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방법 논문

에코HIV 뇌 감염의 쥐 모델

3.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62137

⸱

2021년 1월 21일

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 키메라 HIV (EcoHIV)를 사용하여 활성 HIV 감염의 새로운 쥐 모형을 설치하는 프로토콜을 제시합니다, 두뇌에 있는 HIV-1 바이러스 성 저수지의 우리의 이해를 강화하고 HIV 관련 신경 인지 장애 및 관련 comorbidities를 공부하는 시스템을 제공하는 것을 위해 중요합니다 (즉, 약물 남용).

초록

EcoHIV 감염 마우스 모델은 HIV 관련 신경 학적 합병증을 조사하는 데 중요한 유틸리티라는 것을 잘 연구되었습니다. 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 대 한 EcoHIV 감염 된 쥐 모델의 설립, neuroHIV와 HIV-1 관련 된 신경 인지 장애의 연구에 도움이 될 것 이다 (HAND). 본 연구에서는, 우리는 키메라 HIV (EcoHIV)를 사용하여 활성 HIV 감염의 쥐 모델의 성공적인 생성을 보여줍니다. 첫째, 에코HIV의 렌티바이러스 구조는 48시간 동안 배양된 293FT 세포로 포장되었다. 이어서, 조건부 배지는 농축되고 흐트러졌다. 다음으로, 우리는 F344/N 쥐 뇌 조직에 EcoHIV-EGFP의 양측 스테레오택시 주사를 수행했습니다. 감염 후 1주일 후, EGFP 형광 신호가 감염된 뇌 조직에서 검출되어 EcoHIV가 쥐에서 활성 HIV 감염을 성공적으로 유발한다는 것을 나타냅니다. 또한, 마이크로글리아세포 마커인 Iba1에 대한 면역염색이 수행되었다. 결과는 microglia가 EcoHIV를 품고 있는 우세한 세포 모형이었다는 것을 표시했습니다. 더욱이, EcoHIV 쥐는 감염 후 8 주 동안 HAND의 잠재적 기본 신경 행동 메커니즘뿐만 아니라 시간 적 처리에 변화를 나타냈다. 종합적으로, 본 연구는 뇌의 HIV-1 바이러스 저장소뿐만 아니라 HAND 및 약물 남용과 같은 관련 comorbidities를 연구하는 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 쥐에 HIV-1 감염의 EcoHIV 모델을 확장합니다.

서론

생물학적 시스템은 HIV-1 관련 신경인지 장애(HAND)와 그 근본적인 신경 메커니즘2에대한 우리의 이해를 향상시켰습니다. 어떤 생물학적 시스템이 어떤 연구에 가장 적합한지 결정하는 것은 종종 관심2의문제에 달려 있습니다. 숙주 동물 모델의 범위의 제한은 HIV-1 질병 발달의 연구에 도전합니다. HIV-1 바이러스 복제 및 병인을 조사하기 위해, Potash 외3은 활성 HIV-1 감염의 마우스 모델을 생성하여 HIV 표면 봉투 당단백질, gp120의 코딩 영역을 에코트로픽 MLV gp80으로 대체하여 마우스4에서성공적인 바이러스 복제를 이끌어 냈다. 키메라 HIV(EcoHIV) 마우스에서 꼬리 정맥 주사 후, HIV-1 혈청 양성 개인(예를 들어, 감염된 림프구 및 대식세포, 항바이러스 면역 반응, 염증3,5,6)과유사한 많은 특성이 관찰되었다.

마우스와 쥐는 모두 무리대의 구성원이지만, 근본적인 종 차이는 특정 실험 질문에 대한 적합성에 영향을 미칠 수 있습니다7. 따라서, 쥐에 에코 HIV 감염 모델의 확장 (일반적으로 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 사용) neuroHIV의 연구에서 유리 할 것 이다. 예를 들어, 그들의 큰 크기는 약물 자가 투여 절차에 대한 경정맥 카테터 이식을 보다 실용적으로8. 쥐의 약물 자가 투여 기술은 HIV-19의동기 부여를 평가하기 위해 활용되었습니다. 또한, 많은 신경 인지/행동 작업은 처음에 쥐를 위해 설계 되었다10. 여기에서, 우리는 EcoHIV 감염 모형을 확장하고 neuroHIV 및 HAND와 관련있는 새로운 질문을 해결하기 위하여 중요한 기회를 마련하기 위하여 쥐에 있는 EcoHIV의 입체 주사의 활용을 보고합니다.

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프로토콜

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다 (연방 보증 번호 : D16-00028). 6 명의 성인 남성 F344 /N 쥐는 12/12 빛 아래 통제 된 환경에 수용 되었습니다: 음식과 물에 광고 리비툼 액세스 와 어두운 주기. 모든 동물은 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에서 건강의 국립 연구소에 의해 설립 된 지침을 사용하여 돌보았습니다.

1. 293 FT 셀의 바이러스 포장

  1. DMEM을 가진 75cm2 플라스크를 코팅한 젤라틴293 FT 셀(5×10 5/mL)을 배양하고 10% FBS11을갖는다. 37°C에서 세포를 50% 수축시 로 성장시다.
  2. 1.5mL 마이크로 원심분리기 관및 3s의 소용돌이에서 중간(예: Opti-MEM)의 750 μL에서 22.5 μL의 형질 전환 시약(예: 리포펙타민 3000)을 희석시희석한다.
  3. 에코HIV 플라스미드 DNA 의 20 μg를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 750 μL의 배지를 희석하고 잘 섞는다.
  4. 희석된 DNA를 희석된 트랜스페션 시약의 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
  5. 혼합물을 75cm2 플라스크에 미리 데워진 DMEM 배지의 10mL에 첨가한다. 37°C에서 2일 동안 세포를 배양한다.
  6. 포장 된 렌즈 바이러스를 포함하는 두 플라스크에서 조건부 배지24 mL을 수확하고 결합하십시오.
  7. 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 500 x g에서 조건부 배지 의 24mL 을 모두 분리합니다. 멸균 50 mL 튜브에 명확한 상체를 전송합니다.
  8. 렌티-x 농축기 8mL과 24mL의 명확한 상류체(1:3 비율)를 결합합니다. 부드러운 반전으로 섞으세요. 2 일 동안 4 °C에서 혼합물을 배양하십시오.
  9. 원심분리기 혼합물은 4°C에서 45분간 1,500 x g에서 혼합물을 혼합합니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다.
  10. 100mM PBS의 100 μL로 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단합니다.
  11. p24 ELISA 키트를 가진 티터 바이러스 농도.

2. 에코 HIV-EGFP 바이러스 스테레오탁스 수술

  1. 3% 세보플루란을 사용하여 쥐를 마취합니다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 2.2 단계로 진행하십시오.
  2. 뇌 부위의 머리카락을 면도하고 70%에탄올과 클로르헨시딘 기반 스크럽으로 피부를 두 번 살균합니다. 스테레오탁스 장치에서 쥐를 수적으로 고정한다.
  3. 두피 미드라인을 따라 피부를 통해 절개(5-6cm)를 만듭니다.
  4. 2개의 드릴링 위치를 0.8mm 측면, 1.2mm 로스트럴에서 브레그마까지 표시하십시오. 각 두개골 위치에 구멍(직경 0.4mm)을 드릴링합니다.
  5. 10 μL 주사 주사기에 titered EcoHIV 렌즈티바이러스 용액 (1.04 × 106 TU / mL)을 채웁니다. 주사기를 스테레오탁스 장치에 고정시하십시오.
  6. 드릴링 구멍의 표면에 가까운 바늘아래로 이동합니다. 깊이 2.5mm를 측정하고 이동합니다.
  7. 0.2 μL/min의 속도로 바이러스 용액 1 μL을 주입합니다. 주사 부위 내부에 바늘을 5 분 동안 보관하십시오. 쥐 두개골 바깥에 들 때까지 바늘을 천천히 위로 움직입니다.
  8. 4-0 실크 실로 피부를 봉합합니다.
  9. 한 번 70 %에탄올로 절개를 살균. 피하 부토르페놀 (도롤렉스, 0.1 mg/kg 체중)을 피하하십시오.
  10. 쥐가 깨어날 때까지 가열 패드가있는 복구 챔버로 전송합니다.

3. 뇌 섹션의 시각화

참고: EcoHIV 바이러스 주입 후 1~8주 동안 기다립니다.

  1. 쥐를 5% 세보플루아네로 마취한다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 3.2 단계를 계속합니다.
  2. 연기 후드 내부의 척추 위치에 쥐를 고정합니다.
  3. 흉부 미드 라인을 따라 피부를 절개합니다. 다이어프램을 자르고 흉부 구멍을 엽니다.
  4. 20 G × 25mm 바늘을 왼쪽 심실에 삽입합니다.
  5. 가위로 오른쪽 아트리움을 즉시 엽니다.
  6. 5mL/분 의 속도로 사전 냉각 된 100 mM PBS의 50 mL을 perfuse.
  7. 5 mL /분의 속도로 감기 4 % 파라 포름 알데히드의 100 mL을 Perfuse.
  8. 쥐를 참수, 두피를 열고 뇌를 제거.
  9. 포식알데히드 4%로 하룻밤 사이에 포스트픽스.
  10. 뇌가 바닥까지 떠날 때까지 50mL 튜브에서 100mM PBS에서 30% 자당30%의 40mL로 뇌를 옮기십시오(약 3일).
  11. 스냅에서 2 분 동안 메틸 부타놀에서 뇌를 동결 - 80 °C.
  12. -20°C 극저온 내부의 금속 플랫폼에서 뇌 조직을 확보하십시오.
  13. 저온을 사용하여 50 μm 두께의 관상 섹션을 잘라냅니다.
  14. 미세 브러시로 뇌 슬라이스를 유리 슬라이드에 옮기십시오.
  15. 0.3mL의 안티페이드 배지에 단면을 장착하고 22mm 50mm 커버립으로 커버합니다.
  16. 유리 슬라이드를 실온에서 건조할 때까지 어둡게 유지합니다.
  17. 뇌 영역 경계와 뉴런의 형태학적 특성을 기반으로 Z 스택을 사용하여 공초점 현미경으로 표적 뉴런을 이미지합니다.
    참고: 사용된 공초점 현미경 설정은 488 nm의 파장을 사용하여 60 X (A/1.4, 오일)와 0.15 μm (핀홀 크기 30 μm, 백 투영 핀홀 반경 167 nm)의 Z 평면 간격이었습니다.

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결과

조건부 배지는 293FT 세포에 감염된 EcoHIV-EGFP의 렌티바이러스로부터 수집되었다. 다음으로, 그것은 집중 하 고 titered, 다음 스테레오로 뇌에 주입 (피 질 영역) F344/N 쥐의. 7일 후 주사 후, 쥐를 희생하고 브레그마 -4.68 mm에 이르는 관상 동맥 뇌 슬라이스에서 촬영되었다. 도 1A에서,특히 피질과 해마 규명 자이루스에서 뇌 전체에 걸쳐 중요한 EcoHIV-EGFP 신호가 있습니다. 더욱이, 이바1and EcoHIV-EGFP 프로브를 통한 이중 라벨링은 마이크로글리아가 뇌에서 에코HIV 발현을 수용하는 우세한 세포 유형이었다는 강력한 증거를제공했다(도 1B). 특히, EcoHIV-EGFP의 분포 패턴은 쥐 뇌의 미세리아의 상대적인 지역 농도(즉, 해마의 피질 및 전염자)와 일치합니다.

후속 연구에서, 우리는 HAND의 주요 측면을 모델링하기...

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토론

이 프로토콜에서, 우리는 쥐에 있는 EcoHIV 유도한 HIV 감염 모형을 설치했습니다. 구체적으로, 우리는 성공적으로 쥐 뇌에서 활성 HIV 감염을 유도 피질에 에코 HIV의 양측 스테레오테스테레오테시 주입을 설명 7 주사 후 일. Futhermore, 우리는 쥐에 있는 EcoHIV 감염이 HAND의 중요한 양상을 공부하는 좋은 생물학 시스템이 될 수 있었다는 것을 보여줍니다. 8 주 후- EcoHIV 감염, 쥐는 중요한 신경 인지 장애를 전시, 이는 NAc의 MSN에서 시간 적 처리 및 시 냅 스 기능 장애의 변화를 포함. neuroHIV 및 HAND2연구를 위한 동물 모델의 중요성을 감안할 때, 새로운 생물학적 시스템의 발달은 현장 내의 새로운 질문을 해결하는 데 유리할 수 있습니다. 칼륨 외3 먼저 마우스에서 활성 HIV-1 감염을 유도하기 위해 에코 HIV의 사용을보고했다. 구체적으로, 마우스는 테일 정맥

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공개 사항

어떤 저자도 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH 보조금 HD043680, MH106392, DA013137 및 NS100624에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
293FT 세포ThermoFisher ScientificR70007
항생제-항진균 용액Cellgro30004CI100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² 통풍 캡이 있는 직사각형 경사형 목 세포 배양 플라스크Life Technologies354488
L-글루타민, 4.5g/L 포도당 및 피루브산 나트륨이 포함된 Corning DMEMLife Technologies10013CV
커버 유리VWR637-137
드릴
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 펜치월드 정밀 기기14097
Eppendorf Snap-Cap 마이크로 원심분리기 Biopur Safe-Lock 튜브Life Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus 항균, 4-0 Polyglactin 910 봉합사, 27in. FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Hamilton 주사기Hamilton1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection 시약Life TechnologiesL3000015
Iris JunpsWorld Precision Instruments15914
Iris ScissorsWorld Precision Instruments500216
렌티바이러스 관련 p24 ELISA 키트Cell Biolabs, inc.VPK-107-5
Lenti-X 농축기TakaraPT4421-2
Opti-MEM I 감소 혈청 매체생명 기술11058021
파라포름알데히드 시그마-알드리치158127-500G
파라포름알데히드시그마P6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
SevofluraneMerritt 수의학 공급347075
입체 운동 장치Kopf Instruments모델 900
SuperFrost Plus 슬라이드Fisher Scientific12-550-154%
Vannas 가위세계 정밀 기기500086

참고문헌

  1. Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
  2. Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
  3. Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
  4. Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
  5. Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
  6. Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).
  7. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  8. Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).
  9. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).
  10. McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
  11. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
  12. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).
  13. McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).
  14. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
  15. Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
  16. Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
  17. Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).

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