방법 논문

Efficient and Scalable Generation of Human Ventral Midbrain Astrocytes from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

DOI:

10.3791/62095

⸱

2021년 10월 2일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기에서는 hiPSC에서 복부 중뇌 패턴의 성상세포를 재현 가능하게 생성하는 방법과 표현형 및 기능을 평가하기 위한 특성화를 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

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파킨슨병의 경우, 복부 중뇌에 있는 도파민 뉴런의 진행성 기능 장애와 퇴행은 삶을 변화시키는 증상을 유발합니다. 신경 세포 변성은 성상세포에 의해 매개되는 비세포 자율 메커니즘을 포함하여 파킨슨병에서 다양한 원인을 가지고 있습니다. 중추신경계(CNS) 전반에 걸쳐 성상세포(astrocyte)는 신경 환경에서 대사 항상성을 유지하기 때문에 신경 세포의 생존과 기능에 필수적입니다. 성상교세포는 중추신경계의 면역 세포인 미세아교세포와 상호 작용하여 파킨슨병의 초기 단계부터 관찰되는 신경 염증을 조절하고 병리의 진행에 직접적인 영향을 미칩니다. 파킨슨병을 포함한 만성 신경염증성 요소가 있는 질병에서 성상세포는 신경독성 표현형을 획득하여 신경 퇴행을 향상시킵니다. 결과적으로, 성상세포는 질병을 늦추거나 멈추게 할 수 있는 잠재적인 치료 대상이지만, 이를 위해서는 파킨슨병에서 성상세포의 특성과 역할에 대한 더 깊은 이해가 필요합니다. 따라서 체외 연구를 위한 인간 복부 중뇌 성상세포의 정확한 모델이 시급히 필요합니다.

당사는 파킨슨병 연구에 사용할 수 있는 hiPSC로부터 복부 중뇌 특이적 성상세포(vmAstros)의 고순도 배양을 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. vmAstros는 여러 hiPSC 계통에서 일상적으로 생성될 수 있으며 특정 성상세포 및 복부 중뇌 마커를 발현합니다. 이 프로토콜은 확장 가능하므로 약물 스크리닝을 포함한 고처리량 응용 분야에 적합합니다. 결정적으로, hiPSC 파생-vmAstros는 in vivo 대응물의 전형적인 면역 조절 특성을 보여 파킨슨병의 신경염증 신호에 대한 기계론적 연구를 가능하게 합니다.

서론

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파킨슨병은 65세 이상 인구의 2%-3%에 영향을 미치며 가장 흔한 신경퇴행성 운동 장애입니다1. 흑질은 흑질(substantia nigra) 내에 있는 복부 중뇌 도파민 뉴런의 퇴화로 인해 발생하며, 이로 인해 운동 기능이 쇠약해지는 증상이 나타나고 인지 및 정신 질환이 자주 발생한다2. 파킨슨병리학은 단백질, α-synuclein의 집합체에 의해 대표되는데, 이는 뉴런에 독성이 있고 기능 장애와 죽음을 초래합니다 1,2,3. 도파민 뉴런은 파킨슨병에서 퇴화하는 개체군이기 때문에 역사적으로 연구의 초점이었습니다. 그러나 뇌의 또 다른 세포 유형인 성상세포(astrocyte)도 파킨슨병에서 이상을 보이며, 파킨슨병 4,5,6,7 모델에서 퇴행에 기여하는 것....

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프로토콜

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1. 인간 hiPSC 라인 해동, 유지 보수 및 냉동 보존

  1. hiPSC 배양 플레이트를 코팅하기 위해 10cm2 세포 배양 플레이트 표면적당 1mL의 PBS에서 비트로넥틴을 5μg/mL(1:100)로 희석합니다. 실온에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
  2. 비트로넥틴을 제거하고 즉시 배양 플레이트에 hiPSC/배지를 첨가합니다.
    참고 플레이트에서 비트로넥틴을 제거할 때 배양 표면이 건조되지 않도록 하는 것이 중요합니다.
  3. hiPSC를 해동하려면 액체 질소에서 hiPSC가 포함된 냉동 용액을 제거하고 내용물이 완전히 해동될 때까지 37°C 수조에 넣습니다.
  4. 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 포함하는 9mL의 예열된 세포 배양 배지(예: E8 또는 E8 Flex)를 준비합니다. cryovial의 내용물에 1mL를 적가합니다. 나머지 8mL 매체를 15mL 원심분리 튜브에 넣고 여기에 희석된 냉동 용기 내용물을 추가합니다.
    주의: 내용물을 분해하지 마십시오.
  5. 150 x g 에서 3분 동안 원심분리기 세포 펠릿을 방해하지 않고 액체를 흡입하고 1x 세포 보충제(예: Revitacell)를 함유한 적....

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결과

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차별화 방법론 및 진행 상황
여기에서는 vmAstros 생성에 사용된 방법과 후속 표현형 특성화에 사용된 프로토콜에 대한 세부 정보를 제시합니다. vmAstros의 생성 방법은 현미경으로 모니터링하고 뚜렷한 형태학적 특성을 식별할 수 있는 몇 가지 뚜렷한 분화 단계로 구성됩니다(그림 1A-F). 피더가 없는 hiPSC 배양물(그림 1B)은 신경 계통(LDN193189, SB431542), 특히 복부 중뇌(CHIR99021, SHH-C24ii)로 분화를 유도하기 위해 특정 요인에 노출됩니다. 그 결과 형태학적으로 hiPSC와 구별되는 vmNPC의 배양이 생성되며, vmNPC는 hiPSC보다 덜 둥글고 vmNPC는 신경 전구 세포의 전형적인 길쭉한 다각형 또는 삼각형 모양을 갖습니다(그림 1B<.......

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토론

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hiPSC에서 vmAstros를 생성하는 이 방법은 매우 효율적이며, vmAstros의 순수 배양을 생성하고, 다른 hiPSC 라인에서 vmAstros를 생성할 때 재현할 수 있습니다. 이 프로토콜은 발달 중인 중뇌를 올바르게 패턴화하고 성상세포를 생성하는 데 필요한 배아에서 필요한 발달 이벤트의 요약을 중심으로 개발되었으며 1) vmNPC를 생성하기 위한 신경 복부 중뇌 유도, 2) vmAPC의 생성 및 확장, 마지막으로 3) vmAstros의 성숙.

이전에 발표된 연구에서 우리는 복부 중뇌 마커의 최적 발현을 보장하기 위해 vmNPC를 생성하는 데 사용되는 각 hiPSC 라인에 대해 CHIR99021 및 SHH(C24ii)의 농도를 최적화하는 것의 중요성을 강조했습니다30,31; 200ng/mL SHH(C24ii.......

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 파킨슨병 영국 프로젝트 보조금(G-1402)과 학생의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 작업에 대한 지원과 도움을 준 Wolfson Bioimaging Facility에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)n/a/aTris 베이스와 플러스 HCl
0.5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 D-PBS에서 0.5 mM 최종 
1,4-디아자비실로[2.2.2]옥탄가(DABCO)시그마D27802-  25 mg/mL in Mowiol mounting solution
13 mm coverslipsVWR631-0149
2-Mercaptoethanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher126340101x NEAA가 있지만 최종 농도 2x (0.2 mM)
Ascorbic acidSigmaA5960에 추가됩니다.200 mM 재고, 1:1000 to 200 µ M final
B27 SupplementThermoFisher17504-04450x stock
BSASigma5470
Cell freezing mediaSigmaC2874Cryostor CS10
Cell freezing vesselNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860.8 mM stock, 1:1000 dilution to 0.8 µ M 파이널
크라이오비알&nbsp; 시그마CLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL, 1:10,000 - 100ng/mL final (PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS(MG 또는 CA 없는 D-PBS)ThermoFisher14190144pH 7.2
E8 Flex medium kitThermoFisherA2858501
포름알데히드(36% 용액)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 또는 1:400 얼음처럼 차가운 DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 mM 스톡 (N2B27에서 1:200, ASTRO 매체에서 1:100 to 20 µ M 파이널) 
글리세롤시그마G5516
인간 BDNF  Peprotech450-0220 &마이크로; g/mL 스톡, 1:1000 - 20 ng/mL final
Human BMP4Peprotech120-0520 µ g/mL 스톡, 1:1000 - 20 ng/mL final
Human EGFPeprotechAF-100-1520 µ g/mL 스톡, 1:1000 - 20 ng/mL final
Human GDNFPeprotech450-1020 µ g/mL 재고, 1:1000 to 20 ng/mL final
Human insulin solutionSigma I927810 mg/mL 스톡, 1:2000 - 5 &마이크로; g/mL 최종
인간 LIFPeprotech300-0520 &마이크로; g/mL 재고, 1:1000에서 20 ng/mL 최종
IL-6 ELISA 키트BiotechneDY206
이소프로판올시그마  I9516-4LMr Frosty 극저온 저장 용기 충전용
; M 재고, 1:10,000 희석에서 10 nM 최종
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 보충제ThermoFisher17502048100x 재고
NEAAThermoFisher1114003510 mM 재고, 1:100 to 0.1 mM 최종 
Neurobasal 매체ThermoFisher21103049
Normal Goat serumVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x stock, 1:100 to 1x final
SB431542Tocris161410 mM stock, 1:1000 dilution to 10 µ M 최종
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 &마이크로; g/mL 재고, 1:1000 to 200 ng/mL final
Tris-HClSigma PHG0002 
트리톤-X시그마X100
트윈-20시그마 P7949
VitronectinThermoFisherA147001:50 in D-PBS
항체 면역세포화학  Company카탈로그 번호Host species
S100bSigmaSAB4200671항체; 1:200
FOXA2SCBTNB600501
LMX1AProSci7087; 1:300
LMX1AMilliporeAB10533; 1:2000
LMX1BProteintech18278-1-AP1:300
항체1:300
항체CD49f
Proteintech27189-1-AP에 대한 1; 1:100
MSI1Abcamab52865; 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit ThermoFisherA32731염소; 1:500
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스ThermoFisherA32723염소; 1:500
Alexa Fluor 568 염소 안티-토끼ThermoFisherA11036염소; 1:500
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스ThermoFisherA11031염소; 1:500
n로 구성에는 Sigma SML0559 100 µ LDN193189 Mouse에 대한 Mouse에 대한 항체; Rabbit에 대한 1:50 항체 Rabbit에 대한 항체 Rabbit에 대한 항체; GLAST Proteintech 20785-1-AP Rabbit에 대한 ; GFAP Dako Z0334 Rabbit에 대한 ; Rabbit:400 항체 Rabbit에 대한 항체

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  2. Lees, A. J., Hardy, J., Revesz, T. Parkingson's disease. Lancet. 373, 2055-2066 (2009).
  3. Braak, H., et al.

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