Method Article

수면 무효화 장치: 수 면 박탈 Drosophila의 매우 효율적인 방법

DOI:

10.3791/62105

⸱

December 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수면 부족은 수면 기능과 조절을 조사하는 강력한 도구입니다. 우리는 수면 무효화 장치를 사용하여 Drosophila를 수면 박탈하는 프로토콜을 설명하고, 박탈에 의해 유도된 리바운드 수면의 정도를 결정하기 위하여.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수면 항상성, 수면 손실 다음 관찰 수 면의 증가, 동물의 왕국을 통해 수 면을 식별 하는 데 사용 하는 정의 기준 중 하나입니다. 결과적으로, 수 면 부족 및 수 면 제한은 일반적으로 수 면 기능에 대 한 통찰력을 제공 하는 데 사용 되는 강력한 도구. 그럼에도 불구 하 고, 수 면 부족 실험은 본질적으로 문제가 박탈 자극 자체 생리학 및 행동에 관찰 된 변화의 원인 수 있습니다. 따라서 성공적인 수면 부족 기술은 동물을 깨어 있게 해야 하며, 이상적으로는 의도하지 않은 많은 결과를 유도하지 않고도 강력한 수면 리바운드를 초래합니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 멜라노가스터에대한 수면 부족 기술을 설명합니다. 수면 무효화 장치(SNAP)는 10대마다 자극을 투여하여 부정적인 지질택시를 유발합니다. 자극은 예측 가능하지만 SNAP는 높은 수면 드라이브가있는 파리에서도 야간 수면의 >95 %를 효과적으로 방지합니다. 중요한 것은, 후속 동종 반응은 손 박탈을 사용하여 달성한 것과 매우 유사합니다. 자극의 타이밍과 간격은 수면 손실을 최소화하고 따라서 생리학 및 행동에 자극의 비 특이적 효과를 검사하기 위해 수정 될 수있다. SNAP는 또한 수면 제한및 각성 임계값을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. SNAP는 수면 기능을 더 잘 이해하는 데 사용할 수있는 강력한 수면 장애 기술입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수면은 동물에서 보편적 인 근처에 있지만 그 기능은 불분명합니다. 수면 항상성, 수면 부족 후 수면의 보상 증가는 수면의 결정적인 특성이며, 이는 수면상태1,2,3,4,5의수면 상태를 특성화하는 데 사용되어 왔다.

즉석에서 수면은 수면 손실에 대한 강력한 정근성 반응을 포함하여 인간의 수면과 많은 유사점이 있습니다4,5. 즉석에서 수면의 수많은 연구는 확장 된 깨어에서 발생하는 불리한 결과를 검사하여 수면 기능을 추론하기 위해 수면 부족을 모두 사용하고, 수면의 정충성 조절을 제어하는 신경 생물학적 메커니즘을 결정하여 수면 조절을 이해합니다. 이와 같이 수면 박탈파리는 학습 및기억6,7,8,9,10,11,12,구조적 가소성13,14,15,시각주의16,뉴런 상해로부터의회복,17,18,짝짓기 및 공격적인행동(19)에장애를 나타내는 것으로나타났다. 20,세포증식(21)은산화스트레스(22)및23에 대한 반응으로 몇 가지 이름을 지정한다. 또한, 리바운드 수면을 제어하는 신경생물학적 메커니즘에 대한 조사는수면항상성을 구성하는 신경 기계에 대한 중요한 통찰력을 산출했다8,9,23,24,25,26,27,28,29 . 마지막으로, 건강한 동물의 수면 기능에 대한 근본적인 통찰력을 밝히는 것 외에도 수면 부족 연구는 병든 상태에서 수면 기능에 대한 통찰력을30,31로나타냈습니다.

수면 부족은 명백히 강력한 도구이지만, 수면 부족 실험과 함께, 동물을 깨우는 데 사용되는 자극에 의해 유도된 것과 는 함께 깨어있는 현상을 구별하는 것이 중요합니다. 손 부족 또는 부드러운 취급에 의한 수면 부족은 일반적으로 최소한의 파괴적인 수면 부족을 위한 표준으로 간주됩니다. 여기서 우리는 수면 무효화 장치 (SNAP)를 사용하여 수면 박탈 파리에 대한 프로토콜을 설명합니다. SNAP는 10대마다 비행하는 기계적 자극을 제공하여 음의 지질택시(그림1)를유도하여 파리를 깨어 있게 하는 장치입니다. SNAP는 높은 수면 드라이브8,32로 비행할 때도 야간 수면의 >98%를 효율적으로박탈합니다. SNAP는 강타 민감한 파리에서 보정되었으며 SNAP에서 파리가 파리에 해를 끼치지 않습니다. SNAP를 가진 수면 부족은 손 박탈에 의해 얻어진 것과 비교되는 리바운드를 유도합니다7. SNAP는 따라서 자극자극의 효과를 조절하면서 파리를 잠들게 하는 강력한 방법입니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 실험 준비

  1. 그들은 바이알에 가까이로 파리를 수집, 남성과 여성의 파리를 분리.
    참고: 수면 실험은 일반적으로 암컷 파리로 수행됩니다. 처녀 여성을 수집하는 것이 중요합니다. 짝짓기 암컷은 유충에 부화하는 알을 낳아 데이터 분석을 복잡하게 만듭니다.
  2. 집은 <20의 그룹에서 단일 섹스의 파리.
    참고: 주택은 사회적으로 풍요로운 환경(>50그룹)에서 비행하여 수면 운전6,13개의 잠재적으로 리바운드 수면측정을 방해합니다. 또한, 사회적 풍요로움에 따라 수면은 며칠 동안 감소할 것이다6. 따라서, 기준선 수면은 리바운드 수면의 안정적인 복잡한 분석이 아니다. <20의 그룹으로 파리를 유지하는 것은이 잠재적 인 혼동을 피할 수 있습니다.
  3. 가볍고 습도가 조절된 환경에서 3-5일 동안 유리병에 파리를 보관하십시오.
    참고: 파리의 나이와 성숙도는 수면에 큰 영향을 미칩니다. 수면은 하루 오래된 파리에서 높고4세의 3-5 일까지 안정화됩니다. 파리는 일반적으로 12h 빛으로 유지됩니다: 습도 50%에서 12h 어두운 일정.

2. 수면 녹음을위한 튜브 준비

참고: 수면은 운동 활동 모니터를 사용하여 모니터링됩니다. 모니터는 직경 5mm 튜브에 개별적으로 보관된 32개의 파리를 수용할 수 있습니다. 전형적으로, 유전자형은 16 또는 32파리의 그룹으로 분석된다.

  1. 한쪽 끝에 플라이 푸드가 있는 적절한 수의 튜브를 준비합니다.
    참고 : 식이 요법과 신진 대사는수면 33,34에영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로 사육 된 동일한 음식에 파리를 배치하는 것이 특히 중요합니다.
  2. 튜브 끝을 왁스로 밀봉합니다.
    참고: 수면 부족과 리바운드는 5일간의 실험이며, 제대로 밀봉되지 않으면 음식이 건조될 수 있습니다. 제대로 밀봉 된 튜브에서 음식은 10 일 이상 유지할 수 있습니다. 따라서 튜브의 끝이 잘 밀봉되도록하는 것이 중요합니다. 그러나 파리는 젖은 음식에 붙어 얻을 수 있습니다. 따라서, 실험시작 1-2일 전에 튜브를 만드는 데 도움이 된다.
  3. 개별적으로 웨이크를 배치, 행동 은 아스피레이터를 사용하여 수면 기록을 위해 65mm 길이의 유리 튜브로 날아 와 폼 스토퍼와 튜브의 끝을 연결합니다.
    참고: 파리는 수면 기록을 위해 튜브에 파리를 배치할 때 CO2 마취에 다시 노출되지 않습니다. 아스피레이터는 치즈클로로 덮인 한쪽 끝이 있는 고무 튜빙으로 만들어졌으며 1mL 파이펫 팁에 삽입됩니다.

3. 수면 기록

  1. 하중은 튜브에서 수면을 모니터링하기 위해 활동 모니터로 날아갑니다.
    참고: SNAP 바위는 -60°에서 +60°까지 앞뒤로 모니터링합니다. 모니터는 ~5.9s에 대해 -60°에서 유지됩니다. 모니터를 들고 있는 트레이가 -60°에서 +60°로 이동하고 ~1s가 +60°에서 -60°로 다시 이동하는 데는 ~2.9s가 걸립니다. 모터에 제공된 전압을 조정하여 필요에 따라 사이클 길이를 변경할 수 있습니다.
    1. 튜브가 올바른 방향으로 활동 모니터에 배치되도록 주의하십시오. 올바른 방향으로, 음식과 튜브의 끝은 파리가 음식에 밀려되지 않도록 하기 위해 SNAP의 상단에 있습니다. 또한, 음식과 끝은 수면 기록 잭모니터의 측면에 있다. 이를 통해 활동 모니터는 SNAP에서 올바르게 방향을 정하여 효율적인 수면 부족을 동시에 모니터링할 수 있습니다.
  2. 수면을 모니터링하기 위해 기록 챔버에 활동 모니터를 배치합니다.
  3. 기준선 수면을 추정하기 위해 적어도 2일 동안 수면을 모니터링합니다.
    참고: 파리가 활동 모니터에 적재되는 날은 일반적으로 파리가 튜브에 수용되는 것에 적응할 수 있도록 적응의 날로 제외됩니다. 기준선 수면은 파리가 적재된 다음날 아침부터 최소 2일(48시간)동안 기록됩니다.
  4. 활동 기록 소프트웨어(예: 오전 8시부터 오전 8시까지)를 사용하여 전날 조명을 켜기 까지 1분 간 쓰레기통에 있는 소운동 활동 수를 저장합니다.
  5. 수면35의시합에 대한 임계값으로 비활성 5분 동안 사용자 지정 매크로를 사용하여 운동 활동 데이터에서 수면을 추정합니다.
    참고: 여러 수면 메트릭은 운동 활동 수에서 계산됩니다. 여기에는 24시간 이상 분/h에서 수면, 24시간 의 총 수면 시간, 평균 및 최대 주간 및 야간 수면 시합 길이36이포함됩니다.

4. 수면 부족 과 회복

  1. 파리는 가변 시간 길이(예를 들어, 12h, 24h 및 36h)에 대해 수면을 박탈할 수 있고 회복 수면은 다양한 간격(예를 들어, 6h, 12h, 24h 및 48h)으로 평가될 수 있기 때문에 실험적 필요에 의한 회복 기간을 결정한다. 수면 회복은 수면 이득/손실 플롯을 사용하거나 소정의 간격(예를 들어, 6h)을 통해 회복된 백분율 수면을 검사하여 시각화할 수 있다.
  2. 수면이 2기준일 동안 안정되면, 셋째 날에는 활동 모니터를 SNAP에 배치하여 밤새 수면 부족을 극복합니다.
    참고: 파리는 수면 시간8,32,37,38의범위에 걸쳐 강력한 수면 리바운드를 나타내지만, 수면은 안정적으로 리바운드 수면을 평가하기 위해 안정적이어야 합니다. 수 면은 기준일 간의 수면 차가 100분 ± 때 안정적입니다.
  3. 모니터 홀더 핀, 모니터 코드가 연결된 모니터, 뒷면의 음식, 앞면의 플라스틱 장벽으로 끝을 올바르게 지향하는모니터(그림 1)로활동 모니터가 제자리에 고정되어 있는지 확인합니다.
    참고 : SNAP는 캠이 10 s(그림 1)에한 번 회전하도록 설계되었습니다. 플라스틱 인서트가 장치가 "위로" 위치에 있을 때 튜브를 다시 밀어 튜브를 재설정합니다. 튜브를 재설정하는 것은 모든 튜브가 각 주기의 시작 부분에 전체 운동 범위를 갖도록 하는 것이 중요합니다.
  4. 활동 모니터를 분리하고 밤새 수면 부족 후 의 조명 시 즉시 SNAP에서 모니터를 꺼내십시오.
    참고: 수면 부족이 종료되는 것이 중요하며, 파리는 하룻밤 사이에 12시간 동안 수면 부족을 겪은 다음 의 조명 시 즉시 회복에 배치됩니다. 파리를 회복에 넣는 데 20-30분 지연이 있어도 리바운드 수면의 정도를 방해할 수 있습니다.
  5. 그들은 복구 수면을 모니터링하기 위해 이틀 (48 시간) 동안 방해받지 않을 것이다 녹음 챔버에 파리를 배치합니다.
    참고: 다른 실험에 기록 챔버가 사용되는 경우 파리를 복구하는 자극을 피하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다.
  6. 잃어버린 수면의 양을 계산합니다. 각 개별 비행에 대 한, 수 면 부족 동안 얻은 수 면 과 기준 기 동안 해당 시간 사이의 시간당 차이를 계산; 시간당 차이를 합산하여 손실된 총 수면을 계산합니다.
  7. 복구된 수면량을 계산합니다. 각 개별 비행에 대해, 회복 중에 얻은 수면과 기준선 동안 해당 시간 사이의 시간당 차이를 계산합니다. 시간당 차이를 합산하여 총 수면을 계산합니다.
    참고 : 비행이 실제로 수면 박탈인지 여부는 경험적입니다. 따라서, 실험자는 잃어버린 % 수면을 검사해야합니다. 비행이 충분한 양의 수면을 잃지 않으면 분석에서 제외될 수 있습니다. 이것은 그밖 잠 부족 접근을 위해 필요할지도 모르지만, SNAP를 위해 이제까지 요구하는 경우에 거의 없습니다. 더 일반적으로, 수 면 은 수 면 부족의 개시 하기 전에 주어진된 비행에서 안정 되지 않을 수 있습니다. 수면이 안정적이지 않으면 항상성을 계산할 수 없습니다. 우리는 포함 후보로 수면 부족의 개시 전에 계산 된 수면의 ± 100 분의 최대 차이를 받아 들입니다. 경우에 따라, 개별 비행의 수 면은 24 시간 일에 걸쳐 고르지 않게 분포됩니다 (예를 들어, 일부 개인은 낮동안 수면 할당량의 60-70 %를 얻을 수 있으므로 밤에 12 시간 동안 박탈 될 때 24 h 수면 할당량의 작은 비율을 잃을 수 있습니다). 이러한 파리는 별도로 평가할 수 있습니다.
  8. 각 유전자형에 대한 회복 기간의 12시간, 24시간 및 48h 이상 회복된 수면의 평균 백분율(기준선에 상대)을 계산합니다.
  9. 수면 데이터에서 기준선에서 평균 및 최대 주간 수면 시합 길이와 각 유전자형에 대한 회복 일을 계산합니다.
    참고: 파리의 리바운드 수면은 수면량이 증가하고 회복일 수 있는 수면 깊이가 증가하는 것이 특징입니다. 수면 통합은 수면 깊이의 척도로 사용됩니다. 각성 임계값은 또한 수면 깊이의 측정으로 사용될 수 있었습니다.

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Results

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캔톤 S(Cs)는 야생형 변형으로 사용되었다. 파리는 12h 빛으로 유지되었습니다 : 12 시간 어두운 일정, 수면은 하룻밤 사이에 12 시간 동안 박탈되었습니다. Cs의 수면 프로파일 검사는 기준선일(bs), 수면 부족일(sd), 2일 회복일(rec1 및 rec2)(그림 2A)에파리가 SNAP에서 효과적으로 수면을 취하지 않았으며, 문헌4,5에서관찰된 보고와 일치하는 낮 동안 수면을 회복했다는 것을 시사한다. 파리를 깨우는 SNAP의 효과는 수면부족(도 2B)동안파리에 의해 전시되는 높은 활성(300-350 카운트/h)에서도 볼 수 있다. 실제로, 수면 부족 동안 파리의 활동 수를 모니터링하는 것은 박탈 프로토콜 및/ 또는 수면 드라이브의 간접적인 측정의 효과...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

드로소필라의 수면은 2000년에 독립적으로 특징지어졌으며, 2개 그룹4,5. 이러한 선구적인 연구에서 파리는 부드러운 취급 (즉, 손 부족)에 의해 수면을 박탈하고 하룻밤 수면 부족에 대한 강력한 동종 반응을 나타내는 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 어떤 잠 부족 실험든지와 함께 동물을 깨어 있는 것을 지키기 위하여 이용된 방법의 잠재적인 혼란 효력을 통제하는 것이 중요합니다. 손 박탈 연구는 수면 부족 파리의 최소한의 파괴적인 수단으로 비행 항상성의 연구에 대한 벤치 마크를 설정합니다. SNAP는 야간 수면의 >98%의 수면을 효율적으로 박탈하고, 중요한 것은 손 박탈4,7로얻은 것과 비교할 수 있는 수면 리바운드를 유도한다.

파리의 수면을 정의하는 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 NIH 보조금 5R01NS051305-14 및 5R01NS076980-08에 의해 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep WaxThermo Fisher13404-122왁스는 튜브를 밀봉하는 데 사용됩니다
유리 튜브Wale Apparatus244050우리는 5mm 직경의 Pyrex 유리를 절단합니다  65mm 길이의 튜브로  수면을 기록합니다. 사전 절단 튜브  또한 구입할 수 있습니다.
Nutri Fly Bloomington Formulation 플라이 푸드Genesee Scientific66-113Labs는 자체 플라이 푸드 레시피를 사용할 수 있습니다. 파리가 자란 것과 동일한 음식에 수면을 기록하는 것이 중요합니다.
회전 유리 절단 도구Dremel Multi Pro39565mm 길이의 유리 튜브를 절단하는 데 사용됩니다 
Monitoring Sleep
DAM 시스템 및 DAMFileScan 소프트웨어DAM 모니터에서 데이터를 획득하고 획득한 데이터를 적절한 형식으로 저장하는 데 사용되는 소프트웨어
데이터 수집 컴퓨터LenovoIdea Center AIO3모든 제조업체의 동급 컴퓨터는
초파리 활동 모니터를TrikineticsDAM2이 모니터는 파리의 운동 활동을 기록하는 데 사용됩니다
환경 모니터TrikineticsDEnM필수는 아니지만 수면이 기록되는 챔버의 환경 조건을 모니터링하는 쉬운 방법
Light ControllerTrikineticsLC4SNAP을 켜고 끄는 타이밍을 제어하는 편리한 방법
DAM용 전원 공급 장치 인터페이스 장치TrikineticsPSIU-9데이터 수집 컴퓨터가 Trikinetics locomotor acitvity 데이터를 기록하는 데 필요
RJ11 커넥터7001-64PCMulticompDAM 모니터는 RJ11 잭을 수용합니다
분배기TrikineticsSPLT5최대 5개의 DAM 모니터를 연결하는 데 사용
전화 케이블 와이어Radioshack278-367DAM 모니터
에서 데이터를 수집하기 위한 전화 케이블Sleep Deprivation
Power supplyGw INSTEKGPS-30300
Medicine 기계 공장
. 대체할 수 있습니다.함 SNAP 수면 무효화 장치 Washington University School of 용 전원 공급 장치

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