 대사 항상성을 유지하기 때문에 신경 세포의 생존과 기능에 필수적입니다. 성상교세포는 중추신경계의 면역 세포인 미세아교세포와 상호 작용하여 파킨슨병의 초기 단계부터 관찰되는 신경 염증을 조절하고 병리의 진행에 직접적인 영향을 미칩니다. 파킨슨병을 포함한 만성 신경염증성 요소가 있는 질병에서 성상세포는 신경독성 표현형을 획득하여 신경 퇴행을 향상시킵니다. 결과적으로, 성상세포는 질병을 늦추거나 멈추게 할 수 있는 잠재적인 치료 대상이지만, 이를 위해서는 파킨슨병에서 성상세포의 특성과 역할에 대한 더 깊은 이해가 필요합니다. 따라서 체외 연구를 위한 인간 복부 중뇌 성상세포의 정확한 모델이 시급히 필요합니다.

당사는 파킨슨병 연구에 사용할 수 있는 hiPSC로부터 복부 중뇌 특이적 성상세포(vmAstros)의 고순도 배양을 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. vmAstros는 여러 hiPSC 계통에서 일상적으로 생성될 수 있으며 특정 성상세포 및 복부 중뇌 마커를 발현합니다. 이 프로토콜은 확장 가능하므로 약물 스크리닝을 포함한 고처리량 응용 분야에 적합합니다. 결정적으로, hiPSC 파생-vmAstros는 in vivo 대응물의 전형적인 면역 조절 특성을 보여 파킨슨병의 신경염증 신호에 대한 기계론적 연구를 가능하게 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

파킨슨병은 65세 이상 인구의 2%-3%에 영향을 미치며 가장 흔한 신경퇴행성 운동 장애입니다1. 흑질은 흑질(substantia nigra) 내에 있는 복부 중뇌 도파민 뉴런의 퇴화로 인해 발생하며, 이로 인해 운동 기능이 쇠약해지는 증상이 나타나고 인지 및 정신 질환이 자주 발생한다2. 파킨슨병리학은 단백질, α-synuclein의 집합체에 의해 대표되는데, 이는 뉴런에 독성이 있고 기능 장애와 죽음을 초래합니다 1,2,3. 도파민 뉴런은 파킨슨병에서 퇴화하는 개체군이기 때문에 역사적으로 연구의 초점이었습니다. 그러나 뇌의 또 다른 세포 유형인 성상세포(astrocyte)도 파킨슨병에서 이상을 보이며, 파킨슨병 4,5,6,7 모델에서 퇴행에 기여하는 것으로 여겨집니다.

성상세포(astrocyte)는 필요에 따라 물리적으로나 기능적으로 변형될 수 있는 이질적인 세포 집단입니다. 그들은 신경 세포 신호의 조절, 시냅스 구조의 형성, 특정 인자의 분비를 통한 신경 세포 집단의 영양 지원을 포함한 다양한 메커니즘을 통해 신경 기능과 건강을 지원합니다 6,8,9,10. 그러나 성상세포는 또한 신경염증의 발달 및 전파에 필수적인 상당한 면역조절 역할을 합니다10,11. 신경염증은 파킨슨병 환자의 뇌에서 관찰되며, 최근에는 파킨슨병 증상 12,13,14,15의 발병을 미리 예방하는 것으로 밝혀져 파킨슨병 연구의 중심 무대를 차지하고 있습니다.

세포 수준에서 성상세포는 신경 보호를 촉진하기 위해 부상, 감염 또는 질병에 반응하여 반응하는 것으로 알려져 있습니다 9,6,10,16. 반응성은 유전자 발현, 분비체, 형태 및 세포 파편 및 독성 부산물의 제거 메커니즘의 변화를 특징으로 하는 성상세포 표현형의 변화를 설명합니다 9,10,11,17. 이러한 반응성 변화는 중추신경계의 면역 세포이자 부상 및 질병에 대한 첫 번째 반응자인 미세아교세포의 유도 신호에 대한 반응으로 발생한다9. 성상세포와 미세아교세포는 모두 자신의 기능을 조절하여 염증 신호에 반응하고 염증 신호를 전달하여 신경염증에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다 9,10. 그러나 파킨슨병의 만성적인 특성으로 인해 반응성 성상세포가 뉴런에 독성이 되고 스스로 퇴행 및 질병 병리를 촉진하는 전이가 발생합니다 6,9,10,18,19. 의미심장하게도, 성상세포가 반응성 신경독성 표현형으로 변형되는 것을 막는 것이 동물 모델에서 파킨슨병의 진행을 막는다는 것이 최근에 입증되었습니다11. 따라서 신경염증 패러다임에서 성상세포 반응성은 파킨슨병 연구의 주요 초점이 되었으며, 이와 유사하게 광범위한 중추신경계 질환과 관련이 있습니다. 이러한 발견은 파킨슨병의 병인학에 성상세포가 유의미하게 관여한다는 그림을 구축하며, 파킨슨병에 관여하는 인간 성상세포 집단의 표현형을 요약하는 정확한 연구 모델의 필요성을 강조합니다.

배아의 뇌에서는 뉴런이 먼저 나타나고, 성상교세포(astroglial lineage), 즉 성상세포(astrocyte)와 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)가 나타나며, 이는 발달 후반에 나타난다6. 생체 내 및 체외 연구는 신경 세포에서 성상 아교세포 유도체에 이르기까지 신경 전구 세포의 효능을 제어하는 것으로 보이는 여러 신호 전달 경로를 강조했습니다. 특히, JAK/STAT, EGF 및 BMP 신호전달은 성상아교세포의 증식, 분화 및 성숙에 중요한 역할을 합니다20,21. 이러한 경로는 hiPSC 6,22,23을 포함한 만능 세포에서 성상세포를 생성하기 위한 체외 프로토콜의 초점이었습니다. hiPSC 6,24,25에서 성상세포를 생성하는 성공적인 사례는 많이 있습니다. 그러나, 중추신경계(CNS)의 생체 내 성상세포(in vivo astrocyte)는 특화된 뉴런 이웃(neuronal neighbors)과 관련하여 성상세포의 특정 요구 사항에 따라 기능과 직접 관련된 특정 지역 정체성을 가지고 있음이 명백합니다 17,24,25,26. 예를 들어, 특히 복부 중뇌와 관련하여, 이 영역의 성상세포는 중뇌 도파민 뉴런의 국소 집단과 소통할 수 있게 하는 도파민 수용체를 포함하여 특정 단백질 세트를 발현한다는 것이 입증되었습니다26. 또한, 복부 중뇌 성상세포(ventral midbrain astrocyte)는 독특한 신호 전달 특성을 보여줍니다26. 따라서 파킨슨병에서 복부 중뇌 성상세포의 역할을 연구하기 위해서는 이들의 고유한 특성을 반영하는 체외 모델이 필요합니다.

이 문제를 해결하기 위해 우리는 hiPSC에서 복부 중뇌 성상세포(vmAstros)를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 그 결과 vmAstros는 면역조절 기능뿐만 아니라 특정 단백질의 발현과 같은 생체 내 복부 중뇌 대응물의 특성을 나타냅니다. 제시된 결과는 Tilo Kunath박사(27)가 유도하여 기증한 NAS2 및 AST23 hiPSC 계통의 분화에서 비롯된 것입니다. NAS2는 건강한 대조군에서 생성된 반면, AST23은 α-Synuclein(SNCA)을 인코딩하는 유전자좌에서 삼중을 가진 파킨슨병 환자에서 유래되었습니다. 이러한 hiPSC 계열주는 이전에 특성화되어 다양한 신경 세포 유형의 생성을 포함하여 발표된 여러 연구 논문에서 사용되었습니다 27,28,29,30,31.

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Protocol

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1. 인간 hiPSC 라인 해동, 유지 보수 및 냉동 보존

  1. hiPSC 배양 플레이트를 코팅하기 위해 10cm2 세포 배양 플레이트 표면적당 1mL의 PBS에서 비트로넥틴을 5μg/mL(1:100)로 희석합니다. 실온에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
  2. 비트로넥틴을 제거하고 즉시 배양 플레이트에 hiPSC/배지를 첨가합니다.
    참고 플레이트에서 비트로넥틴을 제거할 때 배양 표면이 건조되지 않도록 하는 것이 중요합니다.
  3. hiPSC를 해동하려면 액체 질소에서 hiPSC가 포함된 냉동 용액을 제거하고 내용물이 완전히 해동될 때까지 37°C 수조에 넣습니다.
  4. 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 포함하는 9mL의 예열된 세포 배양 배지(예: E8 또는 E8 Flex)를 준비합니다. cryovial의 내용물에 1mL를 적가합니다. 나머지 8mL 매체를 15mL 원심분리 튜브에 넣고 여기에 희석된 냉동 용기 내용물을 추가합니다.
    주의: 내용물을 분해하지 마십시오.
  5. 150 x g 에서 3분 동안 원심분리기 세포 펠릿을 방해하지 않고 액체를 흡입하고 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 함유한 적절한 부피의 세포 배양 배지(예: E8 또는 E8 Flex)에 재현탁합니다. 예를 들어, 6웰 플레이트의 웰당 2mL입니다.
  6. 재현탁된 hiPSC를 비트로넥틴 코팅 접시에 넣고 37 °C/5% CO2 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: hiPSC는 해동 후 30분-2시간 이내에 비트로넥틴 코팅 플라스틱 용기에 부착되기 시작해야 합니다.
  7. 세포 배양 배지(예: E8 또는 E8 Flex)에서 hiPSC를 유지합니다. 미디어 교환을 통해 매일 세포를 공급합니다. 먹이기 전에 항상 30분 동안 배양 배지를 예열하십시오.
    참고: E8 Flex를 사용하는 경우 hiPSC는 24시간마다 미디어를 교체할 필요가 없으며 필요한 경우 공급 증가를 48시간까지 확장할 수 있습니다. E8 Flex 또는 E8 배지는 동일한 품질의 hiPSC 배양을 제공합니다. HiPSC는 해동 후 최소 14일 동안, 그리고 분화 단계를 시작하기 전에 배양해야 합니다. 14일 미만의 배양 기간은 초기 분화 기간 동안 hiPSC의 생존에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보입니다. 약 80% 포화도에서 계대 hiPSCs(그림 1A: 3-4일 계승 간격).
  8. 시작 1시간 전에 hiPSC 배양액에 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 추가합니다.
  9. PBS(칼슘 또는 마그네슘 없음)로 hiPSC를 한 번 세척하고 0.5mM EDTA(칼슘 또는 마그네슘 없이 PBS의 재고에서 희석)를 추가합니다.
  10. 실온에서 5분 동안 또는 hiPSC가 서로 분리되어 더 둥근 모양을 띠기 시작하고 명시야 현미경에서 각 iPSC의 경계가 더 밝게 나타날 때까지 배양합니다.
  11. 피펫을 사용하여 hiPSC의 집중된 부위에 200μL EDTA를 추가합니다. 쉽게 분리되어 세포층에 빈 공간이 생기면 수확할 준비가 된 것입니다. 쉽게 분리되지 않으면 EDTA에 그대로 두고 1분 후에 반복합니다.
  12. 진행할 준비가 되면 EDTA를 부드럽게 제거하고 피펫을 사용하여 세포 배양 배지(예: E8 또는 E8 Flex)로 hiPSC를 두 번 부드럽게 세척합니다.
    참고: hiPSC가 분리되지 않도록 하려면 플레이트를 기울이고 배양 플레이트 측면 아래로 배지를 드롭으로 추가합니다.
  13. hiPSC를 채취하려면 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 함유한 1mL 세포 배양 배지(예: E8 또는 E8 Flex)를 사용합니다. 배지를 hiPSC 층에 직접 방출하면 세포가 분리됩니다. 필요한 경우 다른 1mL 배지로 반복합니다.
  14. 현미경으로 hiPSC를 봅니다. 이상적으로는, hiPSC는 그림 1B와 같이 비교적 균일한 군집으로 나타나야 한다. hiPSC 클러스터가 훨씬 더 크거나 크기가 매우 가변적인 경우 피펫을 사용하여 더 큰 hiPSC 클러스터를 분해합니다(그림 1B).
    참고: hiPSC를 과도하게 투여하지 마십시오. 이 보충제는 전체 세포 생존을 증가시키지만, 과도한 분쇄는 hiPSC 배양의 생존에 부정적인 영향을 미칩니다. 피펫으로 1-4회 통과하는 것이 좋습니다.
  15. 혈청학적 피펫을 사용하여 1.1단계에서 준비한 대로 hiPSC 현탁액을 비트로넥틴 코팅된 플레이트로 옮깁니다. hiPSC 배양을 37°C/5% CO2 인큐베이터로 되돌립니다.
    참고: hiPSC를 약 80% 포화도에서 동결 보존합니다.
  16. 시작 1시간 전에 hiPSC 배양액에 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 추가합니다.
  17. 1.4단계에서 설명한 대로 0.5mM EDTA를 사용하여 배양 플레이트에서 hiPSC를 분리하고, 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 함유한 세포 배양 배지(예: E8 또는 E8 Flex)에서 세포를 수집합니다. 150 x g에서 3분 동안 원심분리기
  18. 세포 동결 배지에서 펠릿화된 hiPSC를 재현탁합니다( Table of Materials(재료표 참조). 10cm2 배양 면적당 700μL를 사용하며, 이는 6웰 플레이트의 웰당 세포 1척 저온에 해당합니다.
  19. cryovials를 적절한 세포 동결 용기로 옮깁니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
  20. 냉동 용기를 -80°C 냉동고에 24시간 동안 옮깁니다. 24시간 후 극저온은 장기 보관을 위해 액체 질소(-196°C)로 전환될 수 있습니다.

2. vmAstro 차별화 프로토콜

참고: vmAstros 차별화 프로토콜의 개략도는 그림 1A에 나와 있습니다. 프로토콜에 필요한 시약과 그 준비에 대한 자세한 목록은 표 1에 나와 있습니다.

  1. vmNPC 유도
    참고: 이 프로토콜은 hiPSCs 70%-80% 포화도의 6-well 플레이트(10cm2)의 최소 1x well로 시작하도록 최적화되었으며, 이는 약 4-5 x 104 cells/cm2 입니다(그림 1B)30. 시작 세포 수와 밀도는 생존 및 분화 효율에 큰 영향을 미치므로 각 hiPSC 라인에 대해 최적화해야 합니다.
    1. hiPSC에서 세포 배양 배지를 제거하고 DMEM/F12 + 글루타맥스로 3배 세척합니다. 배지를 2mL vmNPC 유도 배지(N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189로 교체합니다. 배지 및 시약 준비에 대한 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.
    2. 24시간 후에 절반의 배지를 교체하고 48시간에 전체 미디어를 교체하여 격일로 먹이를 줍니다.
      참고: 3-4일 후에 vmNPC 배양은 패시징이 필요합니다. 1:3 또는 1:4의 표준 통과 비율이 권장되며, 이는 사용되는 각 hiPSC 라인에 맞게 최적화되어야 합니다.
    3. 계대 태양 1 시간 전에 vmNPC에 1x 세포 보충제 (예 : Revitacell)를 첨가하고 1x 기저 막 매트릭스 (예 : Geltrex) 코팅 조직 배양 플라스틱을 준비합니다 (섹션 2.2 기저막 매트릭스 및 코팅 조직 배양 플라스틱 준비).
    4. vmNPC에서 미디어를 제거하고 D-PBS로 2x 세척합니다. 10cm2 배양 면적당 1mL의 예열된 세포 분리 용액(예: Accutase)을 추가합니다(6웰 플레이트의 웰당 1mL).
    5. 37°C에서 1분 동안 배치한 다음 위상차 현미경을 사용하여 vmNPC를 검사합니다.
      참고: vmNPC가 반올림되기 시작하고, 프로세스가 다시 수축되며, 셀 레이어에 갭이 나타납니다. 이것은 세포 밀도에 따라 1-3 분 정도 걸릴 수 있습니다.
    6. vmNPC가 이러한 모습을 보일 때, vmNPC의 층에 100μL의 세포 분리 용액(예: Accutase)을 첨가합니다.
      참고: vmNPC를 분리할 준비가 되면 셀 계층에 구멍이 나타납니다. 이것이 발생하지 않으면 vmNPC는 세포 분리 솔루션으로 추가 배양이 필요합니다.
    7. vmNPC가 쉽게 분리되면 세포 분리 용액을 부드럽게 제거하고 N2B27 배지로 vmNPC를 2x 세척합니다. N2B27 배지를 웰 또는 배양 용기 측면에 부드럽게 추가하고 부드럽게 소용돌이쳐 세척하여 vmNPC가 분리되지 않도록 합니다.
      참고: vmNPC가 셀 표면에 다시 연결되지 않도록 하려면 이 단계를 신속하게 완료해야 합니다. 세척 단계에서 vmNPC가 분리되기 시작하면 150 x g 에서 3분 동안 원심분리를 통해 수집합니다. vmNPC는 생존을 감소시킬 수 있으므로 계양시 표준으로 원심분리되지 않습니다.
    8. 마지막으로, 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 포함하는 vmNPC 유도 배지를 세포층으로 직접 격렬하게 배출하여 피펫을 사용하여 vmNPC를 제거합니다. 이렇게 하면 vmNPC가 제거되며, 이는 새로운 매트릭스 코팅된 코팅 배양 용기로 직접 전달될 수 있습니다.
      참고: 추가 세포를 제거하기 위해 이미 부유한 vmNPC가 포함된 배지를 재사용하면 과도한 분쇄가 발생하여 생존율이 감소할 수 있습니다.
    9. 37°C/5% CO2 인큐베이터로 교체하십시오. vmNPC는 20-30분 후에 매트릭스 코팅 표면에 부착되기 시작해야 합니다. 24시간 후 배지의 절반을 새로운 vmNPC 유도 배지(세포 보충제 제외)로 교체하고 이전과 같이 공급 일정을 계속합니다.
    10. 10일 동안 먹이와 패시에이징 요법을 계속하십시오.
  2. 기저막 매트릭스 준비 및 코팅 조직 배양 플라스틱
    참고: vmNPC를 유지하기 위해 1x 기저막 매트릭스(예: Geltrex)가 플라스틱 용기를 코팅하는 데 사용됩니다. vmAPC 또는 vmAstros를 유지하기 위해 0.25x 기저막 매트릭스를 사용할 수 있습니다.
    1. -80°C 냉동고에서 지하실 멤브레인 매트릭스 스톡을 제거하고 4°C 냉장고에 밤새 넣어 해동합니다.
    2. 얼음처럼 차가운 DMEM/F12 + 글루타맥스, 분취량으로 1:10을 희석하고 -80°C에서 10배 재고로 보관합니다.
    3. 플라스틱 제품을 코팅할 때 이 10x 스톡을 얼음처럼 차가운 DMEM/F12 + glutamax로 1x(vmNPC의 경우) 또는 0.25x(vmAPC 또는 vmAstros의 경우)로 희석합니다.
    4. 10cm2당 1mL, 예를 들어 6웰 플레이트의 웰당 1mL로 조직 배양 플라스틱에 즉시 첨가합니다.
    5. 37°C에서 1시간 동안 둡니다. 코팅된 플라스틱 용기가 마르지 않도록 매체/셀을 추가할 준비가 될 때까지 기저 멤브레인 매트릭스 용액을 플라스틱 용기에서 제거해서는 안 됩니다. 매트릭스 코팅 플레이트는 세포를 추가하기 전에 세척할 필요가 없습니다.
  3. vmNPC의 확장
    1. 프로토콜 10일차에 인덕션 미디어를 vmNPC 확장 미디어(N2B27 + GDNF + BDNF + 아스코르브산)로 교체합니다. 배지 및 시약 준비에 대한 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.
      참고: vmNPC는 증식을 유도하기 위해 미토겐을 추가할 필요가 없습니다. BDNF, GDNF 및 아스코르브산은 vmNPC의 생존 및 유지를 지원합니다30.
    2. 24시간 후에 절반의 배지를 교체하고 48시간에 전체 미디어를 교체하여 격일로 먹이를 줍니다.
      참고: 3-4일 후에 vmNPC 배양에는 패시징이 필요합니다. 계대측정의 경우, 1:3 또는 1:4의 표준 계대측정 비율이 권장됩니다(이는 사용되는 각 hiPSC 라인에 맞게 최적화되어야 합니다). vmNPC의 생존, 증식 및 생성이 가장 잘 되는 비율을 결정합니다).
    3. 계대 배양 1 시간 전에 vmNPC에 1x 세포 보충제 (예 : Revitacell)를 추가하고 1x 매트릭스 코팅 플레이트 / 플라스크를 미리 준비합니다 (섹션 2.2 기저막 매트릭스 및 코팅 조직 배양 플라스틱 준비). 세포 분리 용액(예: Accutase)을 37°C로 예열합니다. 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 포함하는 새로운 vmNPC 확장 배지를 예열합니다.
    4. vmNPC에서 미디어를 제거하고 D-PBS로 2x 세척합니다. 10cm2 배양 면적당 1mL 세포 분리 용액(예: Accutase)을 추가합니다(6웰 플레이트의 웰당 1mL). 37°C에서 1분 동안 배치한 다음 위상차 현미경을 사용하여 vmNPC를 검사합니다.
      참고: vmNPC가 반올림되기 시작하고, 프로세스가 다시 수축되며, 셀 레이어에 갭이 나타납니다. 이것은 세포 밀도에 따라 1-3 분이 소요될 수 있습니다.
    5. vmNPC가 둥근 모양을 띠면 vmNPC 층에 100μL의 세포 분리 용액(예: Accutase)을 추가합니다.
      참고: vmNPC를 분리할 준비가 되면 셀 계층에 구멍이 나타납니다. 이것이 발생하지 않으면 vmNPC는 세포 분리 솔루션을 사용하여 추가 배양이 필요합니다.
    6. vmNPC가 쉽게 분리되면 세포 분리 용액을 부드럽게 제거하고 N2B27 배지로 vmNPC를 2x 세척합니다. N2B27 배지를 웰 또는 배양 용기 측면에 부드럽게 추가하고 부드럽게 소용돌이쳐 세척하여 vmNPC가 분리되지 않도록 합니다.
      참고: 세척 단계에서 vmNPC가 대량으로 분리되기 시작하면 150 x g 에서 3분 동안 원심분리를 통해 수집합니다. vmNPC는 생존을 감소시킬 수 있으므로 계대성 배양 시 표준으로 원심분리되지 않습니다. vmNPC가 셀 표면에 다시 연결되지 않도록 하려면 이 단계를 신속하게 완료해야 합니다.
    7. 피펫을 사용하여 vmNPC를 제거하고 1x 세포 보충제(예: Revitacell)가 포함된 vmNPC 확장 배지를 세포층으로 직접 격렬하게 배출합니다. 이렇게 하면 vmNPC가 제거되어 사전 준비된 매트릭스 코팅 플레이트/플라스크로 직접 이동할 수 있습니다(섹션 2.2 '기저막 매트릭스 준비 및 코팅 조직 배양 플라스틱' 참조).
      참고: 추가 세포를 제거하기 위해 이미 부유한 vmNPC가 포함된 배지를 재사용하면 과도한 분쇄가 발생하여 생존율이 감소할 수 있습니다.
    8. 37°C/5% CO2 인큐베이터로 교체하십시오. vmNPC는 20-30분 후에 매트릭스 코팅 표면에 부착되기 시작해야 합니다. 24시간 후 배양 배지의 절반을 새로운 vmNPC 확장 배지(세포 보충제 없음)로 교체하고 이전 공급 일정을 계속합니다.
    9. 10일 동안 먹이를 주고 전달하는 이 요법을 계속하십시오. vmNPC는 최대 50일까지 확장할 수 있습니다.
  4. vmAPC의 차별화 및 확장
    참고: vmNPC는 초기 hiPSC 단계로부터 30일에서 50일 사이에 vmAPC/vmAstros 생성에 성공적으로 사용할 수 있습니다(그림 1A).
    1. confluent vmNPC 배양을 수행하고 고급 DMEM/F12에서 vmNPC를 3번 세척하여 vmNPC 확장 미디어의 구성 요소 흔적을 제거합니다. 미디어를 vmAPC 확장 미디어(ASTRO 미디어 +EGF +LIF)로 교체합니다. 배지 및 시약 준비에 대한 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.
    2. 72시간 경과 후 vmNPC 배양은 높은 비율(1:7.5)입니다. 예를 들어, vmNPC가 6웰 플레이트의 단일 웰에서 유지되었다고 가정하면 이제 1x 매트릭스로 코팅된 75cm2 플라스크(섹션 2.2 '기저막 매트릭스 준비 및 코팅 조직 배양 플라스틱'에 설명된 대로 코팅됨)로 배양해야 합니다. 섹션 2.3 'vmNPC의 확장'에서 vmNPC에 대해 설명된 대로 세포 분리 솔루션을 사용한 통과.
    3. 적절한 양의 vmAPC 확장 매체(75cm2 플라스크당 7.5-15mL 매체)에 vmNPC를 재현탁합니다. 3일마다 또는 세포의 필요에 따라 배지 교체를 완료합니다.
      참고: 이 시점부터 vmNPC는 vmAPC라고 하며 셀 클러스터가 아닌 단일 셀로 계대시되어야 합니다. vmAPC는 3-7일마다 또는 과도하게 합류하지 않도록 합류할 때 통과해야 합니다. 이 시점부터는 0.25x 매트릭스의 감소된 농도를 사용하여 플라스틱 제품을 코팅해야 합니다( 섹션 2.2 기저막 매트릭스 준비 및 조직 배양 플라스틱 코팅에 설명된 대로).
    4. vmAPC가 90일째(hiPSC 단계에서)에 도달할 때까지 확장하고, 확장의 다양한 지점에서 vmAPC를 극저온 보존합니다.
  5. vmAPC에서 성숙한 vmAstros 생성
    참고: 이 단계에서 vmAPC는 175cm2 조직 배양 플라스크에서 성장할 수 있습니다. 이것은 많은 수의 성숙한 vmAstros의 생성을 위해 확장될 수 있습니다.
    1. vmAPC가 80% 농도에 도달하면 ASTRO 매체로 3번 세척하고 vmAstros 성숙 매체(ASTRO 매체 +BMP4 +LIF. 배지 및 시약 준비에 대한 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.
    2. 3일마다 또는 세포가 필요로 하는 대로 10일 동안 완전한 배지 교체를 수행합니다.
      참고: a) 이 시점에서 특성화는 면역세포화학(그림 2G - I) 및 유전자 발현 분석(원고 준비 중)에 의해 확인된 바와 같이 vmAstros가 성숙했음을 나타냅니다. b) 숙성 직후에 사용된 vmAstros는 새로 준비된 매트릭스 코팅 표면에 다시 도금해야 합니다. 동일한 배양 표면에서 vmAPC 또는 vmAstros를 14일 이상 유지하면 세포의 크기가 줄어들고 심지어 분리되기 시작하는 최적이 아닌 배양으로 이어질 수 있습니다. c) 신경염증 조절을 검사하는 응용 프로그램의 경우, BMP 및 LIF는 신경염증 자극 72시간 전에 제거됩니다. 이는 BMP/LIF 신호와 유도된 신경염증 신호 사이의 잠재적인 상호 작용을 피하기 위한 것입니다.
    3. vmAstros는 이제 예를 들어 면역세포화학을 위한 커버슬립에 실험 분석을 위해 다시 플레이팅하거나 향후 응용 분야를 위해 동결 보존할 수 있습니다(섹션 3, 4).
      참고: 확산은 매우 낮은 속도에서만 발생해야 하므로 프로토콜의 이 단계에서는 통과가 필요하지 않습니다. 이 단계에서 너무 조밀하게 도금된 vmAPC는 더 높은 수준의 증식을 유지합니다. 이 경우, 그림 1F와 같이 밀도를 얻기 위해 세포를 계대와 분할하십시오.

3. vmNPC, vmAPC 및 vmAstros의 냉동 보존

참고: vmNPC/vmAPCs/vmAstros를 최대 컨플루언스로 크라이오보전합니다.

  1. 시작 1시간 전에 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 배양에 추가합니다. 실온에서 냉동 보관 용기( 재료 표 참조)를 이소프로판올로 채웁니다.
  2. 앞서 설명한 바와 같이 세포 분리 용액을 사용하여 배양 플레이트에서 세포를 분리하고 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 포함하는 적절한 배지(N2B27 또는 ASTRO 배지)에서 세포를 수집합니다. 150 x g 에서 3분 동안 원심분리기
  3. 다음과 같이 펠릿화된 vmNPC/vmAPCs/vmAstros를 세포 동결 매체( 재료 표 참조) 볼륨에 재현탁합니다(3.3.1. - 3.3.3 단계).
    1. vmNPC의 경우: 10cm2 배양 면적당 700μL를 1 극저온에 사용합니다.
    2. vmAPC의 경우:60cm2 배양 면적당 700μL를 1개의 극저온(T175 배양 플라스크의 약 1/3)에 사용합니다.
    3. vmAstros의 경우: 2mL의 미디어에 다시 현탁하고 vmAstros 수를 계산합니다. 세포 동결 배지( Table of Materials)에서 향후 응용 분야에 적합한 냉동 장치당 개수로 재원심분리 및 재현탁합니다. 동결-해동으로 인한 세포 손실이 대략 15%라고 가정하면, 새로 해동된 vmAstros는 동결-해동 과정에서 세포 사멸을 보상하기 위해 15%의 초과 세포 수로 계산되고 도금됩니다. 따라서 이는 cm2당 74,750 vmAstros에 해당합니다. 해동된 vmAstros는 분석 전에 ASTRO 매체에서 72시간 동안 유지됩니다.
  4. cryovials를 cell freezing vessel(자세한 내용은 재료 표 참조)로 옮기고 cryzing vessel을 -80°C 냉동고에 24시간 동안 옮깁니다. 24시간 후 극저온은 장기 보관을 위해 액체 질소(-196°C)로 전환될 수 있습니다.

4. vmAstro 표현형의 특성화

  1. 면역세포화학(Immunocytochemistry)
    1. 100-200 13mm 유리 커버 슬립을 유리 페트리 접시에 넣고 여과지 층 위에 놓고 건조한 오토클레이브에서 살균합니다.
    2. 멸균 집게를 사용하여 커버슬립을 4웰 또는 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 커버슬립에 1x 매트릭스 용액(예: Geltrex)을 50μL 액적으로 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    3. vmAstros를 통과 또는 해동하고 ASTRO 미디어에서 다시 중단하고 카운트를 수행합니다. 50 μL 액적에서 커버슬립당 25-100,000개의 세포로 vmAstros 플레이트.
    4. 커버슬립에서 매트릭스를 제거하고 즉시 미디어 방울에 vmAstros를 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배치한 다음 250μL ASTRO 매체를 추가로 웰에 주입합니다.
      참고: 성상세포와 중뇌 마커 발현을 간단히 확인하기 위해 면역세포화학을 수행하는 경우, vmAstros는 도금 후 24시간 후에 고정할 수 있습니다.
    5. D-PBS에 36% 포름알데히드 용액을 1:9로 희석하여 4% 포름알데히드 용액을 준비합니다.
    6. D-PBS로 vmAstros 1x 세척. 즉시 웰에 4% 포름알데히드를 첨가하고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.
    7. 포름알데히드를 제거하고 D-PBS로 교체하십시오. 4°C에서 보관하거나 면역세포화학을 진행하십시오.
    8. D-PBS로 우물에서 커버슬립을 3번 세척합니다. 실온에서 1시간 동안 0.1% PBTx(D-PBS + 1:1000 Triton-X)에 10% 염소 혈청, 1% BSA를 투과 및 차단합니다.
    9. 1% 염소 혈청에 1차 항체(Table of Materials)를 추가하고, 0.1% PBTx(D-PBS + 1:1000 Triton-X)에 0.1% BSA를 첨가하고 로커에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    10. 다음 날, 1차 항체를 제거하고 D-PBS로 커버슬립을 3번 세척합니다.
    11. 염소 혈청 1%에 적절한 2차 항체(Table of Materials)를 첨가하고, 0.1% PBTx에 0.1% BSA를 첨가하고, 실온에서 1-2시간 동안 배양하여 로커의 빛으로부터 보호합니다. D-PBS로 커버슬립을 3번 세척합니다.
    12. DAPI 용액(D-PBS의 경우 0.1μg/mL DAPI)을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. D-PBS로 커버슬립을 3번 세척합니다.
    13. 커버슬립을 장착하려면 5μL 방울의 Mowiol/DABCO 장착 매체[12% Mowiol(w/v), 12% 글리세롤(w/v)을 0.2M Tris(pH 8.5)에서 25mg/mL 1,4-디아자비실로[2.2.2]옥탄가(DABCO)]와 함께 하룻밤 동안 교반합니다. 집게를 사용하여 우물에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하십시오. 티슈의 커버슬립 가장자리를 두드려 여분의 액체를 제거하고 vmAstros 쪽을 아래로 향하게 하여 Mowiol/DABCO 방울에 놓습니다.
    14. 각 커버슬립에 대해 반복하고 현미경 검사 전에 8시간 동안 건조시킵니다.
  2. 사이토카인 처리에 대한 vmAstros IL-6 분비의 ELISA 측정
    참고: BMP4 및 LIF를 사용한 10일 숙성 후 vmAstros는 0.25x 매트릭스 코팅 조직 배양 플라스틱 용기에 계파, 계수 및 도금해야 합니다( 섹션 2.2기저막 매트릭스 준비 및 코팅 조직 배양 플라스틱), cm당 65,000 vmAstros의 밀도2 ASTRO 미디어에서. BMP4 및 LIF는 사이토카인 치료의 효능을 방해할 수 있으므로 사이토카인 치료 72시간 전에 vmAstros에서 제거해야 합니다. 또는 동결 보존된 vmAstros를 해동하여 분석에 사용할 수 있습니다.
    1. 분석 당일, vmAstros 3x를 비산화환원 배지(DMEM/F-12 + glutamax + N2)로 부드럽게 세척합니다.
    2. 비교를 위해 처리되지 않은 대조군과 사이토카인 처리된 웰을 사용하십시오. 선택한 사이토카인을 최적화된 농도로 첨가합니다. 그림 2J - L의 데이터는 10cm2 세포 배양 면적당 1mL의 비산화환원 배지에서 3ng/mL9의 IL-1α를 사용하여 생성되었습니다.
    3. vmAstros를 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 교체합니다. 24시간 후 배양 배지를 멸균 마이크로분리 튜브에 수집합니다.
    4. ELISA를 즉시 수행하지 않을 경우 마이크로분리 튜브를 액체 질소에 담가 매체 샘플을 스냅 동결하고 향후 분석을 위해 -80°C에서 보관하십시오.
      참고: 다음 프로토콜은 재료 표에 자세히 설명된 IL-6 ELISA 키트와 함께 사용하도록 특별히 최적화되었습니다. 새로운 ELISA 키트에 동결건조 분말로 제공된 항체 및 표준물질은 처음 사용하기 전에 재구성하고 향후 사용을 위해 분주해야 합니다. 키트와 함께 제공된 데이터 시트에는 재구성에 필요한 시약과 부피가 자세히 설명되어 있습니다. 포획 항체는 PBS(운반체 단백질 없음)에서 재구성되어야 합니다.
    5. 96웰 플레이트 형식으로 ELISA를 수행하고 사용된 웰에 따라 시약의 부피를 계산합니다. ELISA 당일, PBS에 stock 1:120을 희석하여 capture antibody를 준비합니다. 웰당 50μL의 포획 항체를 로딩하여 플레이트를 코팅합니다. 접착 스트립으로 플레이트를 덮고 실온에서 밤새 배양합니다.
    6. 다음 날, D-PBS-Tween(D-PBS with 0.05% Tween-20), 웰당 100μL로 플레이트를 3회 세척합니다. 블롯 건조.
    7. 웰당 150 μL D-PBS/1% BSA를 적재하여 플레이트를 막습니다. 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 설명된 대로 플레이트를 세척하십시오.
    8. 얼음에서 샘플을 해동합니다(1-2시간이 소요될 수 있음). 10 μL 샘플과 40 μL D-PBS/1% BSA를 로드하여 샘플을 1:5로 희석합니다. 적재 전에 모든 샘플을 소용돌이치십시오.
      참고: IL-6 ELISA를 수행할 때 샘플을 희석해야 하며 희석을 최적화해야 합니다.
    9. D-PBS/1% BSA에 원료를 1:180으로 희석하여 최고 표준물질(1,000 ρg/mL)을 준비합니다. 최고 표준의 연속 희석을 수행하여 7 가지 표준을 준비합니다. 각 희석 사이의 와류.
    10. 50μL의 표준물질/샘플을 웰에 추가합니다. D-PBS/1% BSA를 블랭크로 사용합니다. 희석된 샘플을 적절하게 혼합하기 위해 오비탈 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 설명된 대로 플레이트를 세척하십시오.
    11. D-PBS/1% BSA에 원료를 1:60으로 희석하여 검출 항체를 준비합니다. 웰당 50μL의 검출 항체를 로드합니다. 플레이트를 덮고 RT에서 2시간 동안 배양합니다. 설명된 대로 플레이트를 세척하십시오.
    12. D-PBS/1% BSA에서 스톡 1:40을 희석하여 양고추냉이 과산화효소(Strep-HRP)에 접합된 스트렙타비딘을 준비합니다. 웰당 50μL Strep-HRP를 로드하고 어두운 곳에서 20분 동안 실온에서 배양합니다. 설명된 대로 플레이트를 세척하십시오.
    13. 웰당 50μL TMB 기질 용액을 로딩하여 색상 반응을 시작합니다. 실온에서 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다(또는 표준물질과 샘플이 파란색으로 변할 때까지).
      알림: TMB는 4°C에서 보관되지만 실온에서 사용해야 합니다.
    14. 웰당 25μL 정지 용액(1 M H2SO4)을 첨가하여 반응을 중지하고 파란색에서 노란색으로 색상 변화를 확인합니다.
    15. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm 흡광도에서 플레이트를 판독합니다. 파장 보정을 540nm 흡광도로 설정하여 정확도를 최대화합니다. 생성된 표준 곡선에서 샘플의 단백질 농도를 계산합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

차별화 방법론 및 진행 상황
여기에서는 vmAstros 생성에 사용된 방법과 후속 표현형 특성화에 사용된 프로토콜에 대한 세부 정보를 제시합니다. vmAstros의 생성 방법은 현미경으로 모니터링하고 뚜렷한 형태학적 특성을 식별할 수 있는 몇 가지 뚜렷한 분화 단계로 구성됩니다(그림 1A-F). 피더가 없는 hiPSC 배양물(그림 1B)은 신경 계통(LDN193189, SB431542), 특히 복부 중뇌(CHIR99021, SHH-C24ii)로 분화를 유도하기 위해 특정 요인에 노출됩니다. 그 결과 형태학적으로 hiPSC와 구별되는 vmNPC의 배양이 생성되며, vmNPC는 hiPSC보다 덜 둥글고 vmNPC는 신경 전구 세포의 전형적인 길쭉한 다각형 또는 삼각형 모양을 갖습니다(그림 1B<...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hiPSC에서 vmAstros를 생성하는 이 방법은 매우 효율적이며, vmAstros의 순수 배양을 생성하고, 다른 hiPSC 라인에서 vmAstros를 생성할 때 재현할 수 있습니다. 이 프로토콜은 발달 중인 중뇌를 올바르게 패턴화하고 성상세포를 생성하는 데 필요한 배아에서 필요한 발달 이벤트의 요약을 중심으로 개발되었으며 1) vmNPC를 생성하기 위한 신경 복부 중뇌 유도, 2) vmAPC의 생성 및 확장, 마지막으로 3) vmAstros의 성숙.

이전에 발표된 연구에서 우리는 복부 중뇌 마커의 최적 발현을 보장하기 위해 vmNPC를 생성하는 데 사용되는 각 hiPSC 라인에 대해 CHIR99021 및 SHH(C24ii)의 농도를 최적화하는 것의 중요성을 강조했습니다30,31; 200ng/mL SHH(C24ii...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 파킨슨병 영국 프로젝트 보조금(G-1402)과 학생의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 작업에 대한 지원과 도움을 준 Wolfson Bioimaging Facility에 감사를 표합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)n/a/aTris 베이스와 플러스 HCl
0.5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 D-PBS에서 0.5 mM 최종 
1,4-디아자비실로[2.2.2]옥탄가(DABCO)시그마D27802-  25 mg/mL in Mowiol mounting solution
13 mm coverslipsVWR631-0149
2-Mercaptoethanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher126340101x NEAA가 있지만 최종 농도 2x (0.2 mM)
Ascorbic acidSigmaA5960에 추가됩니다.200 mM 재고, 1:1000 to 200 µ M final
B27 SupplementThermoFisher17504-04450x stock
BSASigma5470
Cell freezing mediaSigmaC2874Cryostor CS10
Cell freezing vesselNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860.8 mM stock, 1:1000 dilution to 0.8 µ M 파이널
크라이오비알&nbsp; 시그마CLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL, 1:10,000 - 100ng/mL final (PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS(MG 또는 CA 없는 D-PBS)ThermoFisher14190144pH 7.2
E8 Flex medium kitThermoFisherA2858501
포름알데히드(36% 용액)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 또는 1:400 얼음처럼 차가운 DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 mM 스톡 (N2B27에서 1:200, ASTRO 매체에서 1:100 to 20 µ M 파이널) 
글리세롤시그마G5516
인간 BDNF  Peprotech450-0220 &마이크로; g/mL 스톡, 1:1000 - 20 ng/mL final
Human BMP4Peprotech120-0520 µ g/mL 스톡, 1:1000 - 20 ng/mL final
Human EGFPeprotechAF-100-1520 µ g/mL 스톡, 1:1000 - 20 ng/mL final
Human GDNFPeprotech450-1020 µ g/mL 재고, 1:1000 to 20 ng/mL final
Human insulin solutionSigma I927810 mg/mL 스톡, 1:2000 - 5 &마이크로; g/mL 최종
인간 LIFPeprotech300-0520 &마이크로; g/mL 재고, 1:1000에서 20 ng/mL 최종
IL-6 ELISA 키트BiotechneDY206
이소프로판올시그마  I9516-4LMr Frosty 극저온 저장 용기 충전용
; M 재고, 1:10,000 희석에서 10 nM 최종
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 보충제ThermoFisher17502048100x 재고
NEAAThermoFisher1114003510 mM 재고, 1:100 to 0.1 mM 최종 
Neurobasal 매체ThermoFisher21103049
Normal Goat serumVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x stock, 1:100 to 1x final
SB431542Tocris161410 mM stock, 1:1000 dilution to 10 µ M 최종
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 &마이크로; g/mL 재고, 1:1000 to 200 ng/mL final
Tris-HClSigma PHG0002 
트리톤-X시그마X100
트윈-20시그마 P7949
VitronectinThermoFisherA147001:50 in D-PBS
항체 면역세포화학  Company카탈로그 번호Host species
S100bSigmaSAB4200671항체; 1:200
FOXA2SCBTNB600501
LMX1AProSci7087; 1:300
LMX1AMilliporeAB10533; 1:2000
LMX1BProteintech18278-1-AP1:300
항체1:300
항체CD49f
Proteintech27189-1-AP에 대한 1; 1:100
MSI1Abcamab52865; 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit ThermoFisherA32731염소; 1:500
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스ThermoFisherA32723염소; 1:500
Alexa Fluor 568 염소 안티-토끼ThermoFisherA11036염소; 1:500
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스ThermoFisherA11031염소; 1:500
n로 구성에는 Sigma SML0559 100 µ LDN193189 Mouse에 대한 Mouse에 대한 항체; Rabbit에 대한 1:50 항체 Rabbit에 대한 항체 Rabbit에 대한 항체; GLAST Proteintech 20785-1-AP Rabbit에 대한 ; GFAP Dako Z0334 Rabbit에 대한 ; Rabbit:400 항체 Rabbit에 대한 항체

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