Method Article

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

DOI:

10.3791/62097

⸱

March 21st, 2021

 ,  , 
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

Abstract

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폐는 멸균 (입자 또는 반응성 독소) 및 전염성 (세균성, 바이러스 또는 곰팡이) 염증 조건의 형태로 직접적이고 간접적인 모욕에 지속적으로 직면합니다. 압도적인 숙주 반응은 병리학적 숙주 면역, 응압 및 조직 리모델링 반응의 결과로 폐 호중구 모집을 특징으로 하는 손상된 호흡 및 급성 폐 손상을 초래할 수 있습니다. 소뇨폐 세포 적응을 시각화하고 정량화하는 민감한 현미경 방법은 저용량(0.05 ppm) 오존에 대응하여, TLR4 작용제인 세균성 리포폴리사카라이드와 함께 강력한 환경 오염물질로 숙주 염증 및 수리 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지-폐포라 라베지 액체, 폐 혈관 난투, 좌측 폐 극저섹션 및 흉골 골수 투과구의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다. 당사는 분석된 구획에서 이산 케모킨 그라데이션에 의해 표시되는 지연(최대 36-72h) 면역 반응과 상관되는 골수 세포뿐만 아니라 폐포성 대식세포의 손상을 보여줍니다. 또한 폐 세포 외 매트릭스 및 세포 세포 종편 상호 작용 (액틴, 튜룰린), 미토콘드리아 및 반응성 산소 종, 항 응고 성 플라스미노겐, 항 혈관 신생 펩타이드 단편 혈관 산기 세포 혈관, 미토콘드리아 ATP 시네시아 복합 V 서브 유닛, α 및 β 제시합니다. 이러한 대리 마커는 적절한 체외 세포 기반 분석술및 생체 내 미생물 현미경 검사법과 같은 생체 내 동물 이미징 기술로 보충될 때, 새로운 면역 조절제에 대한 폐 반응을 이해하는 쪽으로 중요한 정보를 제공할 수 있다.

Introduction

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급성 폐 손상(ALI)은 응고, 섬유성 및 선천성 면역 계통1의동시 활성화에 의해 표시되는 전염성 또는 기타 유해한 자극에 대한 폐의 중요한 병리학 반응이다. 호중구는 즉시 톨과 같은 수용체 (TLR) 패밀리2,3,4를통해 미생물 및 세포 내 손상 패턴을 감지합니다. Neutrophils는 그 때 부수적인 조직 손상을 일으키는 원인이 될 수 있는 미리 형성된 사이토카인 및 세포독성 과립 내용을 풀어 놓습니다. 이어지는 폐포 손상은 아데노신 삼위산염 (ATP)5와같은 분자의 방출로 이어지는 이차 세포 죽음으로 손상되어 면역 dysregulation의 악순환에서 설정됩니다.

ALI의 이해에 해결되지 않은 문제는 발포막 내에서 부상이 어떻게 시작되는지에 대한 문제와 관련이 있습니다. 전자 수송 복합체 V, F1F0 ATP 신타제는 염증 중 세포(내피, 백혈구, 상피 포함)에서 유비쿼터스로 발현되는 것으로 알려진 미토콘드리아 단백질이다. 액틴과 튜룰린으로 구성된 세포 골격은 미토콘드리아 단백질뿐만 아....

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Protocol

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연구 디자인은 서스 캐처 원 대학의 동물 연구 윤리 위원회에 의해 승인되었으며 인도적 인 동물 사용을위한 동물 관리 지침에 대한 캐나다 위원회에 준수되었습니다. 6-8주 된 남성 C57BL/6J 마우스가 조달되었다. 참고: 예정된 종점 전에 심한 혼수, 호흡 곤란 또는 심각한 고통의 다른 징후를 개발하는 동물을 안락사시하십시오.

참고 : 다음을 준비 : 27-18 G 바늘 무딘 (마우스 기관 직경에 따라 달라집니다), 무딘 바늘에 맞게 적절하게 크기의 PE 튜브 (모든 마우스에 대한 PE 캐뉼라만들기), 캐뉼라, 날카로운 가위 2개, 무딘 집게 2개(소형), 날카로운 집게(소형), 31mL 주사기, 라벨이 부착된 미세푸지 튜브(BAL, 혈액, 혈관 및 골수 난투 수집용) 및 라벨이 부착된 바이알(조직 고정용), 티슈 수집용 샘플 백/냉동, 정육점면의 면실 롤(적절한 결합체로 절단). 실험에 사용되는 모든 화학 물질은 재료 표에표시됩니다.

1. 오존과 LPS 는 뮤린 폐 부상의 유도에 대한 노출

  1. 오존 노출
    1. 사용자 지정 O3 유도 상자를 준비합니다. 마우스 사료, 물병, 농축 장난감, 깨끗한 침구를 순서대로 추가하고....

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Results

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결합된 O3및 LPS 노출은 72h에서 전신 염증 및 골수 동원으로 이끌어 냅니다: 다른 구획에 있는 세포 수는 말초 혈액에 있는 중요한 변경을 밝혔고 대퇴골골총 세포는 결합한 O3 및 LPS 노출에 근거를 두는 때 계산합니다. 결합된O3 및 LPS 노출은 총BAL(도 1A)또는 LVP(도1B)세포 수, 다형성형 세포가 24(도1F,보충도 1),노출 후 36및 72h에서 우세한 세포 유형으로 제시된 어떠한 변화도 유도하지 않았다. 24h BAL 사이토스핀이미지(도 1F)에서다형성 핵세포에 시글렉-f 및 CX3CR1 염색이.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 연구에서 제시된 방법은 폐 염증 도중 다중 세포 사건을 공부하기 위하여 다중 구획 분석의 유용성을 강조합니다. 표 2의결과를 요약했습니다. 우리와 많은 실험실은 광범위하게 폐 호중구의 급속한 모집에 의해 표시되는 비강 LPS 주입에 뮤린 반응을 연구했습니다, 이는 6-24 시간 사이 피크, 해상도차기. 그리고 최근에는 서브임상O3(2시간 동안 0.05ppm)만으로도 폐 혈관 구획에 호중구를 분할하여 표시되는 C57BL/6NJ 서브 스트레인15에서상당한 폐 손상을 유도할 수 있으며, 이는 BAL에서 손상된 대식세포및 파편이 관찰된 반면, 따라서O3의염증 가능성을 나타낸다. 그 모형에서 우리는 O3 유도한 폐포 상피 손상및 폐포 대식세포에 의하여 결과된 phagocytosis결과로 폐포 구획에 있는 호중구의 부재를 관찰했습니다. 우리는 O3 모형에 있는 세포외 DNA 및 파편을.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이나 공개가 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 대통령의 NSERC 보조금과 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금에 의해 지원됩니다. 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터는 혁신 서스캐처원의 지원을 받고 있습니다. 형광 화상 진찰은 NSERC에 의해 투자되는 WCVM 화상 진찰 센터에서 수행되었습니다. 제시카 브로코스(MSc 학생)와 만프리트 카우르(MSc Student)는 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금으로 지원받았다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
33-plex Bioplex chemokine panelBiorad12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) 현미경 대물렌즈LeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11002
Alexa 488 conjugated phalloidinInvitrogenA12370
Alexa 555 활용 염소 항 -&알파; 튜불린 클론 DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568 활용 염소 항 햄스터 IgG (H + L)InvitrogenA21112
Alexa 568 활용 염소 항 쥐 IgG (H + L)InvitrogenA11077
Alexa 633 활용 염소 항 토끼 IgG (H + L)InvitrogenA21070
아르메니아 햄스터 안티 CD61 (클론 2C9. G2) IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL/6 J MiceJackson Laboratories64
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경LeicaLeica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)InvitrogenD1306분취 2 µ l 재고 및 상점 -20°C; C
도립 형광 광시야 현미경OlympusOlympus IX83
케타민(나르케탄)베토퀴놀100mg/ml10회 희석하여 10mg/ml 스톡
(calcein)/Dead(Ethidium homodimer-1) 세포독성 키트InvitrogenL3224
마우스 anti-ATP5A1 IgG2b(클론 7H10BD4F9)Invitrogen459240
마우스 항-ATP5&베타; IgG2b (클론 3D5AB1)InvitrogenA-21351
마우스 anti-NK1.1 IgG2a kappa (클론 PK136)Invitrogen16-5941-82
Pierce 660 nm 단백질 분석Thermoscientific22660
토끼 항 안지오스타틴 (마우스 aa 98-116) IgGAbcamab2904
토끼 anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)Invitrogen14-6093-81
쥐 anti-Ki-67 (클론 SolA15) IgG2a 카파Invitrogen14-5698-82
쥐 안티 Ly6G IgG2a 카파 (클론 1A8)Invitrogen16-9668-82
쥐 안티 Ly6G / Ly6C (Gr1) IgG2b 카파 (클론 RB6-8C5)Invitrogen53-5931-82
쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 Fc 블록 (클론 2.4G2)BD Pharmingen553142
감소 mitotracker orangeInvitrogenM7511
Xylazine (Rompun)Bayer20 mg/ml희석하여 10mg/ml 육수 만들기
만들기Live 2회

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017....

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