스레드 색전증 방법을 통해 우수한 처상 부비동 폐색의 쥐 모델 설립

대뇌 정맥 부비동 혈전증(CVST)은 뇌졸중의 모든 원인의 0.5-1.0%만을 차지하지만 어린이와 젊은 성인^1에서상대적으로 높은 발생률을 가지는 대뇌 정맥 시스템의 희귀 질환이다. 부검 중 CVST는 뇌혈관 질환 사망 의 10%의 원인으로^{밝혀졌다 2.} 혈전증은 두개 내 정맥 시스템의 어느 부분에서나 발생할 수 있습니다. 우수한 처상 부비동 (SSS)은 CVST에서 가장 일반적으로 영향을받는 지역 중 하나이며 여러 혈관을 포함 할 수 있습니다. 정맥 부비동의 협착 또는 폐색으로 인해 두개 내 정맥 복귀가 차단되어 종종 두개 내 압력^3을증가시킵니다. CVST의 임상 표현은 복잡하고 시간이 지남에 따라 다릅니다. 증상의 특이성이 부족하지만 가장 흔한 증상으로는 두통(77.2%), 발작(42.7%), 신경결핍(39.9%)이 가장 많다. 심한 경우에는 혼수 상태에, 심지어 사망까지^4,5가발생할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 의료 및 건강 기준및 공중 보건 의식의 전반적인 개선으로 인해 관련 위험 요소의 비율이 변경되고 외상 및 감염의 비율이 감소했으며 임신, 푸에페리움, 경구 피임약 및 기타 이유로 인한 CVST의 비율이 점차^{증가하여 5.}

현재 CVST의 발병은 아직 잘 이해되지 않습니다. 깊이 있는 CVST를 탐구하기 위하여는, 추가 병학 연구가 필요합니다. 그러나, 이러한 연구 방법의 대부분은 침략 적이 고 임상적으로 구현 하기 어려운. 임상 연구의 많은 한계로 인해 동물 모델은 기본 및 번역 연구 측면에서 대체할 수없는 장점이 있습니다.

CVST의 원인은 초기 발병이 종종 인식되지 않고 혈전 형성의 위치가 매우 가변하기 때문에 복잡합니다. 다행히도 동물 모델은 이러한 요인을 더 잘 제어 할 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 다양한 CVST 동물 모델이 설립되었으며 각 모델에는 고유한 단점이 있습니다. 다른 생산 방법에 따르면, 그들은 대략 다음과 같은 범주로 나눌 수 있습니다 : 간단한 SSS-리그레이션 모델^6,7; SSS 내부 사출 가속기 모델^8; 페리-염화물 유도 SSS 혈전증 모델^9; 광화학 유발 SSS 혈전증^모델(10); 및 자수색전성-폐색S^모델(11) 그러나, 이 모형의 대부분은 동물의 대뇌 피질에 침략적인 손상을 회피할 수 없습니다 정확하게 허혈성 시간 및 위치를 통제할 수 없습니다. 일부 모델에서는, 혈전은 자발적으로 재canalize 것입니다; 다른 모델에서는 SSS가 영구적으로 가려집니다. 또한 복잡한 수술 및/또는 심각한 부상은 이러한 모델의 후속 병리학 적 발견에 영향을 미칠 수 있습니다.

본 연구에서는 스프라그-Dawley(SD) 쥐의 SSS에 스레드 플러그를 삽입하여 손상을 최소화하고 정밀한 제어기능을 가능하게 하며 안정성이 좋은 CVST 모델을 성공적으로 확립했습니다. 또한, 작은 동물 자기 공명 영상 (MRI) 및 레이저 반점 혈류 이미징모델의 효과를 확인하기 위해 결합되었다. 우리는 우리의 모형의 설치 전후에 대뇌 혈류량에 있는 변경을 평가하고, CVST의 발생, 발달 및 관련 병리생리학 기계장치를 탐구하는 추가 연구 결과를 위한 기초를 마련하는 우리의 모형의 안정성을 평가했습니다.

동물 과목과 관련된 절차는 원저우 의과 대학의 의료 규범 및 윤리위원회에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 사용 및 치료에 대한 중국 법률에 따라.

1. 스레드 플러그, SD 쥐 및 실험 장비의 준비

1. 직경 0.28mm의 나일론 실을 스레드 플러그의 본체로 사용합니다.
   참고: 나일론 실의 부드러움과 경도는 적당해야 합니다.
2. 나일론 실의 한쪽 끝을 실리콘 소재로 덮습니다. 실 플러그의 실리콘 부분의 길이는 약 1.2cm이며 직경은 약 1.2 mm입니다. 헤드 엔드는 테이퍼되고 실리콘 부분은 원통형입니다. 5-7cm를 더 예약하십시오. 나일론 실은 클램프가 용이하며 작업 후 특정 요구에 따라 절단 할 수 있습니다.
3. 75%에탄올을 사용하여 작업 전에 3분 동안 스레드 플러그를 담그고 연결하기 전에 일반 식염수로 잔류 에탄올을 헹구십시오.
4. 280에서 320 g 사이 무게 12 남성 SD 쥐를 선택 하 고 무작위로 샴 그룹 및 실험 그룹으로 분할 (n = 6 그룹 당). 환경 적응의 주 후, 12 시간 동안 쥐를 빨리 하고 작업 전에 4 시간 동안 그들을 박탈.
5. 실험에 필요한 다음과 같은 실험 장비를 준비 : 작은 동물 마취 기계, 뇌 입체 계측기, 해부 현미경, 고속 두개골 드릴, 가위, 핀셋, 혈관 집게, 바늘 홀더, 바늘 스레드, 2 mL 주사기, 레이저 반점 혈액 흐름 이미징 시스템, 및 작은 동물 MRI.

2. 스레드 색전화를 통한 SD-쥐 SSS-색전화 모델 의 건설

1. SD 쥐를 마취 유도 상자에 넣고 작은 동물 마취 기계를 사용하여 4 % 이소플루란을 전달하여 마취를 유도합니다. 그 후, SD 쥐의 뒷다리와 발가락이 적당한 꼬집어 반응하지 않는다는 것을 확인하기 위해 집게를 사용합니다.
2. 신속하게 뇌 입체 장치에 경향이 위치에 SD ratwith 면도 상단 머리를 수정합니다. 마취를 1.5-2.0% 이소플루란(0.5L/min의 속도로)으로 유지하고 호흡률을 40-60/분으로 안정화시킵니다. 37±0.2°C에서 가열 패드를 통해 쥐의 체온을 안정화합니다.
   1. 쥐가 입체 프레임에 놓인 후 멸균 안과 안증을 바르면 각막이 마취 중에 건조되지 않도록 보호하십시오.
3. 쥐의 머리 꼭대기의 표면을 살균하여 5% 포비도요오드를 75%에탄올로 세 번 번 다. 머리 중간에 피부 절개(길이 2.0cm)를 만든 다음 상단 근막과 골막을 조심스럽게 벗겨 두개골을 완전히 노출시합니다.
   1. 전방 폰타넬, 후방 폰타넬, 관상 봉합사, 처탈 봉합사 및 헤링본 봉합사의 위치를 확인합니다.
4. 관상 봉합사와 헤링본 봉합사 사이의 영역을 혈류 관측 영역으로 사용합니다. 두개골이 레이저 반점 혈류 이미징 중에 관찰에 영향을 미치지 않도록 혈관이 명확하게 보일 때까지 관찰 영역에서 두개골을 얇게 합니다. 얇게 썬 두개골의 크기는 약 1.0cm × 1.0cm여야 합니다. 이 단계와 다음은 모두 해부 현미경으로 수행됩니다.
   1. 두개골 연삭 동안, 대뇌 피질에 고온 화상을 방지하기 위해 반복적으로 드릴을 헹구기 위해 정상 온도 식염수식을 사용합니다.
5. 고속 드릴을 사용하여 브레그마를 중심으로 한 6.0mm x 4.0mm 뼈 창 내에서 두개골을 갈아서 bregma 영역의 SSS를 노출시킵니다.
   1. 일반 식염수로 연마 하는 동안 두개골을 냉각. 두개골이 얇아지면 핀셋을 사용하여 SSS를 찢지 않도록 나머지 뼈 조각을 조심스럽게 제거하십시오.
6. 적합한 스레드 플러그를 선택하고 SSS bregma 점을 플러그 포인트로 사용하고 2 mL 주사기 바늘로 조심스럽게 구멍을 뚫고 스레드 플러그 헤드를 플러그 포인트에 신속하게 삽입하십시오.
   1. 이때 스레드 플러그 헤드의 끝과 SSS 사이의 각도는 약 30-45°여야 합니다. 그런 다음 스레드 플러그의 끝과 SSS 사이의 각도를 0-10도로 조정하고, 머리가 부비동 합류의 후면 가장자리에 도달할 때까지 SSS를 천천히 중앙에 삽입합니다. 그 후, 꼬리의 과잉 부분을 잘라.
      참고: SSS가 천명될 때 급속한 출혈이 발생할 수 있습니다. 스레드 플러그의 끝을 한 번에 플러그 포인트에 빠르게 삽입할 수 없는 경우 작은 거즈 또는 면공을 사용하여 플러그 포인트를 부드럽게 누르고 천천히 아래로 미끄러져 플러그 포인트를 조심스럽게 노출한 다음 와이어 볼트의 끝을 SSS에 신속하게 삽입합니다. 나사 플러그를 삽입한 후 플러그 포인트에 출혈이 있는 경우 젤라틴 스폰지와 같은 혈전성 물질을 사용하여 출혈을 막을 수 있습니다.

3. SD 쥐의 뇌 표면에 혈류의 검출

1. 레이저 광원을 사용하여 혈류 관측 영역을 균일하게 비춥시다. 반사된 라이트는 카메라에 의해 수집되고 분석을 위해 컴퓨터로 전송됩니다. 레이저 반점 혈류 이미징 시스템에 대한 다음 매개 변수 설정을 사용하십시오: 파장: λ = 785 nm; 및 이미지 노출 시간 : T = 10 ms.
2. SD-쥐 혈류 관측 영역을 레이저 반점 혈류 영상 시스템의 시야로 중앙화하고 2분 동안 뇌 표면의 혈류를 지속적으로 모니터링합니다. 각 SD 쥐에 대한 색전화 전후의 혈류 데이터를 수집하고 처리하고, 관찰된 영역의 레이저-반점 혈류 맵을 획득한다.
3. 수술된 부위를 일반 식염수로 반복적으로 헹구어 뼈 파편과 잔류물을 씻어낸다. 피부를 봉합 (0# 스레드) 요오도프로 소독.
4. 쥐가 수술 후 깨어날 때까지 체온을 유지한 다음 음식과 물이 제공된 단일 케이지에 보관하여 광고 리비텀을제공한다. 가짜 그룹을 연결할 수 없습니다.
5. 데이터 수집이 완료되면 사후 처리를 수행합니다.
   1. 레이저-반점 혈류 이미징 시스템 소프트웨어에서 제공하는 도구를 통해 관심 영역(ROI)의 완전한 선택. 얻어진 값은 ROI의 평균 혈류 값이며, 국색화 전후의 국소 뇌-혈류 값이다. 색전화 전에 혈류 값을 기준값으로 사용합니다.
   2. 4개의 ROI를 선택하고 기준선 값에서 백분율 변경으로 표현된 각 ROI에 있는 대뇌 혈류에 있는 상대적인 변경을 측정합니다.

4. 작은 동물 MRI에 스레드 위치감지

1. MRI 이미징 시스템에 대한 다음 T2 가중 이미징(T₂WI) 매개변수를 사용합니다: 에코 시간(TE) = 33ms, 반복시간 (TR) = 3000 ms, 여기개통 수 (NEX) = 4, 슬라이스 = 28, 슬라이스 두께 = 0.8 mm, 매트릭스 크기 = 256 *256 mm^2,플립 각도 = 80 ° 시야 (FOV) = 30 *30mm^2,스캔 시간 = 6 분 24 s; 자기 공명 혈관 조영술 (MRA) 매개 변수는 다음과 같이 설정되었다 : TE = 4.4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, 슬라이스 = 80, 슬라이스 두께 = 0.4 mm, 매트릭스 크기 = 256 *256 mm^2,플립 각도 = 80 °, FOV = 30 *^30mm2, 스캔 시간 16 = 23 ms.
2. MRI 스캐닝 테이블에 동물을 고정하고, 스캔을 배치하여 뇌 위치를 보정하고, 위치를 확인한 후_T2WI 및 MRA 서열 스캐닝을 수행합니다.
3. 검출 하는 동안 동물 마취 기계를 통해 연속 마취를 사용 합니다. 그런 다음 과도한 펜토바르비탈의 회복내 주입으로 SD 쥐를 안락사시킵니다.
4. 이미지 수집 및 후처리: 이미지 데이터를 수집한 후, SSS에서 나사 플러그의 상태를 보다 명확하게 관찰하기 위해, 쥐 뇌의_T2WI 이미지를 표시하는 의사 색 향상 방법을 사용한다.

봉합방법을 통해 SD-랫트 SSS-혈전증 모델을 확립하려면 봉합사(도1A)를사전에 제조해야 하며, 실험에 필요한장비(도 1B)를준비해야 한다. 수술의 섬세한 특성으로 인해 모델의 준비는 해부 현미경으로 완료되어야합니다. 주요 단계는 그림 2에표시됩니다. 모델의 혈류 관찰의 특정 세부 사항에 대한 설명을 용이하게 하기 위해 도 3B는 혈류 관측 영역, 뼈 창 및 플러그 점을 표시하고 SSS(도3C)에삽입된 나사 플러그의 상태를 나타낸다. 모델의 제조가 완료된 후, 레이저-반점 혈류 영상은 SD 쥐의 뇌 표면의 혈류를 검출하는 데 사용된다(도4A,B). 도 4C는 SSS 및 교량 정맥(BV)의 혈류가 중간 뇌동맥(MCA) 및 모세혈관(CAP)에 비해 현저히 감소되었다는 것을 보여준다. 다음으로, 소형 동물 MRI는 수평위치(도 5A),처진 위치(도5B),및 관상 위치(도5C)로부터SSS의 나사 플러그 상태를 검출하는 데 사용된다. 이미지는 스레드 플러그가 제자리에 있음을 보여 주며 SSS의 색전화를 확인합니다.

그림 1. 스레드 색전증 및 실험 조건의 그림. (A)자체 수제 실 색전증의 이미지 (a : 스레드 색전증 머리, b : 스레드 - 색전증 몸). 스케일 바 = 5mm.(B)본 실험에 필요한 주요 장비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. SD-랫트 SSS-혈전증 모델의 주요 단계. (A)성공적인 마취를 확인하기 위해 집게로 SD 쥐의 뒷다리의 발가락을 고정합니다. (B)스테레오탁스 장치에 SD 쥐를 고정하고 머리 의 상단에 표면을 살균. (C)피부를 잘라냅니다. (D)상단 근막과 음막막에서 벗겨 내고 두개골을 완전히 노출시니다. (E)혈관이 명확하게 볼 때까지 뼈 창의 관찰 영역과 두개골을 드릴 및 연마합니다. (F)SSS를 찢지 않도록 집게로 뼈 창의 뼈 조각을 조심스럽게 제거합니다. (G)적합한 스레드 플러그를 선택합니다. (H)주사기 바늘을 사용하여 플러그 포인트를 관통하고 나사 플러그를 신속하게 삽입합니다. (I)스레드 플러그와 SSS 사이의 각도를 조정합니다. (J)봉합사를 천천히 삽입합니다. (K)팁이 부비동 합류의 후면 가장자리에 도달할 때까지. (L)두피를 봉합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. SD 쥐의 관찰 및 작동. (A)SD 쥐의 상부 두개골의 해부학적 랜드마크가 SSS의 위치를 용이하게 하기 위해 표시하였다(a: 브레그마, b: 후방 브레그마). (B)빨간색 둥근 직사각형 영역은 혈류 관찰 영역이며, 파란색 둥근 직사각형 영역은 뼈 창이다. 빨간색 원형 영역은 플러그 포인트이며 화살표는 우수한 처상 부비동을 가리킵니다. (C)플러그 포인트(파란색 화살표)에서 SSS에 삽입된 플러그의 상태. 흰색 화살표는 플러그의 본문을 가리키고 빨간색 화살표는 스레드 헤드를 가리킵니다. 스케일 바 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 스레드 색전증 삽입 전후의 혈류를 비교합니다. 레이저 반점 혈류 는 색전 후 SD 쥐(A)및(B)의뇌혈량의 이미징. 오른쪽의 파란색-빨간색 컬럼은 작은 에서 큰 혈액 흐름 값의 범위를 나타냅니다. (A)선택된 ROI가 표시됩니다(a: SSS, b: BV, c: MCA, d: CAP). (C)상대대뇌 혈류(CBF)의 바 그래프가 나타났다. 분산의 단방향 분석은 SSS 및 BV (# P <0.001 대 MCA 및 CAP; * P <0.001 대 MCA 및 CAP)의 혈류가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. MRI 확인 결과. 소형 동물 MRI는수평(A), 처진(B),및 관상(C) 위치에서 SSS에서나사 플러그(검화로표시)의 상태를 나타낸다. 스케일 바 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: CVST 동물 모델의 단점.

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.