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방법 논문

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization (결합된 면역염색 및 현장 혼성화를 통한 활성화된 마우스 후각 감각 뉴런 조사)

989 조회수

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DOI:

10.3791/62150

⸱

2021년 4월 11일

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 in situ hybridization과 immunofluorescence를 결합하여 마우스의 화학적 자극에 의해 활성화된 후 후각 감각 뉴런에서 발현되는 후각 및 vomeronasal 수용체 유전자를 식별합니다.

초록

동물은 화학적 의사소통에 의존하여 먹이 품질 평가에서 사용 가능한 짝짓기 파트너 또는 위협 감지에 이르기까지 관련 환경 정보를 전달하고 인식합니다. 생쥐에서 이 작업은 주로 후각 시스템과 주 후각 및 보조 후각 시스템을 포함한 기본 하위 시스템에 의해 실행됩니다. 둘 다 G-단백질 결합 수용체를 발현하는 감각 뉴런으로 채워진 말초 기관을 가지고 있으며, 비강에 도달하는 화학적 신호와 결합할 수 있습니다. 이러한 수용체의 분자적 특성은 잘 알려져 있지만 동족 특이적 리간드에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에 설명된 방법은 후각 또는 vomeronasal 수용체의 in situ hybridization 검출과 신경 세포 활성화의 마커인 인산화 리보솜 단백질 S6(pS6)의 면역검출을 결합합니다. 이 프로토콜은 후각 기관에서 감지된 정제된 또는 복잡한 화학적 자극에 한 번 노출된 후 활성화된 뉴런을 식별하기 위해 고안되었습니다. 중요한 것은 이 기술을 통해 생물학적으로 관련된 맥락에서 트리거된 뉴런을 조사할 수 있다는 것입니다. 이상적으로는 이 방법을 사용하여 후각 시스템의 분자 생물학을 조사하고 후각 행동을 연구해야 합니다.

서론

화학신호전달은 동물에게 가장 널리 퍼진 의사소통 형태입니다. 포유류의 경우, 화학적 신호의 감지는 주로 후각을 통해 매개되며, 먹이를 찾고, 가능한 짝짓기 파트너를 찾고, 잠재적인 포식자를 피하는 데 가장 중요하다 1,2,3. 생쥐의 후각 시스템은 서로 다른 하위 시스템으로 나뉘며, 각 하위 시스템은 고유한 해부학적, 생리학적, 분자적 특성을 가지고 있습니다4. 이 중 주요 후각 시스템(MOS)과 보조 후각 시스템(AOS)이 가장 널리 연구되고 더 잘 특성화되어 있습니다.

MOS는 비강에 도달하는 휘발성 화학 분자를 감지하는 데 주로 책임이 있습니다. 이것은 시스템의 감각 인터페이스인 주요 후각 상피(MOE)를 채우는 후각 감각 뉴런(OSN)에 의해 수행됩니다. 각 OSN은 수천 개의 후각 수용체(olfactory receptor, OR) 중 하나를 단일유전자(monoogenic) 및 단일대립형(monoallelic) 방식으로 발현합니다5. 더욱이, OR은광범위하게 조정되는 경향이 있으며6, 단일 냄새 물질이 하나 이상의 OR에 결합하여 냄새에 대한 조합 코드7를 생성할수 있습니다.

차례로 AOS는 주로 페로몬 및 카이로몬 감지를 담당합니다. 이 리간드는 보메로나스 기관(VNO)에서 보메로나스 감각 신경(vomeronasal sensory neuros, VSN)을 활성화합니다. VNO의 정점 영역에 있는 VSN은 vomeronasal receptor 1 family (V1Rs)8의 수용체를 발현하는 반면, basal zone의 뉴런은 vomeronasal receptor 2 family (V2Rs)9를 발현합니다. 중요한 것은, 일부 VSN은 하나 이상의 보메로나살 수용체(vomeronasal receptor)를 동시 발현한다는 것이 밝혀졌다 10,11,12.

OR과 VR의 분자 특성에 대한 모든 정보에도 불구하고 동족 리간드에 대한 지식은 여전히 매우 제한적입니다. 분자 또는 복잡한 자극의 감지를 담당하는 특정 후각 뉴런을 식별하는 것은 후각, 후각 주도 행동 및 생리적 반응을 조사하는 사람들에게 중요한 작업입니다. 후각 수용체를 탈고화하기 위해 칼슘 이미징7, 단세포 RNA 염기서열분석13,14, 이종 수용체 발현15, 즉각초기 유전자(IEG)16에 기반한 전략 등 여러 가지 전략이 시도되었습니다. 보다 최근에는 생체 내 칼슘 이미징 (in vivo calcium imaging)17,18 및 형광 단백질 표지 단일 세포 RNA 시퀀싱 전략19을 사용하여 감각 뉴런에서 냄새 물질의 조절 효과를 평가하기 위해 몇 가지 기술이 사용되었습니다. 이러한 기술의 대부분은 인위적인 설정을 요구하거나 해리된 뉴런에서 수행되기 때문에 사용된 냄새에 의해 유발된 행동을 동시에 평가할 수 없습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 특정 ORs 또는 VR을 검출하는 리보프로브와 뉴런 활성화의 대용물인 인산화된 S6 리보솜 단백질(pS6)의 면역검출을 결합하여 냄새 노출의 단일 이벤트 후에 활성화된 감각 뉴런을 식별할 수 있도록 합니다. 이 방법은 생물학적으로 관련된 맥락에서 다양한 화학 신호에 의해 활성화되는 감각 뉴런의 정체성을 조사하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

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프로토콜

동물 절차는 연방 국가 동물 실험 통제 위원회(CONCEA)에서 제정한 지침을 따르는 캄피나스 대학(생물학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 - 연구 내 동물 사용 윤리 위원회)의 승인을 받은 동물 프로토콜 #1883-1에 따라 수행되었습니다.

1. 재료 준비

  1. 1x PBS에 3% H2O2 (v/v) 1L를 준비합니다. 100mL 10× PBS 및 100mL의 30% H2O2 를 500mL의 초순수에 희석합니다. 초순수로 볼륨을 완성하십시오. 사용하기 직전에 이 용액을 준비하십시오.
  2. 5× SSC 용액에 적신 보푸라기가 없는 실험실용 물티슈 조각이 들어 있는 가습 챔버를 준비합니다.
  3. 혼성화 세척 용액 준비: 5× SSC(55°C에서), 2× SSC(55°C), 0.2× SSC(55°C) 및 0.1× SSC(55°C 및 실온). 적절한 부피의 20× SSC 원액을 RNase가 없는 초순수에 용해시킵니다. 각 실험을 시작하기 전에 희석된 용액을 새로 준비합니다.
  4. 면역조직화학 차단 용액 준비: 1× PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100. 100 mL의 경우, 10 mL의 초순수 70 mL에 10× PBS 10 mL, 10 % BSA 10 mL 및 3% Triton X-100 3.33 mL를 희석합니다. 초순수로 볼륨을 완성하십시오. 각 실험을 시작하기 전에 희석된 용액을 새로 준비합니다.
  5. PTw 용액 준비: 1× PBS/0.1% Tween-20. 100mL의 경우 10% Tween-20 1mL와 10× PBS 10mL를 초순수 70mL에 희석합니다. 초순수로 볼륨을 완성하십시오. 각 실험을 시작하기 전에 이 용액을 새로 준비하십시오.
  6. RNase가 없는 0.1M 트리에탄올아민 용액을 준비합니다. 250mL의 경우 RNase가 없는 초순수 200mL에 시약 등급 트리에탄올아민 3.33mL를 교반하여 희석합니다(이 용액을 준비할 때 RNase가 없는 유리 용기 및 자기 교반기 사용). HCl로 pH를 8.0으로 조정합니다. RNase가 없는 초순수로 부피를 채우고 사용할 때까지 빛으로부터 보호하여 보관하십시오. 각 실험을 시작하기 전에 이 용액을 새로 준비하십시오.
  7. 1× PBS에서 RNase-free 0.1% H2O2 (v/v)를 준비합니다. 1 L의 경우 RNase가 없는 초순수 500mL에 10× PBS 100mL와 30% H2O2 3.3mL를 희석합니다. RNase-free 초순수로 부피를 완성합니다. 사용하기 직전에 이 용액을 준비하십시오.
  8. 다음의 RNase-free 용액을 준비합니다: 0.2 M HCl; 1M 트리스-HCl pH 8.0; 10 mg/mL 효모 tRNA; 10% SDS; 10× PBS; 100× Denhardt의 솔루션; 20× 증권 시세 표시기; 50% 덱스트란 설페이트; 6 M HCl
  9. RNase-free 4% 파라포름알데히드 고착 용액을 준비합니다. 100mL의 경우 파라포름알데히드 4g을 1×PBS 80mL에 용해시킵니다. 10M NaOH로 pH를 7.4로 조정합니다. 1× PBS로 볼륨을 완성합니다. 이 용액은 각 실험을 시작하기 전에 새로 준비해야 합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 흡입할 경우 잠재적으로 해를 끼칠 수 있는 유해 물질입니다. 흄 후드 아래에 용액을 준비하고 보호 장갑, 마스크 및 보안경을 착용하십시오.
  10. RNase-free 해부 용액 준비: 30% 자당/0.45M EDTA pH 8.0/1× PBS. 100mL의 경우 RNase가 없는 0.5M EDTA pH 8.0 60mL에 자당 30g을 용해합니다. 10× PBS 10mL를 추가합니다. RNase가 없는 0.5M EDTA pH 8.0으로 부피를 완성합니다.
  11. RNase가 없는 유리 또는 플라스틱 눈금이 매겨진 실린더와 비커를 준비합니다.
  12. RNase-free 사전 혼성화 및 혼성화 용액 준비: 50% 탈이온화 포름아미드(v/v)/600mM NaCl/200μg/mL 효모 tRNA/0.25% SDS(w/v)/10mM Tris-HCl pH 8.0/1× Denhardt's solution/1mM EDTA pH 8.0/10% 덱스트란 설페이트(w/v). 눈금이 매겨진 실린더에 10mL의 경우 5mL의 탈 이온화 포름 아미드, 1.2mL의 5M NaCl, 200 mg/mL 효모 tRNA 200 μL, 250 % SDS 10 μL, 100 M Tris-HCl pH 8.0 1μL, 200 μL의 50× Denhardt 용액, 20 μL의 500 mM EDTA pH 8.0 및 2 mL의 50 % 덱스트란 설페이트 (MW 500,000). RNase-free 초순수로 부피를 완성합니다. 각 실험을 시작하기 전에 이 용액을 새로 준비하십시오.
    참고 : 덱스트란 황산염은 점성이 매우 높습니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 hybridization/pre-hybridization 용액의 총 부피의 20%를 추가로 준비하는 것이 좋습니다. 효모 tRNA는 원하는 경우 사전 혼성화 용액에서 생략될 수 있습니다.
  13. 열가소성 실험실 필름 커버 슬립을 준비합니다. 현미경 슬라이드의 길이와 너비보다 1-2mm 짧게 직사각형 열가소성 실험실 필름 조각을 자릅니다.
  14. TN 완충액 준비 : 100 mM Tris-HCl / 150 mM NaCl. 100mL의 경우 10mL의 초순수에 1M Tris-HCl pH 7.5 및 3mL의 5M NaCl을 70mL로 희석합니다. 초순수로 볼륨을 완성하십시오. 각 실험을 시작하기 전에 이 용액을 새로 준비하십시오.
  15. TNB 블로킹 버퍼 준비: TN Buffer에서 0.5% 블로킹 시약 A(w/v). 200mL의 경우 TN 버퍼 200mL에 차단 시약 A 1g을 용해합니다(차단 시약 A의 상업적 공급원은 재료 표 참조).
  16. TNT 완충액 준비: TN 완충액에 0.05% Tween-20. 1L의 경우 950mL의 TN 완충액에 5mL의 10% Tween-20을 희석합니다. 거품이 발생하지 않도록 TN 완충액으로 볼륨을 천천히 완성하십시오. 각 실험을 시작하기 전에 이 용액을 새로 준비하십시오.
  17. Tyramide-Alexa 488 작업 솔루션 준비: 1× 증폭 버퍼 A/0.0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 488. 100 μL의 경우, 0.15% H2O2 및 1 μL의 tyramide-Alexa 488 1 μL를 98 μL의 증폭 완충액 A에 희석합니다(tyramide-Alexa 488 및 증폭 완충액 A의 상용 공급원은 재료 표 참조). 사용하기 직전에 이 용액을 준비하십시오.
  18. Tyramide-Alexa 555 작업 솔루션 준비: 1× 증폭 버퍼 A/0.0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 555. 100 μL의 경우, 0.15% H2O2 및 1 μL의 티라미드-Alexa 555 1 μL를 98 μL의 증폭 완충액 A에 희석합니다(티라미드-Alexa 555 및 증폭 완충액 A의 상용 공급원에 대해서는 재료 표 참조). 사용하기 직전에 이 용액을 준비하십시오.
  19. 티라미드-비오틴 작업 용액 준비: 1× 증폭 완충액 B/0.0015% H2O2/1:50 티라미드-비오틴. 100 μL의 경우, 1 μL의 0.15% H,2O2 및 2 μL의 티라미드-비오틴을 97 μL의 증폭 완충액 B에 희석합니다(티라미드-비오틴의 상업적 공급원 및 증폭 완충액 B에 대해서는 재료 표 참조). 사용하기 직전에 이 용액을 준비하십시오.
  20. 유리 제품을 200°C에서 최소 4시간 동안 굽습니다. 일회용이 아닌 플라스틱 식기(슬라이드 랙, Coplin 항아리 및 주사기 포함)를 3% H2O2 로 15-30분 동안 처리한 다음 RNase가 없는 물로 철저히 세척합니다. 해부 도구, 겸자 및 저온 유지 표본 홀더와 같은 스테인리스강 금속 기구를 3% H2O2 로 15분 동안 처리한 다음 RNase가 없는 물로 철저히 세척합니다. RNase 세척 용액으로 벤치 표면, 가열판 및 드라이 블록을 청소합니다.

2. 리보프로브 합성

참고: in vitro transcription을 통한 in situ hybridization을 위해 1kb digoxigenin 표지 cRNA 프로브를 합성하는 다음 절차는 이전에 발표된 프로토콜 20,21,22,23을 기반으로 합니다.

  1. 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 관심 유전자(예: 후각 수용체 유전자)에서 1kb DNA 단편을 증폭합니다. 검출할 성숙한 mRNA에 존재하는 영역을 증폭하는 primer pair를 선택합니다(예: 유전자의 코딩 염기서열). 다양한 후각 수용체에 대한 프라이머 선택은 Table of Materials에 나와 있습니다. 다른 vomeronasal olfactory receptor를 검출하기 위한 probe에 대한 자세한 내용은 이전 간행물 16,21을 참조하기 바란다.
  2. 0.8% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 실행하고 원하는 1kb 밴드를 제거합니다.
  3. 제조업체의 프로토콜에 따라 적절한 미니 컬럼 기반 겔 정제 키트를 사용하여 DNA 단편을 정제합니다.
  4. 정제된 DNA 단편을 정량화하고 제조업체의 프로토콜에 따라 적절한 PCR 클로닝 벡터로 클로닝합니다. 클로닝된 앰플리콘 측면에 T7 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 클로닝 벡터를 사용하는 것이 좋습니다.
  5. 제조업체의 프로토콜에 따라 화학적 변형 또는 전기천공법을 통해 재조합 플라스미드를 유능한 재조합이 없는 박테리아로 변환합니다.
  6. 변형 박테리아 콜로니를 풍부한 배지로 종자 분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 미니 제제를 통해 플라스미드를 분리합니다.
  7. 제조업체의 프로토콜에 따라 삽입된 DNA 단편의 정체와 방향을 확인하기 위해 적절한 제한 효소 및/또는 Sanger 염기서열분석을 사용하여 제한 분해 분석을 수행합니다.
  8. 적절한 제한 효소를 사용하여 10 μg의 플라스미드를 선형화하기 위해 제한 분해를 수행합니다. in vitro transcription 후 anti-sense riboprobe를 생성하려면, 유전자의 암호화 염기서열 다운스트림에 위치한 RNA polymerase promoter의 반대쪽 삽입물 말단에서 plasmid DNA를 분해하는 제한 효소를 사용하십시오. in vitro transcription 후 센스 리보프로브를 생성하려면, 유전자 암호화 염기서열의 상류에 위치한 RNA 중합효소 프로모터의 반대쪽 삽입물 말단에서 플라스미드 DNA를 소화하는 제한 효소를 사용하십시오.
  9. 0.8% 아가로스 겔에서 플라스미드 선형화 반응 산물의 분취량을 실행하여 분해의 완전성을 확인합니다. 완전한 선형화가 확인되면 제조업체의 프로토콜에 따라 컬럼 기반 PCR 클린업 키트를 사용하여 나머지 반응을 정제합니다.
  10. 선형화된 플라스미드 1-2 μg을 템플릿으로 사용하고 적절한 효소(예: T7 또는 SP6 RNA 중합효소) 및 적절한 디곡시제닌(DIG) 라벨링 키트를 사용하여 시험관 내 전사를 통해 digoxigenin 표지 cRNA 프로브를 합성합니다.
  11. 37°C에서 30분 동안 DNase I으로 분해하여 반응에서 DNA 주형을 제거합니다.
  12. 미니 컬럼 기반 RNA 정제 키트 또는 겔 여과 기반 정제 키트를 사용하여 cRNA 프로브를 정제합니다. 생성된 프로브를 50μL의 RNase가 없는 물로 용리시킵니다.
  13. 생성된 리보프로브를 정량화하며, 가급적이면 형광 측정 방법을 사용합니다. 일반적으로 예상 수율은 100ng/μL 이상입니다.
  14. 자동 전기영동 시스템 또는 RNase가 없는 0.8% 아가로스 겔에서 리보프로브를 실행하여 프로브 품질 및 성능 저하를 확인합니다.
  15. 합성된 프로브는 필요할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.

3. 후각 자극에 대한 생쥐의 노출

  1. 각 동물을 노출되기 최소 24시간 전에 깨끗한 우리에 개별적으로 수용하십시오. 노출되기 최소 2시간 전에 식품 그리드를 제거하십시오. 이 연구에 사용된 모든 동물은 8-12주 된 수컷 C57BL/6마리 마우스(평균 체중: 20g)였습니다.
  2. 적절한 후각 자극을 준비합니다. MOE(주 후각 상피) 또는 VNO(보메로노살 기관)의 후각 뉴런을 활성화하기 위해 다양한 자극을 사용할 수 있습니다. 후각 자극에 대한 포괄적인 목록은 다른 간행물3, 16, 22, 23, 24를 참조하십시오. 화학 용액, 소변 또는 재조합 단백질 용액과 같은 액체 자극은 의료용 거즈나 면봉에 침전할 수 있습니다.
  3. 후각 자극을 케이지에 삽입하고 1시간 동안 동물을 방해하지 마십시오.
  4. 마우스 피험자를 안락사시키고 RNase-free 해부 도구를 사용하여 MOE 또는 VNO를 빠르게 해부합니다.

4. 조직 해부 및 동결

  1. 해부 용액을 사용하여 실체현미경으로 MOE 또는 VNO를 해부합니다.
    1. VNO의 경우 두꺼운 중격 뼈를 제거하고 장기를 둘러싼 부드러운 연골 껍질은 남겨둡니다.
  2. 극저온 절편을 위한 시료를 준비합니다.
    1. 압지 조각에 표본을 닦아내고 임베딩 매체가 들어 있는 조직학적 플라스틱 주형 안에 넣습니다.
    2. VNO의 경우 각 장기를 수직으로 배열하고 1mL 주사기를 사용하여 플라스틱 주형의 바닥으로 당깁니다(그림 1A).
    3. MOE의 경우 크리브리폼 플레이트가 아래를 향하도록 하여 플라스틱 몰드 바닥에 놓습니다.
    4. 표본 주변의 과도한 기포는 절단을 방해할 수 있으므로 제거하십시오.
    5. 드라이아이스에서 표본을 얼립니다.
    6. 시편 블록을 -80°C에서 보관하십시오.
      알림: 냉동 표본은 절편 전에 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 극저온 절편을 수행합니다.
    1. 저온 유지 장치를 켜고 사용하기 최소 4시간 전에 온도를 -23°C로 설정하십시오.
    2. 조직학적 플라스틱 틀에서 얼어붙은 블록을 제거하고 면도날로 다듬습니다.
    3. 단면 취급이 더 쉬워지므로 시편 주위에 5mm를 남겨 두십시오(그림 1B).
    4. 임베딩 매체를 사용하여 블록을 저온 유지 장치의 표본 홀더에 부착합니다.
    5. 16μm 절편을 양전하를 띤 현미경 슬라이드에 수집합니다.
    6. 슬라이드는 -80°C에서 보관하십시오.
      참고: 슬라이드는 현장 교잡 전에 몇 달 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

5. 단계별 현장 혼성화 프로토콜

  1. 헤어 드라이어를 사용하여 슬라이드를 10분 동안 말리십시오. 따뜻한 제트를 사용하여 슬라이드를 해동한 다음 매립 매체가 불투명해질 때까지 실온 제트로 전환합니다.
  2. RNase-free 4% 파라포름알데히드 고정액 슬라이드당 500μL를 추가하고 23-26°C에서 15분 동안 배양하여 조직학적 단면을 고정합니다.
  3. RNase-free 1× PBS에서 각각 5분씩 슬라이드를 두 번 세척합니다.
  4. RNase-free 0.2 M HCl의 슬라이드당 500 μL를 추가하고 23-26 °C에서 10분 동안 배양합니다.
  5. RNase-free 1× PBS에서 각각 5분씩 슬라이드를 두 번 세척합니다.
  6. RNase-free 0.1% H2O2/1× PBS 슬라이드당 500μL를 추가하고 23-26°C에서 30분 동안 배양합니다. 과산화수소의 광에 의한 분해를 방지하기 위해 어두운 곳에서 이 단계를 수행하십시오.
  7. RNase-free 1× PBS에서 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세척합니다.
  8. 흄 후드에 250mL의 RNase-free 트리에탄올아민 0.1M pH 8.0과 마그네틱 교반 막대가 들어 있는 용기로 슬라이드를 옮겨 아세틸화를 수행합니다. 625μL의 무수아세트산을 일정한 교반으로 첨가합니다. 교반 속도를 낮추고 슬라이드에 625μL를 한 방울 더 추가한 다음 교반을 끄고 10분 동안 배양합니다.
  9. RNase-free 1× PBS에서 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세척합니다.
  10. RNase-free 1× PBS에서 60°C에서 5분 동안 슬라이드를 한 번 세척합니다.
  11. 1× PBS에서 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 보푸라기가 없는 실험실 티슈 페이퍼를 사용하여 각 슬라이드를 블로트로 건조시켜 사전 하이브리드화를 수행합니다. 각 슬라이드에 400 μL의 사전 혼성화 용액을 Pipet 넣고 수조 또는 가열된 오븐에서 60 °C로 예열된 가습 챔버 내부에 넣습니다. 60 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
  12. 혼성화 용액을 60°C까지 충분히 가열하고, 마이크로분리관에서 슬라이드당 200μL를 분취하고, 10분 동안 85°C까지 가열합니다.
  13. 적절한 cRNA 프로브를 부합화 용액 튜브(각 프로브 1μg/mL)에 추가하고 85°C에서 5분 동안 변성합니다.
  14. 혼성화를 위해서는 가습실에서 한 번에 하나의 슬라이드를 가져와 닦아내고 60°C로 가열된 플레이트에 놓습니다. 200μL의 리보프로브 함유 혼성화 용액을 추가하고 슬라이드를 유리 커버슬립으로 덮습니다. 60 °C의 가습 챔버에서 12-16 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 사전 하이브리드화 후 슬라이드가 식지 않도록 하십시오. 혼성화 온도는 각 프로브에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 섭씨 60도는 일반적으로 1kb 프로브에서 잘 작동하기 때문에 시작점으로 제안됩니다.
  15. SSC 세척 용액을 별도의 병에 담아 55°C로 가열하고 적절한 온도의 수조에 넣습니다.
  16. 혼성화가 완료된 후 55°C에서 5× SSC 용액이 포함된 수조를 사용하여 각 슬라이드에서 커버슬립을 제거합니다. 따뜻한 SSC 용액 내부에서 각 슬라이드를 수평으로 잡습니다. 커버슬립이 분리되면 슬라이드를 기울여 커버슬립이 바닥으로 떨어지도록 합니다.
  17. 슬라이드 용기에 2× SSC로 55°C에서 30분 동안 세척합니다.
  18. 슬라이드 용기에 0.2× SSC로 55°C에서 20분 동안 세척합니다.
  19. 슬라이드 용기에 0.1× °C에서 55 °C로 20 분 동안 세척합니다.
  20. 23-26 ° C에서 0.1 × SSC로 옮기고 슬라이드 용기에서 3 분 동안 배양합니다.
  21. 슬라이드 용기에 10분 동안 PTw로 세척합니다.
  22. TN 버퍼에서 슬라이드 용기에 담아 각각 5분씩 두 번 세척합니다.
  23. 각 슬라이드에 600μL의 TNB 차단 완충액을 피펫하고 23-26°C에서 3시간 동안 배양합니다.
  24. 각 슬라이드에 500μL의 1차 항체 용액(TNB 용액에 1:400으로 희석된 과산화효소 접합 항-DIG 항체)을 피펫. 각 슬라이드에 열가소성 실험실 필름 조각을 조심스럽게 덮고 4°C에서 12-16시간 동안 배양합니다.
  25. 슬라이드 용기에서 약한 저어주기로 TNT 버퍼로 슬라이드를 각각 5분 동안 6회 세척합니다.
  26. 각 슬라이드에 100μL의 티라미드-비오틴 작업 용액을 피펫. 열가소성 실험실 필름 커버 슬립으로 덮고 23-26 ° C에서 12 분 동안 배양합니다.
    참고: 이 배양 단계를 배치당 2개 또는 3개의 슬라이드를 사용하여 엇갈리게 수행하여 배양 시간을 잘 제어할 수 있습니다. 티라마이드 배양 기간은 cRNA 프로브 감도 및 농도에 따라 최적화해야 할 수 있습니다.
  27. 슬라이드 용기에서 약한 저어주기로 TNT 버퍼로 슬라이드를 각각 5분 동안 6회 세척합니다.
  28. 과산화효소 접합 스트렙타비딘(SA-HRP, TNB 완충액에서 1:100으로 희석)을 함유한 용액 200μL를 각 슬라이드에 피펫하고 열가소성 실험실 필름 커버슬립으로 덮습니다. 23-26 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
  29. 슬라이드 용기에서 약한 저어주기로 TNT 버퍼로 슬라이드를 각각 5분 동안 6회 세척합니다.
  30. 각 슬라이드에 100 μL의 티라미드-Alexa 488 작업 용액을 피펫으로 바르고, 열가소성 실험실 필름 커버슬립으로 덮고, 23-26 °C에서 12분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
  31. 슬라이드 용기에서 약한 저어주기로 TNT 버퍼로 슬라이드를 각각 5분 동안 6회 세척합니다.
  32. 슬라이드 용기에서 3% H2O2/1× PBS에서 1시간 동안 배양하여 이전 단계의 과산화효소를 비활성화합니다.
  33. 슬라이드 용기에서 약한 저어주기로 TNT 버퍼로 슬라이드를 각각 5분 동안 6회 세척합니다.

6. pS6 면역염색

  1. 각 슬라이드에 500μL의 4% 파라포름알데히드/1× PBS 용액을 피펫하고 23-26°C에서 15분 동안 배양하여 단면을 고정합니다.
  2. Pipet 500 μL의 1× PBS/0.1% Triton X-100을 각 슬라이드에 삽입하고 5분 동안 배양하여 절편을 투과화합니다.
  3. 슬라이드 용기에 1×PBS로 두 번 씻습니다.
  4. 시판되는 티라미드 신호 증폭 차단 용액 B(Table of Materials)의 섹션당 피펫 2-3방울을 투여하고 23-26°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 각 슬라이드에 400μL의 면역조직화학 차단 용액을 피펫하고 23-26°C에서 30분 동안 배양하여 단면을 차단합니다.
  6. 피펫 200 μL의 토끼 항-pS6 1차 항체 용액(면역조직화학 차단 용액에 1:200으로 희석, 최종 농도: 1 μg/mL)을 각 슬라이드에 바르고 열가소성 실험실 필름 커버슬립으로 덮고 4°C에서 12-16시간 동안 배양합니다.
  7. 슬라이드 용기에 1×PBS/0.1% Triton X-100을 넣고 각각 5분씩 3회 세척합니다.
  8. 시판되는 과산화효소 접합 토끼 2차 항체 용액(Table of Materials)의 슬라이드당 피펫 2-3방울을 떨어뜨리고 23-26°C에서 1.5시간 동안 배양합니다.
  9. 슬라이드 용기에 1×PBS/0.1% Triton X-100을 넣고 각각 5분씩 3회 세척합니다.
  10. 슬라이드를 블롯으로 건조시키고 각 슬라이드에 100-200 μL의 tyramide-Alexa 555 작업 용액을 피펫으로 분사한 다음 열가소성 실험실 필름 커버슬립 조각으로 오버레이하고 어둠 속에서 7분 동안 배양합니다.
  11. 슬라이드 용기에 1×PBS로 각각 5분씩 두 번 씻습니다.
  12. 각 슬라이드에 500 μL의 희석된 핵 염색제(1× PBS)를 피펫하고 23-26 °C에서 30분 동안 배양합니다.
  13. 슬라이드 용기에 1× PBS로 23-26 ° C에서 각각 5 분 동안 두 번 씻습니다.
  14. 페이딩 방지 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 장착 매체가 어둠 속에서 24시간 동안 경화되도록 합니다.
  15. 형광 퇴색을 방지하기 위해 이미징할 때까지 슬라이드를 적절한 온도에서 보관하십시오.

7. 현미경 이미징

  1. 사용된 형광단에 적합한 필터가 장착된 epifluorescence 또는 컨포칼 현미경을 사용한 이미지 슬라이드.

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결과

현재 프로토콜은 실험자의 관심 유전자와 신경 활성 마커 pS6가 형광 표지된 현미경 이미지를 얻는 것을 목표로 합니다. 설명된 방법에는 Tyramide Signal Amplification이 포함되며, 이는 배경이 거의 또는 전혀 없이 명확하고 강력한 라벨링을 생성합니다. pS6 면역염색은 일반적으로 전체 신경세포체를 채우는 세포질 형광 신호로 나타나는 반면, 후각 수용체 뉴런에 대한 현장 혼성화 신호는 세포질 염색으로 나타납니다. pS6는 후각 뉴런 활성화의 일시적인 마커이므로 관련 면역 염색 신호는 감각 기관 고정 전 1시간 동안 활성화된 세포에서 더 강하게 나타납니다. pS6에 대한 염색과 수용체 사이의 형광 누화는 적절한 대역통과 현미경 필터를 사용하는 경우 예상되지 않습니다.

라벨링된 절편은 두 가지 유형의 염색 사이의 공동 국소화를 평가하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 연구 중인 활성화된 뉴런 집단에 의해 발현되는 유전자를 식별할 수 있습니다. <...

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토론

여기에 설명된 프로토콜은 OR 또는 VR 수용체의 현장 감지와 뉴런 활동의 간접 마커인 pS6의 면역 검출의 조합을 통해 후각 시스템의 화학적 신호에 의해 활성화되는 감각 뉴런을 안정적으로 식별합니다. 실험자는 조직학적 무결성을 유지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 하며 RNase-free 조건에서 혼성화 전에 모든 단계를 수행해야 합니다. 그렇지 않으면 mRNA 분해가 발생하고 리보프로브 라벨링이 손상될 수 있습니다. 후각 기관을 해부하는 동안에는 고정되지 않은 조직이 특히 연약하고 쉽게 손상될 수 있으므로 주의를 기울여야 합니다.

이 프로토콜의 현장 혼성화에는 두 차례의 신호 증폭이 포함되며, 형광 강도는 혼성화 또는 신호 발달과 관련된 요인의 영향을 받을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, 배양 온도와 기간은 경험적으로 최적화되어야 합니다. 약한 라벨링은 낮은 프로브 농도...

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공개 사항

저자들은 자신들이 어떤 종류의 경쟁 이익도 가지고 있지 않다고 선언한다.

감사의 글

리소스를 제공해 주신 GAG Pereira와 JA Yunes, 행정 및 기술 지원을 해주신 APF Ferreira와 WO Bragança, 컨포칼 현미경 검사를 도와준 Life Sciences Core Facility(LaCTAD-UNICAMP) 직원에게 감사드립니다. 이 작업은 상파울루 연구 재단(FAPESP, 보조금 번호 2009/00473-0 및 2015/50371-0 F.P.), PRP/UNICAMP(보조금 번호 2969/16, 725/15, 348/14 및 315/12 FP), FAPESP 펠로우십 V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1), 그리고 T.S.N. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) 펠로우십의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x 인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20배 증폭 희석액(반응 완충액  ThermoFisher ScientificB40923 또는  Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 키트) B40922티라미드-알렉사 488 또는 티라미드-알렉사 555 신호 증폭
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% 소 혈청 알부민(BSA)머크(시그마-알드리치)A9576n/a
30% 수소 퍼옥사이드(H2O2)Merck(시그마-알드리치)H1009해당 없음
무수아세트Merck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
증폭 희석제(TSA 비오틴 키트에서)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EA티라미드-비오틴 신호 증폭을 위한 작업 용액에서 증폭 버퍼 B로 언급
Anti-pS6 (Ser 244/247) 토끼 다클론 항체Thermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
차단 버퍼 1x (Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost 키트에서)Thermo Fisher ScientificB40923 또는  티라미드 신호 개발 단계에서 차단 용액 B로 언급
차단 시약(TSA Biotin 키트에서)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EATNB 완충액 DAPI 핵 염색 제형에서 차단 시약 A로 언급
Thermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's solution (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
탈오인화된 포름아미드Merck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
덱스트란 황산염 용액 (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
에틸렌-디아민-테트라아세트산 (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 핵 염색Thermo Fisher ScientificH1399n/a
염산 (HCl)Merck ( Sigma-Aldrich)320331n/a
후각 자극n/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
파라포름알데히드Merck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin 항체 (Fab fragments)Merck (Roche)11207733910;   RRID:AB_514500peroxidase-conjugated anti-DIG 항체
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from  Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
과산화효소 복합 스트렙타비딘(TSA 비오틴 키트에서)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EA해당 없음
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934non-fadeding mounting medium
RNase-free 초순수10977015n/a
염화나트륨 (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
도데실황산나트륨 (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
수산화나트륨 (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
수산화물Merck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
트리에탄올아민Merck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922해당 사항
없음Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)ThermoFisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Yeast tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
고감도 RNA ScreenTape 분석 시약(완충액, 래더 및 테이프)Agilent5067-5580, 5067-5581 및 5067-5579자동 전기영동 시스템으로 참조됨
마우스: C57BL/6J 근친 변형Jackson Laboratories재고 번호:  000664;   RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 마이크로 컬럼Cytiva Biosciences28903408겔 여과 기반 정제 키트로 참조
QIAquick 겔 추출 키트Qiagen28506미니 컬럼 기반 겔 정제 키트로 참조
RNeasy MinElute 클린업 키트 Qiagen74204미니 컬럼 기반 RNA 정제 키트
TSA로 참조됨 비오틴 키트Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotides
5' – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr692
5' – ACTGGCTTTGGGACAGTGAC – 3'통합 DNA 기술n/a
5'- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr124
5' – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
개그 – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr1509
5' – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr1512
5' – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr78
5' – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr691
5' – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr638
5' – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3'통합 DNA 기술n/a
5' – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3'		통합 DNA 기술n/aOlfr569
5' – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r1
5' – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r2
5' – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r13
5' – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r89
5' – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r118
5' – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r116
5' – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r28
5' – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r41
5' – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r46
5' – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r69
5' – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3'통합 DNA 기술n/a
5' – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r90
5' – CATATTCCACAGAAGAAGAAGT
TGGAC – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r107
5' – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3'		통합 DNA 기술n/a
5' – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3'		통합 DNA 기술n/aVmn2r83
5' – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360권장 PCR 클로닝 벡터
기타 재료
1mL 주사기Fisher Scientific14-829-10Fn/a
원뿔형 튜브(15mL 및 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49B해당 없음
Coplin jarsFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
해부 도구 및 집게RobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
건식 수조n/a해당 없음n/a
전기영동 장비피셔 사이언티픽09-528-110B해당 없음
파인 포인트 페인트 브러시Winsor & Newton10269097n/a
형광 또는 컨포칼 현미경Leica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
가열판Fisher ScientificHP88850200n/a
가습 챔버(더 높은 온도에서 사용하는 경우 플라스틱 타파웨어 용기 내부에 밀봉Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
보푸라기가 없는 실험실 KimwipesKimberly-Clark34120보푸라기가 없는 실험실 티슈 페이퍼로 언급
MicrocentrifugeEppendorf5401000013N/A
Mouse cagesInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipette p1000, p200 및 p20 일회용 팁Fisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
플라스틱 조직학 임베딩 몰드 Thermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 형광측정기Thermo Fisher ScientificQ33238고감도 형광분석법으로 언급됨
면도날 또는 메스Fisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation 또는 BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation 시스템 또는 2100 Bioanalyzer Instrumentn/a
RNase-free 유리 또는 플라스틱 눈금 실린더 및 비커Fisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
실체현미경Leica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus 현미경 슬라이드Thermo Fisher Scientific12-550-15양전하 현미경 슬라이드
Parafilm열가소성 실험실 필름으로 언급되는Bemis CompanyPM999
수조Thermo Fisher ScientificTSCIR19n/a
는 산 됨 되는 B40922는 은 됨 는 해야 함)됨

참고문헌

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  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
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