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방법 논문

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

2.8K 조회수

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DOI:

10.3791/62115

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2021년 2월 28일

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1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

초록

바이러스 감염 중 비강 상피층과 선천적 면역 세포 사이의 초기 상호 작용은 아직 탐구되지 않은 영역으로 남아 있습니다. 바이러스 감염에서 선천적 면역 신호전달의 중요성은 높은 선천적 T 세포 활성화를 나타내는 호흡기 감염 환자가 더 나은 질병 결과를 보임에 따라 실질적으로 증가하였다. 따라서, 이러한 초기 선천적 면역 상호작용을 해부하는 것은 이들을 지배하는 과정의 해명을 허용하고, 바이러스 감염의 초기 진행을 감쇠시키거나 심지어 예방하기 위한 잠재적인 치료 표적 및 전략의 개발을 촉진할 수 있다. 이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 기도 상피 세포에 의해 분비되는 인자로부터 초기 누화, 상호작용 및 선천적 면역 세포의 활성화를 연구하는데 사용될 수 있는 다목적 모델을 상세히 기술한다. 대표적인 바이러스 모델로 H3N2 인플루엔자 바이러스(A/Aichi/2/1968)를 사용하여 공동 배양된 말초혈액 단핵구(PBMCs)의 선천적 세포 활성화를 유세포 분석기를 사용하여 바이러스 감염에 반응하여 상피에서 방출되는 가용성 인자에 의해 활성화되는 세포의 하위 집합을 조사하기 위해 분석되었습니다. 이 결과는 세포의 서브셋을 분화시키기 위한 게이팅 전략을 입증하고, PBMCs의 활성화된 집단과 대조군 및 감염된 상피와의 그들의 누화 사이의 명확한 차이를 드러낸다. 그 다음, 활성화된 서브세트는 그들의 기능뿐만 아니라 세포에 특이적인 분자 변화를 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 이러한 누화 조사의 결과는 바이러스 감염의 진행을 통제하고 억제하는 데 도움이되는 중요한 선천적 세포 집단의 활성화에 중요한 요인을 발견 할 수 있습니다. 또한, 이러한 요인은 다른 바이러스 질환, 특히 새로 출현하는 바이러스에 보편적으로 적용되어 순진한 인간 집단에서 처음 순환 할 때 그러한 바이러스의 영향을 약화시킬 수 있습니다.

서론

호흡기 바이러스는 아마도 심각한 건강 관리 및 경제적 부담을 초래하는 가장 널리 퍼진 병원체 중 하나 일 것입니다. 신흥 유행성 균주 (예 : H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19)의 정기적 인 세계적 발병에서부터 매년 인플루엔자의 계절적 변종에 이르기까지 바이러스는 공중 보건에 지속적인 위협이됩니다. 백신이 이러한 세계 공중 보건 문제에 대한 대응의 주요 대부분을 형성하지만, 이러한 대응 조치는 단지 1,2에 불과하다는 점에 유의하는 것은 냉정합니다. 또한, 새로운 감염성 균주의 출현과 백신의 성공적인 개발 사이의 지연은 불가피하며3, 바이러스의 확산을 억제하기 위한 가능한 조치가 매우 제한적인 시기로 이어진다.

이러한 지연은 경제적, 사회적으로 사회에 가해지는 비용에 의해 더욱 강조됩니다. 계절성 독감 만 간접 비용으로 약 80 억 달러, 의료 비용 3.2 억 달러, 미국에서 매년 36.3 천 명의 사망자를 초래합니다4. 이것은 백신 개발 자금을 조달하는 데 필요한 연구 비용을 고려하기 전입니다. 전염병 발생은 심각한 급성 호흡기 증후군 코로 노 바이러스 2 (SARS-CoV-2)5,6,7의 출현과 급속한 확산으로 인한 세계적인 혼란으로 입증 된 바와 같이 매년 세계화의 증가율에 의해 복합적으로 사회에 더욱 심각한 영향을 미칩니다.

최근 연구에 따르면 활성화 된 선천적 T 세포 집단이 더 많은 감염된 환자는 더 나은 질병 결과 8,9,10을 갖는 경향이 있습니다. 더욱이, 선천적 T 세포 집단은 다수의 하위군으로 분류된다: 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, Vδ1 γδ T 세포, Vδ2 γδ T 세포, 및 자연 살해 T (NKT) 세포. 선천적 T 세포의 이들 하위군은 또한 그들의 집단 내에서 이질성을 나타내어, 선천적 면역 반응에 관여하는 세포 집단 사이의 상호작용의 복잡성을 증가시킨다(11). 따라서, 이러한 선천적 T 세포를 활성화시키는 메카니즘 및 선천적 T 세포의 특정 하위군에 대한 지식은 특히 백신 개발 기간 동안 인간 숙주에 대한 이들 바이러스의 감염성 효과를 감소시키기 위한 연구의 다른 길을 제공할 수 있다.

인플루엔자에 의해 감염된 상피 세포는 선천적 T 세포를 빠르게 활성화시키는 인자를 생산한다12,13,14. 이러한 발견을 바탕으로 이 비접촉식 공기-액체 인터페이스(ALI) 공동 배양 모델은 초기 감염 동안 감염된 비강 상피층과 PBMC 사이의 초기 화학적 상호작용(감염된 상피층에 의해 방출되는 가용성 인자에 의해 매개됨)을 모방하는 것을 목표로 합니다. 비강 상피층(막 삽입물에서 배양됨)과 PBMCs(아래 챔버 내) 사이의 물리적 분리와 상피 완전성은 바이러스에 의한 PBMC의 직접적인 감염을 방지하여, 상피 유래 가용성 인자가 PBMC에 미치는 영향에 대한 상세한 연구를 가능하게 한다. 따라서 확인된 인자는 인플루엔자 감염으로부터 보호할 수 있는 적절한 선천적 T 세포 집단을 유도하는데 있어서 그들의 치료 잠재력에 대해 추가로 조사될 수 있다. 따라서이 논문은 상피 유래 가용성 인자로부터의 선천적 T 세포 활성화의 연구를 위한 공동 배양을 확립하는 방법을 상세히 기술하였다.

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프로토콜

참고: 이 프로토콜에 사용되는 미디어의 제조법은 표 1 을 참조하십시오.
참고: 12-웰 트랜스웰에서 자란 hNECS는 인플루엔자 바이러스에 감염되었을 때 용해성 인자가 기저실에 쉽게 도달할 수 있도록 최적의 두께로 성장하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 공동 문화를 위해 12 웰 크기의 트랜스웰을 사용하는 것이 좋습니다.

1. 3T3 피더층의 확립

  1. 냉동 주식에서 설립
    1. 냉동 스톡에서 NIH / 3T3 섬유 아세포의 냉동 해동을 해동하십시오. 냉동 내용물을 완전한 둘베코의 최소 필수 배지 (DMEM) 2 mL에 넣고 세포를 재현탁하십시오.
    2. 300 × g 및 실온/압력(rtp)에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 셀을 전체 DMEM에서 재현탁합니다.
    3. 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하십시오. 10 μL의 트리판 블루를 10 μL의 재현탁된 세포 현탁액에 첨가한다. 완전히 혼합하고, 현탁액 10 μL를 혈구측정기에 첨가하여 세포를 계수한다.
    4. 1 × 104 cells/cm2 의 밀도로 세포를 적절한 배양 접시 (예를 들어, T75 플라스크)에 뿌린다. 생성된 배양 플라스크를 5%CO2 분위기에서 37°C에서 3일 동안 인큐베이션한다.
  2. 미토마이신 C 치료
    1. 3일째에, 컨플루언시가 60%-80%인지 확인하고, 배지를 제거하고, 세포를 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척한다.
      참고: 3T3 피더 레이어가 전체 합류율에 도달하지 않는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 미토마이신 C 치료는 효과적이지 않을 것이다.
    2. 미토마이신 C가 보충된 완전한 DMEM을 플라스크에 첨가하고, 5%CO2 분위기에서 37°C에서 3.5시간 동안 인큐베이션한다. 미토마이신 C 함유 배지를 제거하고, 세포를 1x PBS로 2x 세척하였다.
  3. 3T3 세포를 6웰 플레이트에 시딩
    1. 3 mL의 1x 트립신-EDTA를 플라스크에 3-5분 동안 첨가하여 세포를 분리시킨다. 분리된 세포를 신선한 15 mL 튜브에 수집한다. 15 mL 튜브를 300 × g, rtp에서 5분 동안 원심분리하는 단계; 상층액을 버리십시오. 셀을 전체 DMEM에서 재현탁합니다.
    2. 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하십시오. 세포를 7.5 × 10 5-2.5 × 10 6 세포 / 웰의 6 웰 플레이트에 시드하십시오. 플레이트를 5%CO2 분위기 하에서 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
      참고: 3T3 피더 레이어는 세포가 건강한 경우 준비가 된 것으로 간주됩니다. 이 시점에서 인간 비강 상피 줄기 / 전구 세포 (hNESPCs)를 확장을 위해 피더 층에 시드하십시오.
    3. 플라스크에 완전한 DMEM을 첨가하고, 미토마이신 C 처리로부터 회수하기 위해 3T3 세포에 대해 밤새 37°C, 5%CO2 에서 인큐베이션한다.

2. 인간 비강 상피세포(hNEC) 배양물의 확립

참고 : 임상 샘플은 상부 호흡기 감염의 증상이없는 환자로부터 얻어야합니다.

  1. 비강 조직을 단일 세포 현탁액으로 처리
    1. 비강 조직을 100 μL/mL의 항생제-항균제 혼합물을 함유하는 1x 둘베코 PBS (dPBS) (Mg2+ 및Ca2+가 없는 PBS)로 세척한다. 조직을 작은 단편으로 자르고, 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 10mg/mL의 중성 프로테아제로 진탕하면서 처리한다.
    2. 200 × g에서 5분 동안 원심분리하고, 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 펠렛을 1-2 mL의 1x 트립신-EDTA (37°C, 15분)로 인큐베이션하고, 튜브 내에 부피의 10%에 해당하는 우태아 혈청의 부피를 첨가하여 켄칭한다.
    3. 소화된 조직을 피펫팅에 의해 단일 세포 응집체로 기계적으로 해리시킨 다음, 생성된 현탁액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 통과시킨다. 셀을 전체 DMEM에서 재현탁합니다.
      참고: 이 단계 후, 세포 현탁액은 인간 비강 상피 줄기/전구 세포(hNESPCs)로 지칭되는 말단 분화된 세포와 줄기 세포의 혼합물이다. 후속 단계의 목적은 상이한 세포 집단의 혼합물로부터 hNESPC 집단을 선택하고 풍부하게 하는 것이다.
  2. hNESPCs의 선택을 위해 단일 세포 현탁액을 3T3 피더 층 상에 시딩하는 단계
    1. 단계 2.1.3(300 × g, 5 min, rtp)으로부터 세포 현탁액을 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포를 배지 3-5 mL에 재현탁 3.
      참고: 배지 3은 hNESPCs의 선택적 성장을 촉진하기 위해 제형화된다.
    2. 트리판 블루 염색을 통해 세포를 계수하십시오. 시드 1 x 10 6 세포를 2mL의 배지 3 당 웰 당 6-웰 플레이트 상에6 웰 플레이트에서 배지를 제거한 후 3T3 피더층을 제조하였다. 생성된 공동 배양물을 5%CO2 분위기에서 37°C에서 인큐베이션한다.
      참고 : 시드 후 hNESPC의 부착에 영향을 미치므로 플레이트를 교반하지 않도록주의하십시오.
    3. 기존 배지를 완전히 제거하고 신선한 배지로 교체하여 2-4일마다 배지 3(2mL)을 교체합니다.
      참고: 배지는 영양소를 보충하고 지나치게 산성인 상태가 hNESPC의 성장에 부정적인 영향을 미치는 것을 방지하기 위해 변경됩니다. 각 배지 변화 사이의 간격은 배지가 얼마나 산성 (노란색)이되는지에 달려 있습니다. 매체가 빠르게 산성으로 변하면 간격을 줄여야합니다.
    4. 7-10 일 후, hNESPC가 멤브레인 인서트로 옮기기에 적합한 합류점에 있음을 관찰하십시오. 3개의 상이한 시점(2일, 5일 및 10 일)에서의 hNESPCs의 대표적인 형태학에 대해서는 도 1을 참조한다.
  3. hNESPC를 멤브레인 인서트로 전송
    참고: 미토마이신 C 처리로 인해, 3T3 피더 층은 hNESPC 확장 기간 동안 서서히 분해될 것이다. 이것은 우물 표면에 대한 접착력을 약화시켜 피펫으로 플러싱하여 탈락을 허용하고 건강한 hNESPC 만 남깁니다.
    1. 배지를 제거하고, 500 μL의 1x dPBS를 각 웰에 첨가한다. 세포를 마이크로피펫으로 3x 플러시하여 3T3 세포를 빼내고, 1x dPBS를 버린다. 현미경으로 스핀들 모양의 3T3 피더 층이 빠져 나가는 동안 둥근 hNESPC가 남아 있음을 관찰하십시오.
    2. 웰 당 500 μL의 세포 분리 시약을 첨가하고, 5%CO2 분위기에서 37°C에서 5-10분 동안 또는 hNESPCs가 웰 표면으로부터 분리될 때까지 인큐베이션한다.
    3. hNESPC 현탁액을 수집하고, 원심분리기(300 × g, 5분, rtp)하고, 상청액을 제거하였다.
    4. 펠렛을 배지 3에 재현탁시킨다. 트리판 블루 염색을 통해 세포를 계수하십시오. 시드 3 × 막 삽입물(24 -웰 플레이트) 당 배지 3 또는 멤브레인 인서트(12-웰 플레이트)당 배지 3의 1 × 105 세포에 10 4 세포를 포함하였다(도 2). 세포를 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 인큐베이션한다.
    5. 2 일마다 정점 및 기저 챔버의 배지 (배지 3)를 교체하십시오. 멤브레인 인서트의 지지 암 사이에 피펫 팁을 탐색하여 기저 챔버에 접근하고 오래된 매체를 제거한 다음 동일한 방법으로 신선한 배지를 다시 도입하십시오. 정점 챔버는 쉽게 접근 할 수 있지만, 성장하는 hNESPC 층을 방해하지 않도록주의하십시오.
      참고 : 세포가 막에 부착 할 시간이 필요하므로 시딩 후 적어도 2 일 동안 정점 챔버의 배지를 방해하지 마십시오.
  4. hNESPC를 hNEC로 분화
    1. hNESPC가 100% 컨플루언시(멤브레인 인서트에 시딩된 후 약 3-7일)에 도달하면 ALI 배양을 시작합니다. 기본 배지를 분화 배지로 변경하고, 배지를 정점 챔버로부터 제거하였다. 도 3 및 단계 2.3.5 에 표시된 바와 같이, 2-3일마다 배지를 변화시킬 때 정점 챔버에 첨가하지 않고 단지 배지를 기저 챔버에 첨가한다.
      참고: 배지는 ALI에서 hNECs로의 hNESPCs로의 분화를 촉진하기 위해 분화 배지로 변경된다. hNESPCs는 ALI에서 hNECs가되기 위해 완전한 성숙에 도달하는 데 약 3-4 주가 걸리며, 이때 세포는 각 층에서 서로 다른 세포 집단을 가진 다층으로 성장했을 것입니다. 섬모는 또한 400x의 배율로 관찰되어야합니다 (섬모는 박동 운동으로 식별 할 수 있으며, 이로 인해 현미경 장이 진동하는 것처럼 보입니다). 이 시점에서, 세포는 공동-배양 실험에 사용될 준비가 되어 있다. 완전히 분화된 hNEC 층의 단면에 대해서는 도 4 를 참조한다.
    2. 성숙한 hNECs를 얻은 후, 세포를 공동배양 실험 전에 1주일 동안 2-3일 간격으로 1x dPBS로 정점 챔버 3x 세척한다. 세척 단계를 기초 배지 변화와 함께 상승시키고, 다음과 같이 세척을 수행한다.
      1. 50 μL (24-웰)/150 μL (12-웰)의 1x dPBS를 막 삽입물의 정점 챔버 내로 첨가하고, 세포를 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다. 배양 10분 후 dPBS를 제거하여 분화 과정에서 축적된 점액과 죽은 세포를 제거하였다.
        참고 : 실험의 성격에 따라 중탄산 나트륨 용액을 사용하여 점액층을 완전히 씻어 낼 수 있습니다. 그러나, 공동 배양 실험에서의 바이러스 감염의 경우, 점액 층은 유지되고, 단지 과량의 점액만이 dPBS 세척으로 제거된다. 이러한 체류는 유입된 바이러스 감염과 상호작용할 비강 상피 상에 존재하는 생리적 점액층을 모방하기 위한 것이다.

3. 경상피 전기 저항 (TEER) 측정

참고 : 상피 무결성의 확인은 손상되지 않고 건강한 상피층을 확보하는 데 중요합니다. 손상되지 않은 상피층은 전압계를 사용하여 4개의 랜덤 웰에서 수행되는 TEER 측정을 통해 결정됩니다.

  1. 전극을 70 % 에탄올로 헹구고 멸균을 보장하기 위해 사용하기 전에 15 분 동안 자외선으로 멸균하십시오. 멸균 후 1x dPBS로 헹구십시오.
  2. 1x dPBS의 100 μL (24-웰의 경우) 또는 300 μL (12-웰의 경우)를 막 삽입물의 정점 챔버에 첨가한다. 플레이트를 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하고; 그런 다음, dPBS를 제거한다.
  3. 측정될 각 웰에 대해, 미사용 웰을 1 mL (24-웰의 경우) 또는 3 mL (12-웰의 경우) 예열된(37°C까지) 분화 배지로 준비한다. 막 삽입물을 준비된 웰에 넣고, 200 μL (24-웰의 경우) 또는 600 μL (12-웰의 경우)의 예열 분화 배지를 정점 챔버에 첨가한다. 37°C에서 15분 동안 평형화시킨다(첨가된 바이러스 유형의 배양 온도, 예를 들어, 인플루엔자의 경우 35°C).
    참고: TEER 계산을 위해 동일한 방법으로 블랭크(빈 멤브레인 인서트)를 준비합니다.
  4. 예열된 분화 배지의 15 mL 튜브를 동일한 온도에서 15분 동안 평형화시킨다. 전극을 15 mL 튜브에 놓고 전압계를 켭니다.
    참고: 이 시점에서 판독값은 전극이 동일한 매체에 있으므로 0 저항이어야 합니다. 임의의 다른 판독치가 수득되면, 판독값이 0이 될 때까지 15 mL 튜브 내의 전극을 평형화시킨다.
  5. 블랭크로부터 시작하여, 전극을 각 웰에 위치시켜 하나의 전극이 정점 챔버 매질에 잠기고 다른 전극이 기저 챔버 매질에 잠기도록 한다. 적어도 5 분의 기간 동안 일정한 판독이 얻어지는 경우에만 판독 값을 기록하십시오.
  6. 각 측정 후, 다음 측정 전에 PBS로 전극을 세척한다. 테스트된 각 웰에 대해 멤브레인의 서로 다른 위치에 있는 세 개의 샘플에 대한 측정을 수행합니다. 각 샘플의 순 TEER를 계산하려면 각 측정에서 빈 멤브레인 삽입물에 의해 주어진 배경 저항을 뺍니다.
  7. 다음 방정식을 사용하여 우물에 대한 총 TEER 판독값을 계산합니다.
    상피 완전성 (Ωcm2) = 순 TEER (옴) × 멤브레인의 면적 (cm2)
    참고: 바이러스 감염 실험을 위한 hNEC의 TEER 값은 >1000Ωcm213,15,16이어야 합니다. 

4. 말초혈액 단핵구와 NK 세포의 분리

참고 : 혈액 샘플은 건강한 자원 봉사자로부터 얻어야하며 격리 당일에 사용해야합니다.

  1. 10 mL 혈액 수집 튜브의 각 기증자로부터 30-40 mL의 전혈을 수집하십시오.
  2. 밀도 구배 원심분리를 사용하여 PBMC를 분리하고, 다음 단계 후에 버피 코트로부터 PBMC를 얻는다(또한 물자의 표 참조).
    1. 동일한 부피의 균형 잡힌 소금 용액 (PBS)으로 희석하기 전에 혈액 수집 튜브에서 ~ 10 mL의 혈액을 진공 청소기에 완전히 섞으십시오.
    2. 15 mL의 밀도 구배 배지를 50 mL 튜브의 기저부에 첨가한다.
      참고 : 희석 된 혈액에 대한 밀도 구배 배지의 비율은 2 : 3-3.5이어야합니다.
    3. 피펫 건(가능한 최저 수준으로 설정된 분배 설정 포함)을 사용하여 밀도 구배 매질에 희석된 혈액 35mL를 튜브를 45° 기울여 희석된 혈액을 튜브의 내벽에 떨어뜨려 밀도 구배 매질의 층이 방해받지 않도록 합니다.
    4. 원심분리 용해물을 500 × g, 18-20°C에서 30분 동안 용해시켰다(브레이크: 꺼짐). 조심스럽게 하부 층을 방해하지 않고 상부 플라즈마층을 제거하고 버린다.
    5. 버피 코트를 적혈구 층, 구배 밀도 배지 층 또는 버피 코트를 혼합하지 않고 새로운 튜브로 옮깁니다. 버피 코트가 새로운 50 mL 튜브에 수집되면, 부피를 1x PBS로 50 mL까지 충전한다.
    6. 용해물을 800 × g, 18-20°C, 8분에서 원심분리(브레이크: 오프), 피펫 건으로 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛을 50 mL의 1x PBS로 재현탁하고, 120 × g, 18-20°C, 10분에서 원심분리하여 혈소판을 제거하였다.
    7. 세포 펠릿을 방해하지 않고 피펫팅으로 상층액을 버리십시오.
      참고 : 세포 펠렛이 느슨 할 수 있으므로 부어 상층액을 버리는 것은 바람직하지 않습니다.
    8. 세포 펠릿을 완전한 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 배지로 재현탁시킨다. 재현탁된 세포 현탁액 10 μL에 메틸렌 블루와 함께 3% 아세트산 10 μL를 첨가하여 세포 계수를 수행한다. 완전히 혼합하고, 10 μL의 혼합물을 혈구측정기에 첨가하여 세포를 계수한다.
  3. 완전한 RPMI 배지로 PBMC를 2 × 10 6/mL (24 웰의 경우) 또는 4 × 106/mL (12 웰의 경우)의 밀도로 희석하십시오.

5. hNEC 바이러스 감염 및 hNEC로의 전환 : PBMC 공동 배양

참고: H3N2 (A/Aichi/2/1968)는 이 프로토콜에서 감염의 대표적인 균주로 사용됩니다. 감염의 다중도 (MOI) 0.1이 프로토콜에서 대표적인 MOI로서 사용된다.

  1. 0 일째 (hNEC의 감염)
    참고: 동일한 공여체로부터 성장한 hNECs로부터의 하나의 웰은 실험에 사용된 모든 웰에 대한 대표적인 세포 카운트를 얻기 위해 사용된다.
    1. 대표적인 웰에서, 150 μL의 1x 트립신-EDTA를 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 첨가하고, 350 μL의 1x 트립신-EDTA를 기저 챔버에 첨가하고, 37°C에서 10분 동안 또는 세포가 막으로부터 분리될 때까지 인큐베이션한다.
    2. 세포를 상하로 피펫팅하여 막 상에 플러시하고, 현탁액을 1.5 mL 원심분리 튜브에 수집한다. 200 μL의 완전한 DMEM을 첨가하여 트립신 활성을 켄칭한다. 트리판 블루 염색을 통해 세포를 계수하여 웰당 세포 카운트를 얻었다.
    3. 웰 당 세포 수를 기준으로 바이러스의 필요한 MOI를 계산하고, 얼음 위에서 완전한 RPMI로 그에 따라 바이러스 스톡을 희석한다.
      참고: 웰당 1.26 ×10,6 hNECs 중 MOI 0.1 = 30 μL(24웰의 경우)/100 μL(12웰의 경우)에서 웰당 1.26 × 105H3N2 바이러스 입자
    4. 감염 실험을 위한 나머지 웰에 대해, 50 μL(24웰의 경우)/150 μL(12웰 용)의 1x dPBS를 멤브레인 인서트의 정점 챔버 내로 첨가하고, 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하고, 1x dPBS를 제거하였다.
    5. 멤브레인 인서트의 기본 배지를 완전한 RPMI 배지로 변경하여 인서트를 웰에 완전한 RPMI가 첨가된 새로운 플레이트로 옮깁니다(350 μL(24웰의 경우)/700 μL(12웰의 경우)).
      참고: hNESPC가 hNEC로 완전히 차별화되면 매체를 RPMI12로 전환할 때 형태학이나 조직을 변경하지 않고 최대 72시간 동안 다른 미디어에 내성/허용됩니다. RPMI는 PBMC 집단의 성장 및 유지를 지원하기 위해 사용된다.
    6. 제조된 30 μL (24-웰용)/100 μL (12-웰용)의 바이러스 접종물을 막 삽입물의 정점 챔버 내로 첨가하고, 35°C에서 5%CO2 분위기에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 정점 챔버로부터 바이러스 접종물을 제거하였다.
    7. 멤브레인 인서트의 기본 배지를 신선한 완전 RPMI 배지로 변경하고 5% CO2 분위기에서 35°C에서24 시간 동안 인큐베이션한다.
  2. 1일차(hNECs + PBMCs 공동문화 확립)
    1. 필요한 수의 PBMC를 제0일부터 감염되지 않거나 감염된 hNECs의 각 웰의 기저 챔버 내로 직접 첨가함으로써 완전한 RPMI 배지의 150 μL (24-웰용)/300 μL (12-웰용)의 PBMC를 시드한다 (1.5 × 10 6 24-웰 플레이트의 경우 6, 12-웰 플레이트의 경우 3 × 106). 37°C에서 24/48시간 동안 인큐베이션한다.
      주: 공동배양물의 확립 후 기저실에서의 최종 부피는 500 μL (24-웰의 경우)/1000 μL (12-웰의 경우)이다.
  3. 2-3 일 (PBMCs 수확 48/72 시간 바이러스 감염 후)
    1. 정점 상청액 수집 (바이러스 감염 후 48/72 시간)
      1. 50 μL (24-웰의 경우)/150 μL (12-웰의 경우)의 1x dPBS를 각각의 정점 챔버에 첨가하고, 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다. 1x dPBS를 1.5 mL 튜브에 수집한다. 명취량 25 μL (24-웰용)/50 μL (12-웰용)의 상청액을 새로운 1.5 mL 튜브에서 플라크 분석을 위해, 스톡과 분취량을 -80°C에서 즉시 동결시킨다.
    2. hNECs에서 세포 RNA의 수집 (48/72 바이러스 감염 후 시간)
      1. 멤브레인 삽입물을 깨끗한 웰로 옮기고, 300 μL (24-웰의 경우)/600 μL (12-웰의 경우)의 RNA 용해 완충액을 정점 챔버에 첨가하고, rtp에서 5분 동안 인큐베이션한다. 상층액을 1.5 mL 원심분리 튜브에 수집하고, 분자 분석을 위해 RNA가 추출될 때까지 -80°C에서 보관한다.
    3. PBMC 수확 (바이러스 감염 후 48/72 시간)
      1. 멸균 피펫 팁의 넓은 베이스를 사용하여 웰 표면을 부드럽게 긁어 웰 표면에 부착될 수 있는 활성화된 PBMC를 제거합니다. PBMCs를 함유하는 기초 배지를 2 mL 원심분리 튜브에 수집한다.
      2. 웰을 2x 300 μL의 1x dPBS로 플러시하고, 동일한 2 mL 튜브에서 세척을 수집한다. 2 mL 튜브(500 × g, 5 min, rtp)를 원심분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 신선한 2 mL 튜브에서 상층액을 수집하였다. 상청액을 사이토카인 및 케모카인 분석을 위해 -80°C에서 보관하는 단계; 세포 펠릿을 1x dPBS의 200 μL에 재현탁시킨다.

6. 유세포 측정

참고: 프로토콜의 이 섹션은 단계 5.3.3.2에서 PBMC 세포 현탁액을 사용하여 이전 섹션에서 직접 계속됩니다. 이 섹션의 다음 단계에서 조명 노출을 최소화하십시오. 표면 염색 마커의 샘플 패널은 표 2에서 확인할 수 있다.

  1. 표면 염색
    1. 재현탁된 PBMC 세포 펠릿을 96-V 바닥 웰 플레이트 내로 옮긴다. 용해물을 800 × g 에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다.
    2. 모든 PBMCs("염색되지 않은" 제외)를 rtp에서 15분 동안 생존능 염색된 100 μL로 인큐베이션한다. 150μL의 자기 활성화 세포 분류(MACS) 버퍼와 함께 최대 200μL를 충전합니다. 원심분리기 용해물을 800 × g 에서 3분 동안 용해시키고, 상청액을 폐기한다.
    3. 적절한 희석 비율 및 반응 당 50 μL의 최종 부피로 관심있는 항체의 표면 염색 패널을 준비한다 (최종 부피를 얻기 위해 MACS 완충액으로 충전). 제조된 항체 믹스 50 μL를 다채널 피펫을 이용하여 세포에 첨가하여 표면 염색을 수행한다. 어둠 속에서 15분 동안 4°C에서 인큐베이션한다.
    4. 150 μL의 MACS 완충액을 첨가하여 세척한다. 원심분리하여 용해물을 800 × g 에서 3분 동안 용해시키고, 상청액을 버린다. 세포내 염색이 필요하지 않은 경우, 단계 6.3에서 15분 인큐베이션을 직접 진행한다.
  2. 세포 내 염색 (필요한 경우)
    1. 100 μL의 고정 및 투과화 용액을 각 웰에 첨가한다. 어둠 속에서 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 100μL의 1x MACS 버퍼로 웰을 충전합니다.
    2. 원심분리(800 × g, 3분, 25°C)하여, 상층액을 제거하였다. 200 μL의 1x 투과화 세척 완충액을 첨가하여 세척을 반복한다. 원심분리(500 × g, 3분, 25°C)하여, 상층액을 제거하였다.
    3. 1x 투과화 세척 완충액을 사용하여 50 μL의 최종 부피를 달성하기 위해 관심있는 항체 패널에 대한 희석물을 준비한다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 200 μL의 1x 투과화 세척 완충액을 첨가한다.
    4. 세포를 원심분리(800 × g, 3분, 4°C)하고, 상층액을 제거하였다. 세포를 100 μL의 형광 활성화 세포 분류 완충액에 재현탁시킨다.
  3. 200 μL의 용해 용액을 각 웰에 피펫한다. rtp에서 15분 동안 인큐베이션한다. 원심분리하여 800 × g 에서 3분 동안 용해시키고 상청액을 버린다.
  4. 세포 펠릿을 200 μL의 MACS 완충액에 재현탁시킨다. 앞서13번 요약된 설정에 따라 유세포 분석기를 수행하거나, 어둠 속에서 4°C에서 저장한다.

7. 사이토카인 및 케모카인 수준의 결정

  1. 25 μL의 기저 챔버 상청액을 제조자의 프로토콜18에 따라 면역학 멀티플렉스 검정을 사용하여 처리한다.
  2. 표준 곡선에 대한 곡선 피팅 알고리즘(5개 파라미터)을 활용하는 멀티플렉스 관리자 소프트웨어를 사용하여 각 분석물의 농도를 계산합니다.

8. 바이러스 오염의 평가

  1. 4 세트의 용액에 추출 키트를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하십시오 : H3N2 용액, 감염에 대한 MOI 0.1 희석액, MOI 0.1의 10x 연속 희석액 및 샘플로부터의 기본 배지 (바이러스 감염 후 48 및 72 시간 모두)12.
  2. 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 표적으로서 비구조 유전자(NS1) 및 매트릭스(M1)를 선택한다(대표적인 실험에 사용된 프라이머에 대한 물질의 표 참조).
  3. 바이러스 존재에 대한 프록시로서 NS1 및 M1 수준을 측정하기 위해 정량적 PCR(qPCR)을 수행하기 전에 바이러스 RNA를 cDNA로 전환시키기 위해 역전사-PCR (RT-PCR)(42°C, 60분)을 수행하고, MOI 0.1 분취량의 10x 연속 희석에 대해 수행된 RT-qPCR로부터 수득된 표준 곡선과 수준을 상관시킨다. 반응 믹스의 조성에 대해서는 표 3을 참조하고, 하기 조건을 사용한다: 95°C에서 10분 동안 예비인큐베이션하고, 이어서 40 사이클 동안 3 -단계 증폭한다: 10초 동안 95°C, 10초 동안 60°C, 30초 동안 72°C; 용융 곡선: 10초 동안 95°C, 60초의 경우 65°C, 1초 동안 97°C.

9. 플라크 분석

  1. 0일차: MDCK(매딘 다비 송곳니 신장)를 24웰 플레이트에 파종하기
    1. 컨플루언트 MDCK 세포의 T75 플라스크로부터 배지를 제거한다. 2x를 1x PBS로 세척하여 혈청의 모든 흔적을 제거하였다. 트립신 10 mL를 첨가하여 MDCK 세포를 트립신화하고, 세포가 분리될 때까지 20-30분 동안 5%CO2 분위기에서 37°C에서 인큐베이션한다.
      참고: 플라스크를 두드리면 뭉칠 수 있으므로 탭하지 마십시오.
    2. 세포 현탁액을 완전한 이글 최소 필수 배지 (EMEM) 2mL가 들어있는 15mL 튜브에 피펫하십시오. 원심분리(300 × g, 5분, rtp)하여 상층액을 제거하였다.
    3. 세포를 6 mL의 완전한 EMEM에 재현탁시킨다. 트리판 블루 염색에 의해 세포를 계수한다.
    4. MDCK 세포 현탁액을 1 × 105 cells/mL의 농도로 희석하고, 희석된 현탁액 1 mL를 멸균된 24-웰 플레이트의 각 웰에 시드한다. 5% CO2 분위기에서 37°C에서24 시간 동안 인큐베이션하여 각 웰에서 MDCK 세포의 합류 단일층을 얻었다.
  2. 1일차: MDCK 세포의 감염
    1. 감염 배지를 준비하십시오. 24-웰 플레이트 내의 MDCK 단층으로부터 배지를 제거하고, 1x dPBS로 2x 세척하였다. 두 번째 세척을 위해, 바이러스의 연속 희석물을 준비하는 동안 PBS를 웰에 두십시오.
    2. 바이러스 샘플을 얼음 위에서 해동하고, 24웰 플레이트에서 연속적으로 희석하여 10-1에서 10-6까지의 연속 희석을 달성한다.
      참고: 예를 들어, 24웰 플레이트의 각 웰을 270μL의 감염 배지로 채운다.
    3. 30 μL의 바이러스 샘플을 행의 첫 번째 웰에 첨가한다. 새로운 피펫 팁으로 잘 섞어서 행의 다음 웰로 옮겨 샘플을 10x 희석하십시오. 10-6 희석이 달성될 때까지 진행하십시오; 모든 바이러스 샘플에 대해 9.2.1-9.2.3단계를 수행합니다.
    4. MDCK 플레이트로부터 PBS를 제거하고, 제조된 바이러스 희석액 100 μL와 중복하여 감염시킨다. 대조군 웰의 경우, 감염 배지 100 μL를 첨가한다(바이러스 샘플 제외). 5%CO2 분위기에서 35°C에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 흔들어 15분마다 건조 반점을 제거한다.
    5. 바이러스 접종물을 제거하고 각 웰에 1 mL의 액체 오버레이를 첨가하십시오. 5% CO2 분위기에서 35°C에서72시간 동안 인큐베이션한다.
  3. 4 일째 (감염 후 72 시간) : 플라크 시각화
    1. 액체 오버레이를 제거하고, 세포를 1 h 동안 1x PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정시켰다. 포름알데히드 용액을 제거하고, 1x PBS 또는 증류수로 1회 세척한다.
    2. 고정된 세포를 1% 크리스탈 바이올렛 용액을 첨가하여 15분 동안 오염시킨다. 크리스탈 바이올렛 염료를 제거하고, 흐르는 물로 세포를 세척한다. 접시를 rtp에서 말리십시오.
    3. 일단 건조되면, 플라크를 계산하고, 다음 공식에 따라 바이러스 역가를 계산하십시오 :
      희석 계수× 플라크의 수 = 플라크의 수 - 100 μL의 형성 단위

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결과

기존의 T 세포가 바이러스 제거를 촉진하기 위해 바이러스 감염에 대한 적응 면역 반응의 주요 레퍼토리를 형성하지만, 선천적 인 T 세포 집단은 나중 단계에서 효과적인 클리어런스를 위해 바이러스 부하를 억제하기 위해 더 넓은 스펙트럼에 걸쳐 작동합니다. 따라서, 이 프로토콜은 특히 동일한 기증자로부터의 상피 및 면역 세포 샘플을 필요로 하지 않고 인플루엔자 감염 후 선천적 T 세포, 그들의 활성화 및 그들의 기능적 집단을 연구할 수 있는 강력한 조건을 생성한다. 이 프로토콜은 다른 바이러스에도 적용될 수 있지만, 정점 방출을 갖는 바이러스로 제한될 수 있지만, 즉, 어떠한 바이러스도 PBMC 구획과 접촉하기 위해 기저층으로 진입해서는 안 된다.

도 1의 대표적인 결과에 기초하여, 이 프로토콜은 3T3 피더 층에서...

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토론

바이러스에 대한 선천적 면역 반응은 항 바이러스 관리에 대한 조사가 부족한 연구 분야입니다. 기도 상피 세포와 선천적 면역 세포는 바이러스 부하가 유지되지 않을 경우 과민성 적응 반응의 결정 요인으로 작용하는 것 외에도 감염 중에 바이러스 복제를 억제하기 위해 함께 작용합니다12,13,17. 그러나, 적절한 항바이러스 반응을 부여하기 위해 선천적 면역 세포의 활성화를 조사하기 위한 상피-선천적 면역 누화의 연구를 위한 관련 인간 모델의 개발은 여전히 과제로 남아 있다. 따라서, 이러한 ALI 공동-배양 모델은 비강 상피층과 면역 세포 사이의 상호작용의 전체 숙주를 평가하는데 사용될 수 있는 다목적 기술을 나타낸다. 이 모델은 시험관 내 분화된 hNECs, 유세포 분석기를 통한 PBMC 활성화 분석 및 바이러스 감염을 결합함에 따라, 이 프로토콜의 성공을 보장하기 ...

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공개 사항

모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 hNEC 문화 및 바이러스 문화 관련 작업에 도움을 주신 NUS 이비인후과 및 미생물학 및 면역학과의 연구 직원에게 감사드립니다. 우리는 또한 연구에 필요한 세포 및 혈액 샘플을 제공하는 데 도움을 주신 국립 대학 병원, 이비인후과 국립대학 병원의 외과 의사 및 외과 팀에 감사드립니다.
이 연구는 National Medical Research Council, Singapore No.의 지원을 받았습니다. NMRC / CIRG / 1458 / 2016 (De Yun Wang까지) 및 MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan까지). Kai Sen Tan은 유럽 알레르기 및 임상 면역학 (EAACI) Research Fellowship 2019의 펠로우십 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5% Trypsin-EDTAGibco15400-054
0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), pH 8.0, RNase-freeThermofisherAM9260G0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock 튜브Eppendorf00301200861.5mL 원심분리기 튜브
10 mL K3EDTA 진공 튜브BD36664310mL 채혈 튜브
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12-웰 플레이트코닝 3513
12-웰 트랜스웰 인서트코닝 3460멤브레인 인서트
1x FACS 용해 용액BD349202
2.0 mL SafeLock 튜브Eppendorf00301200942 mL 원심분리기 튜브
24-웰 플레이트Corning 3524
24-웰 트랜스웰 인서트코닝 3470
3% 아세트산, 메틸렌 블루STEMCELL Technologies07060
3,3',5-트리요오도-l-티로닌SigmaT-074
37% 포름알데히드 용액, H2OSigma533998
5810R 원심분리기Eppendorf5811000320
5 mL 폴리프로필렌 튜브 (플로우 튜브)BD352058
70 µ m 셀 스트레이너코닝 
A-4-62 로터Eppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501해리 시약
항생제-항진균제Gibco15240-062
Avicel CL-611FMC 바이오폴리머NA액체 오버레이
Bio-Plex Manager 6.2 표준 소프트웨어Bio-Rad Laboratories, Inc171STND01멀티플렉스 매니저 소프트웨어
버터플라이 바늘 21 GBD367287
콜레라 독소시그마C8052
크리스탈 바이올렛 MerckC6158
Cytofix/Cytoperm 솔루션BD554722고정 및 투과화 솔루션
Dispase IISigmaD4693중성 프로테아제
DMEM/고포도GE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/영양 혼합물 F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP 믹스PromegaU1515dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)ATCC30-2003
EVOM 전압저항계 장치WPI, Sarasota, FL, USA300523
FACS 용해 용액BD3492021x 용해 용액
팔콘 튜브 15 mLCellStar18827115 mL 튜브
팔콘 튜브 50 mLCellStar22726150 mL 튜브
빠른 시작 필수 DNA 프로브 MasterRoche6402682001qPCR 마스터 믹스
Ficoll Paque 프리미엄연구 기기17544203밀도 그라디언트 미디어
H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 순방향 프라이머 시퀀스시그마5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 리버스 프라이머 시퀀스시그마5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 순방향 프라이머 시퀀스시그마5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 리버스 프라이머 시퀀스시그마5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'Heat
Inactivated Fetal Bovine SerumGibco10500-064
hNESPCsHuman DonorsNA
Human Epithelial Growth FactorGibco-InvitrogenPHG0314
HydrocortisoneSTEMCELL Techonologies7925중격 절곡 수술
중 코 생검에서 수집인슐린시그마I3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR 기기
라이브/데드 블루 셀 염색 키트 *UV 여기용ThermofisherL23105생존력 염색
MILLIPLEX MAP 인간 사이토카인/케모카인 마그네틱 비드 패널 II - 사전 혼합 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23면역학 다중 분석
미토마이신 CSigmaM4287
M-MLV 5x BufferPromegaM1705RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1706Reverse Transcriptase
N-2 supplementGibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Perm/Wash BufferBD554723Permeabilization 세척 버퍼
PneumaCult-ALI 10x 보충제STEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI 기초 매체STEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI 유지 보수 보충제 (100x)STEMCELL Techonologies5001
랜덤 프라이머PromegaC1181랜덤 프라이머
재조합 Rnasin Rnase 억제제PromegaN2511RNase 억제제
RNA 용해 완충액Qiagen부품 52904
RPMI 1640 (w L-글루타민)ATCC30-2001
STX2 전극WPI, Sarasota, FL, USASTX2전극
T25 플라스크코닝430639
T75 플라스크코닝430641U
TPCK TrypsinSigmaT1426
Trypan BlueHycloneSV30084.01
바이러스 RNA 추출 키트Qiagen52904바이러스 RNA 추출 키트
V자형 96웰 플레이트Corning3894
431751세포 당

참고문헌

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