인간 중간엽 줄기 세포의 척추강 내 주입 및 쥐 뇌로의 이동 추적

요약

중간엽 줄기세포(MSC)를 뇌에 전달하기 위해 여러 투여 경로를 사용할 수 있습니다. 본 연구에서 MSC는 척추강 내 주사를 통해 신경축과 뇌 전체에 전달되었습니다. MSC를 쥐의 척추강에 주입하고 줄기세포 이동을 추적하고 정량화했습니다.

초록

중간엽 줄기세포(MSC)는 다양한 질병의 치료를 위해 연구되어 왔습니다. 뇌와 척수 모두에 결손이 있는 신경퇴행성 질환의 경우, MSC는 뇌와 척수 모두로 이동해야 하기 때문에 투여 경로가 매우 중요합니다. 이 논문은 쥐 모델에서 뇌와 척수를 표적으로 할 수 있는 MSC를 척추관에 투여하는 방법(척추강 내 주사)을 설명합니다. 100만 개의 MSC를 요추 2-3 수준에서 쥐의 척추관에 주입했습니다. 투여 후, 쥐는 주입 후 0, 6 및 12 시간에 안락사되었습니다. 주입된 MSC를 추적하기 위해 광학 이미징 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용했습니다. 본 연구의 결과는 척추강을 통해 투여된 MSC가 12시간에 뇌와 척수 모두에서 검출될 수 있음을 보여주었습니다. 척추강 내 주사는 전신 마취가 필요하지 않고 부작용이 거의 없다는 장점이 있습니다. 그러나 MSC가 뇌로 이동하는 속도가 낮다는 단점은 극복해야 합니다.

서론

중간엽 줄기세포
질병 상태에서 MSC는 부분비 작용¹을 통해 면역 반응을 조절하고 손상된 조직을 회복시키며 독성 물질을 제거하는 것으로 보고된 질병 특이적 치료 물질2을 분비^합니다. 따라서 MSC 요법은 알츠하이머병 및 근감소증과 같은 다인자성 질환을 치료하는 데 단일 표적 요법보다 더 효과적인 것으로 간주됩니다 3,4,5,6. 또한, 의약품과 달리 MSC는 체내 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 인식하여 손상된 조직 부위로 이동하는 원점 복귀 효과가 있습니다 ^7,8. 불행히도, 세포의 하위 집합 만이 손상된 영역에 도달하고 마이그레이션 중에 MSC의 생존력이 감소합니다^{9 , 10}

프로토콜

참고: 본 연구는 삼성서울병원 삼성바이오메디컬연구소(SBRI) 동물관리위원회(승인번호: 20170125001, 일자: 2017년 1월 25일)의 승인을 받았습니다. 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 공인 시설인 SBRI는 실험실 동물 자원 연구소(Institute of Laboratory Animal Resources)에서 정한 지침에 따라 행동합니다.

1. 인간 Wharton's jelly 유래 MSC의 제조

1. 인간 와튼 젤리 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSCs) 배양
   1. 인간 WJ-MSC 바이알을 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다. WJ-MSC를 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포의 부피(v/v)의 10배 이상의 부피로 성장 배지를 추가합니다. 세포를 현탁시키기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다.
   2. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 조심스럽게 버리고 세포를 다시 현탁시킵니다.
      알림: 셀 펠릿을 버리지 않도록 주의하십시오.

결과

MSC의 척추강 내 주사의 효능을 평가하기 위해 본 연구에서는 DiD 표지 MSC를 사용했습니다. MSC를 척추강에 주입하기 전에 광학 이미징 및 형광 현미경을 사용하여 in vitro에서 라벨링 효능을 평가했습니다(그림 1). 프로토콜 섹션 3.1에 설명된 절차를 사용하여 DiD 라벨링 시약으로 MSC를 염색한 후, DiD 라벨링된 MSC가 파종된 배양 플레이트의 광학 이미지를 촬영했습니다(그림 1A). DiD 표지된 MSC(+DiD)는 빨간색으로 표시됩니다. DiD 염료로 표지되지 않은 나이브 MSC(-DiD)는 양성 신호를 나타내지 않았습니다. 이 결과는 형광 현미경을 사용하여 확인되었습니다(그림 1B). MSC는 또한 모양을 시각화하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)으로 염색되었습니다. Naive MSC(-DiD)는 파란색으로 나타나 DAPI 또는.......

토론

MSC를 치료하기 위한 최적의 투여 경로는 대상 질환, 환자의 상태 및 투여할 약물의 유형에 따라 선택해야 합니다. MSC 요법을 포함한 세포 치료에서는 줄기세포가 BBB를 통과할 수 없기 때문에 줄기세포를 뇌에 직접 주입하거나 뇌척수액을 통해 세포내 주입을 고려해야 합니다¹⁹. 척수강 내 주사는 상대적으로 비침습적이며, 뇌내 주사와 달리 뇌에 신경 손상을 일으키지 않으며, 부작용의 위험이 낮다는 것을 알 수 있다²⁰. 요추 천자를 통해 CSF에 접근하는 것은 임상 현장에서 매우 쉽게 수행할 수 있는 절차입니다. 그러므로, 줄기세포, 약물, 조영제 또는 기타 물질을 척추강 내 주사를 통해 환자에게 투여하는 것은 어렵지 않다 23,24,25.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	세포 배양
태아 소 혈청	biowest	S1520	배양 배지 보충제
겐타마이신	Gibco-invitrogen	15710-072	배양 배지 보충제
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA 분리
MEM, 글루타민 없음, 페놀 레드	없음Gibco	51200038	WJ-MSC 주입 Fomulation
Miminum Essential Medium 알파	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC 배양 배지
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	정량 real-time PCR 시약
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo fisher	4485694	정량 real-time PCR
트리판 블루	Gibco	15250061	주입
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