C. elegans를 사용하여 C. albicans의 치명적이지 않은 독성 표현형을 연구하기 위한 두 가지 감염 분석

요약

진균 기회감염 병원체는 경미한 감염뿐만 아니라 생명을 위협할 수 있지만, 치명적이지 않은 표현형은 독성을 연구할 때 종종 무시됩니다. 따라서 우리는 진균 독성을 조사하기 위해 숙주의 생존 및 번식 측면을 모두 모니터링하는 선충 모델을 개발했습니다.

초록

병원체는 인간에게 치명적일 수 있지만, 그 중 다수는 치명적이지 않은 표현형을 가진 다양한 감염 유형을 유발합니다. 인간의 기회주의적 진균 병원체인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 ~40%의 폐사율을 초래하는 병원 감염의 네 번째로 흔한 원인입니다. 그러나 다른 C. albicans 감염은 덜 심각하고 드물게 치명적이며 여성의 ~75%에 영향을 미치는 외음부 칸디다증과 주로 유아, AIDS 환자 및 암 환자에게 영향을 미치는 구인두 칸디다증을 포함합니다. 쥐 모델은 C. albicans의 발병 기전을 연구하는 데 가장 자주 사용되지만, 이러한 모델은 주로 숙주 생존을 평가하며 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 복제가 제한적입니다. 따라서 C. albicans를 연구하기 위해 Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella 및 Caenorhabditis elegans를 포함한 여러 미니 모델 시스템이 개발되었습니다. 이러한 미니 모델은 돌연변이 라이브러리 또는 C. albicans의 다양한 유전적 배경을 스크리닝하는 데 적합합니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충을 사용하여 C. albicans 감염을 연구하는 두 가지 접근 방식을 설명합니다. 첫 번째는 숙주 번식을 측정하고 개별 숙주의 생존을 모니터링하는 번식력 분석입니다. 두 번째는 C. albicans 감염이 여러 세대에 걸쳐 숙주 개체군 성장에 어떤 영향을 미치는지 측정하는 계통 확장 분석입니다. 이러한 분석은 C. albicans 독성을 신속하게 평가할 수 있는 간단하고 비용 효율적인 방법을 제공합니다.

서론

칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 구강, 위장, 비뇨생식기를 포함한 다양한 틈새에 서식하는 인간의 기회주의적 진균 병원체입니다¹. 일반적으로 C. albicans는 점막 감염과 혈류 감염을 모두 일으키며, 후자는 치명적일 수 있습니다. C. albicans 감염의 중증도는 숙주 면역 기능에 따라 달라지며, 면역이 저하된 개인은 건강한 사람보다 감염에 더 취약합니다¹. 숙주 관련 요인 외에도 C. albicans는 균사, 생물막 형성 및 C. albicans가 숙주 상피 세포로의 접착 및 침입을 촉진하는 기능을 하는 분비 aspartyl proteinase(SAP)의 생성² 및 세포 용해 펩타이드 독소인 candidalysin(^3,4)을 포함하는 여러 독성 특성을 가지고 있습니다. 이와 관련하여, 이는 C. albicans virulence가 병원체와 숙주 환경 간의 상호 작용으로 인해 발생하는 복잡한 표현형임을 시사합니다. 따라서 독성 조사는 시험관 내 접근 방식과 달리 숙주 환경 역할을 하는 모델 유기체를 사용하여 연구하는 것이 가장 좋습니다.

척추동물과 무척추동물 유기체를 포함한 여러 숙주 모델이 C. albicans 감염을 연구하기 위해 개발되었습니다. 황금 표준으로 간주되는 쥐 모델은 적응 및 선천성 면역 체계와 전신 및 특정 장기의 질병 진행을 모니터링할 수 있는 능력으로 인해 자주 사용됩니다⁵. 그러나 이 숙주 모델에는 유지 관리 비용, 적은 수의 자손, 작은 표본 크기와 관련된 전력 및 재현성 저하 등 상당한 제한 사항이 있습니다⁵. 따라서 제브라피쉬(Danio rerio), 초파리(Drosophila melanogaster), 밀랍나방(Galleria mellonella) 및 선충(Caenorhabditis elegans)과 같은 다른 보다 단순한 모델 유기체가 개발되었습니다. 이러한 비포유류 모델 유기체는 더 작고 실험실 유지 관리가 덜 필요하며 샘플 크기가 더 커서 쥐 모델에 비해 더 큰 성능과 재현성을 허용합니다. 이러한 각 모델에는 감염 모델을 선택할 때 고려해야 하는 특정 장점과 단점이 있습니다. G. melonella는 37°C에서 자랄 수 있고 다양한 식세포를 가지고 있기 때문에 인간과 생리학적으로 가장 유사한 환경을 제공합니다⁷. 또한, 이 모델은 특정 접종물⁷의 직접 주입을 허용합니다. 그러나 완전히 염기서열화된 게놈은 없으며 돌연변이 균주를 만드는 확립된 방법도 없습니다. G. mellonella와 유사하게, D. rerio 모델은 특정 접종물을 직접 주입할 수 있습니다 ^5,7. 또한 적응면역체계(adaptive and intarinnatural immune system)⁵를 모두 가지고 있는데, 이는 포유류가 아닌 이 모델에 고유한 특징이지만, 이를 유지하기 위해서는 수생 번식 탱크가 필요하다. D. melanogaster와 C. elegans는 유사한 장점과 단점을 가지고 있는데, 여기에는 돌연변이 균주⁷를 조작하고 생성하기 쉽지만 적응 면역 또는 사이토카인⁷이 없는 완전히 염기서열화된 게놈이 포함됩니다. 이러한 모든 비 포유류 모델 중에서 예쁜꼬마선충은 가장 빠른 생활주기를 가지고 있고, 유전적으로 동일한 자손을 많이 생성하기 위해 자가 수정을 하며, 대규모 스크린에 가장 적합합니다 ^6,7,8. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 항진균제의 고처리량 스크리닝(high-throughput screening)에 매우 강력하며, ^{9,10 독성 인자(}virulence factor)를 특성화하고7 C. 알비칸스 특이적 숙주 방어 네트워크(C. albicans-specific host defense network)를 규명하는 데 매우 효과적입니다¹¹. 예쁜꼬마선충의 선천면역계는 인간과 함께 고도로 보존된 여러 성분을 가지고 있다¹². 숙주 선천성 방어에는 항균 펩타이드¹³ (AMP) 및 활성 산소 종^{14 , 15 , 16} 의 생산이 포함됩니다.

C. albicans 감염의 중증도는 주로 숙주 생존율에 의해 측정되지만 치명적이지 않은 독성 표현형을 포착할 수는 없습니다. 숙주 적합성의 종종 간과되는 측면은 생식이지만, 여러 연구에 따르면 C. albicans는 정자 생존력을 감소시켜 생식에 영향을 미친다고^17,18 이는 이것이 숙주 적합성을 연구하는 데 중요한 측면일 수 있음을 시사합니다. 따라서 C. albicans 감염이 숙주 생식력에 미치는 영향은 치명적이지 않은 독성 표현형을 연구하는 데 유용한 방법입니다. 우리는 건강한 숙주에서 생존 및 번식 표현형을 모두 조사하기 위해 예쁜꼬마선충을 사용하여 두 가지 감염 분석을 개발했습니다^19,20. 여기에서는 번식력과 계통 확장 분석에 대해 설명합니다. 번식력은 단일 숙주의 생산된 자손과 생존을 모두 측정하고, 혈통 확장은 3개의 숙주 세대에 걸친 감염의 결과를 평가합니다. 우리는 이러한 분석법을 사용하여 C. albicans deletion 돌연변이를 스크리닝하여 치명적 및 치명적이지 않은 독성 표현형의 극적이고 미묘한 차이를 모두 포착하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 실험을 위한 준비 단계

1. C. albicans와 Escherichia coli 배양 준비
   참고: 이 연구에 사용된 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.
   1. C. albicans와 E. coli 균주를 -80 °C에서 글리세롤 스톡으로 유지합니다.
   2. 멸균 이쑤시개를 사용하여 원하는 C. 알비칸스를 고체 효모 펩톤 덱스트로오스(YPD)(효모 추출물 1%, 박토펩톤 2%, 포도당 2%, 한천 1.5%, 아데닌 0.004%, 유리딘 0.008%)에 균주화하고 30°C에서 하룻밤 동안 자랍니다.
      참고: C. albicans 균주가 보조영양성인 경우 배지에 필요한 아미노산을 보충하십시오.
   3. 멸균 루프 또는 이쑤시개를 사용하여 단일 C. albicans 콜로니에 2mL의 액체 YPD를 접종합니다. 30 °C에서 24 시간 동안 흔들면서 배양하십시오.
   4. 멸균 이쑤시개를 사용하여 대 장균 (OP50)을 Luria Broth(LB, 10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl, 15g/L 한천) 한천 플레이트에 바릅니다. 30 °C에서 밤새 배양하십시오.
   5. 단일 OP50 콜로니를 50mL의 LB에 접종합니다.30°C에서 밤새 흔들어 배양합니다.
2. 선충 성장 배지 준비
   1. 2L 플라스크에 물 1L에 선충 성장 매체 분말 29g(NGM, 17.5g/L 한천, 3.0g/L 염화나트륨, 2.5g/L 펩톤, .005g/L 콜레스테롤)을 넣고 교반 막대와 섞습니다.
   2. 대장균 과증식을 억제하고 고압멸균 후 0.2g/L 스트렙토마이신 설페이트로 NGM을 보충하여 C. albicans 증식을 허용합니다.
      참고: 선충 유지 관리를 위해 NGM을 사용하는 경우 스트렙토마이신이 필요하지 않습니다.
3. 선충 개체군 유지
   1. 금속 스프레더를 사용하여 준비된 NGM 한천 플레이트에 300μL의 야간 대장 균 배양을 펼칩니다. 이 기술을 시딩이라고 합니다.
   2. 접시를 실온(RT)에서 건조시킵니다. 30 °C에서 밤새 플레이트를 성장시킵니다.
   3. 3-4일마다 E. coli와 함께 새로 파종된 NGM 플레이트에 덩어리로 덩어리를 만들어 선충 개체군을 유지합니다. 20 °C에서 보관하십시오. 청크(chunking)는 무작위 선충 개체군을 새로 파종된 플레이트로 빠르게 옮기는 데 사용되는 기술로, 개체군이 증식할 수 있도록 합니다. 이렇게하려면 멸균 주걱을 사용하여 NGM 한천 플레이트에서 작은 사각형 (1 x 1 인치)을 자릅니다. 선충이 있는 면이 새 한천⁸을 향하도록 사각형을 새 파종된 NGM 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
      참고: 20°C에서 유지된 C. elegans 는 ~48시간 후에 자손을 낳는데, 이는 선충 개체군을 동기화할 때 고려하는 것이 유용합니다. 25 °C에서 유지되는 예쁜꼬마선충은 더 빨리 발달하고 번식하며 15 °C에서 유지되는 개체군은 더 느리게 성장합니다.
4. 선충 개체군 동기화
   1. NGM/OP50에서 유지되는 기존 선충 개체군부터 시작합니다.
   2. 선충이 포함된 NGM 플레이트에 ~3mL의 M9 완충액을 피펫팅합니다. 접시에서 선충 알을 씻어내고 피펫 끝을 부드럽게 사용하여 한천에서 알을 긁어냅니다(달라붙는 경향이 있음). P1000 피펫을 사용하여 계란과 벌레가 모두 포함된 액체를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 접시에 아직 남아 있는 알의 수를 평가하려면 해부 현미경을 사용하여 한천을 관찰하십시오.
   3. 원심분리기, 279 x g 및 RT에서 2분 동안 원뿔형.
   4. 선충 알갱이를 방해하지 않도록 주의하면서 상등액을 제거합니다.
   5. 3% 표백제 용액 25mL를 추가합니다(취급 시 "주의").
   6. 2분 동안 튜브를 뒤집습니다. 해부 현미경을 사용하여 선충이 죽었는지 확인하십시오 - 그들은 막대기처럼 곧고 운동성이 없을 것입니다.
      참고: 이것은 기존 선충만 죽입니다. 계란의 무결성은 영향을 받지 않습니다.
   7. 279 x g 및 RT에서 2분간 원심분리기.
   8. 상층액을 제거하고 펠릿을 3mL M9에 재현탁합니다.
   9. 279 x g 및 RT에서 2분간 원심분리기.
   10. 상층액을 제거하고 펠릿을 300μL의 M9에 재현탁합니다.
   11. 해부 현미경을 사용하여 5μL의 난자를 작은 페트리 플레이트에 피펫팅하여 난자의 농도를 확인합니다. 이상적인 농도는 20-100개의 계란이어야 합니다. 배양액이 너무 희석되면 원심 분리와 과도한 액체를 제거하여 용액을 농축하십시오. 배양액이 너무 농축되어 있으면 원하는 농도에 도달할 때까지 M9를 더 첨가하십시오.
5. 선충 감염을 위해 C. albicans와 E. coli 배양을 준비합니다(파종).
   1. 빈 용액을 준비합니다. 큐벳에 900μL의 ddH₂O와 100μL의 액체 YPD를 결합합니다.
   2. 큐벳을 분광 광도계에 삽입합니다. 위쪽 화살표를 사용하여 파장을 600나노미터로 설정합니다. "0 ABS 100% T" 버튼을 클릭하여 빈 솔루션을 설정합니다.
   3. 새 큐벳에서 900μL의 ddH₂O와 100μL의 야간 효모 배양을 결합합니다. 분광 광도계에서 빈 용액을 꺼내고 효모 용액이 들어있는 큐벳을 추가합니다. 화면에 표시된 광학 밀도를 기록합니다(아무 버튼도 누르지 마십시오). 판독값에 10을 곱합니다(측정된 효모 용액은 1/10 희석량).
   4. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 ddH₂O를 사용하여 배양을 3.0 OD₆₀₀/mL로 정규화합니다. 1 OD₆₀₀은 약 3 x ^10-7 CFU/mL²¹입니다.
      참고: OD₆₀₀ 판독값이 6.7, 3 OD/6.7 OD= 0.447mL인 경우 마이크로 원심분리기 튜브에 447μL의 C. 알비칸스 배양액을 추가합니다. 최대 속도(16, 873 x g)에서 30초 동안 원심분리기. 상층액을 제거하고 1mL의 ddH₂O에 재현탁합니다.
   5. 하룻밤 동안 배양한 대장균 배양을 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
   6. RT에서 2분 동안 279 x g에서 배양물을 원심분리합니다.
   7. 상층액의 대부분을 흡입하여 ~1mL를 남깁니다.
   8. 펠릿을 잔류 상층액에 재현탁시키고 미리 칭량된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   9. 마이크로 원심분리기 튜브를 최대 속도로 30초 동안 돌립니다.
   10. p1000 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 최종 펠릿의 무게를 측정합니다.
   11. 대장균을 ddH₂O에서 200 mg/mL로 희석합니다.
   12. 마스터 믹스 계산(표 2)을 사용하고 적절하게 확장합니다.

2. 번식력 분석

참고: 대표 데이터는 보충 표 1 에 나와 있고 도식은 그림 1A에 나와 있습니다.

1. 다음을 얻거나 준비하십시오 : 35 mm x 10 mm 페트리 플레이트, 0.2 g / L 스트렙토 마이신 설페이트가 보충 된 NGM, E. coli OP50 배양, LB, C. albicans 배양, YPD, Wire Pick, M9 완충액 (3.0 g / L_{KH 2}PO₄, 6.0 g / L Na₂HPO₄, 0.5 g / L NaCl, 1.0 g / L NH₄Cl), 15mL 원뿔형 튜브.
   실험 2일 전
2. 50mL의 LB에 2mL의 YPD 및 E. coli(OP50)에 C. albicans 균주를 접종하고 30°C에서 밤새 성장합니다.
3. 0.2g/L 스트렙토마이신 황산염이 보충된 NGM으로 35mm x 10mm 페트리 플레이트를 준비합니다. 준비된 플레이트의 수는 전체 실험 동안 지속되어야 합니다. 권장 반복 횟수는 처리당 10회입니다. 10회 반복의 경우 70개의 플레이트가 사용됩니다. NGM 1L로 ~250개의 플레이트를 만들 수 있습니다.
   실험 하루 전
4. 위에서 설명한 마스터믹스 농도와 함께 시딩 프로토콜에 따라 Day 0, Day 2 및 Day 3에 스트렙토마이신을 보충한 35 mm x 10 mm NGM 한천 플레이트를 시드하십시오(표 2). 적당량의 마스터믹스를 플레이트 중앙에 피펫으로 넣습니다. 미생물 성장의 단일 지점은 숙주 먹이를 공급하기에 충분하고 종자 외부의 숙주를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 배양을 퍼뜨릴 필요가 없습니다. RT에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
   참고: Day 0 마스터믹스에는 각 실험 처리에 대해 반복실험당 50μL의 "seed"가 포함되어 있습니다. 2-7일에는 각 실험 처리에 대해 반복당 10μL의 "시드"가 포함됩니다. 선충은 Day 0 플레이트에 동기화된 후 48시간 후에 L4 단계에 도달하기 때문에 Day 1 플레이트는 없습니다. L4에 도달하면, 개별 선충은 Day 2 plates로 옮겨집니다.

1회 반복의 경우	대장균(OP50) 제어 조건			C. albicans & E. coli (OP50) 치료 조건
	오피50	H2O	합계	오피50	C. 알비칸스	H2O	합계
0일차	6.25 ul	43.75 ul	50 ul	6.25 ul	1.25 ul	42.5 ul	50 ul
2-7일차	1.25 ul	8.75 ul	10 ul	1.25 ul	.25 ul	8.5 ul	10 ul

표 2: 번식력 분석을 위해 선충을 감염시키는 데 필요한 E. coli 및 C. albicans 배양의 마스터믹스 부피.

실험일(0일차)

5. 선충을 동기화하고 대조 플레이트(OP50만 해당) 및 처리 플레이트(C. albicans + OP50)의 각 Day 0 복제에 ~50개의 알을 플레이트합니다. 20 ° C에서 48 시간 동안 배양하십시오.
   2일차
6. Day 0 플레이트에서⁸ 개를 선택하여 단일 L4 선충을 복제된 Day 2 시드 플레이트로 옮깁니다. L4 숙주는 몸의 등쪽 중앙에 있는 작은 주머니로 식별할 수 있다²². 동일한 유형의 시딩된 플레이트에서 부화 및 성숙한 선충을 옮깁니다(즉, D0 대조판의 L4 선충은 2일차 대조판으로 옮겨야 함).
7. 50mL의 LB에 2mL의 YPD 및 E. coli(OP50 균주)에 필요한 C. albicans 배양물을 접종합니다.
   3일차
8. 각 복제를 추적하면서 2일차 플레이트에서 3일차 파종 플레이트로 선충을 옮깁니다(즉, 2일차의 Replicate A는 Replicate A Day 3 플레이트로 이동해야 함).
9. Day 2(난자만 포함)와 Day 3(단일 성체 포함) 플레이트를 20°C에서 24시간 동안 배양합니다.
10. 플레이트당 10μL의 마스터믹스를 사용하여 4일 및 5일 동안 스트렙토마이신 플레이트를 보충한 35mm x 10mm NGM을 시드하고(표 2) 24시간 동안 RT에서 플레이트를 배양합니다.
    4일차
11. 선충을 Day 3 plate에서 Day 4 seeded plate로 옮깁니다.
12. Day 3 및 Day 4 플레이트를 20 ° C에서 24 시간 동안 배양합니다.
13. 해부 스코프를 사용하여 각 Day 2 플레이트에 대해 생존 가능한 자손을 계산합니다. 죽었거나 더 이상 플레이트에 없는 모든 복제에 유의하십시오(중도절단). 자손의 수가 기록되면 Day 2 플레이트를 폐기합니다.
    참고: Censored는 접시에서 사라지는 선충을 말합니다. 이것은 선충이 판에서 기어 나올 때 발생할 수 있습니다. 24시간 동안에는 덜 흔하지만, 죽은 선충의 사체는 한천으로 분해되어 검열을 초래합니다. 중도절단된 데이터는 최종 자손 및 생존 데이터 분석에 포함되지 않습니다.
14. 2mL의 YPD와 50mL의 LB에 E. coli(OP50)에 C. albicans 균주의 새로운 배양물을 접종합니다.
    5일차
15. 선충을 4일차 플레이트에서 5일차 파종 플레이트로 옮깁니다.
16. Day 4 및 Day 5 플레이트를 20 ° C에서 24 시간 동안 배양합니다.
17. 각 Day 3 플레이트에 대한 실행 가능한 자손을 세십시오. 죽었거나 더 이상 플레이트에 없는 모든 복제에 유의하십시오(중도절단). 자손의 수가 기록되면 3일차 플레이트를 폐기합니다.
18. 플레이트당 10μL의 마스터믹스를 사용하여 6일 및 7일 동안 스트렙토마이신 플레이트를 보충한 35mm x 10mm NGM을 시드하고(표 2) 플레이트를 실온에서 24시간 동안 배양합니다.
    6일차
19. 선충을 5일차 플레이트에서 6일차 파종 플레이트로 옮깁니다.
20. Day 5 및 Day 6 플레이트를 20 ° C에서 24 시간 동안 배양합니다.
21. 각 Day 4 플레이트에 대한 실행 가능한 자손을 세십시오. 죽었거나 더 이상 플레이트에 없는 모든 복제에 유의하십시오(중도절단). 자손의 수가 기록되면 4일차 플레이트를 폐기합니다.
    7일차
22. 6일차 플레이트에서 7일차 파종 플레이트로 선충을 옮깁니다.
23. Day 6 및 Day 7 플레이트를 20 ° C에서 24 시간 동안 배양합니다.
24. 각 Day 5 플레이트에 대한 실행 가능한 자손을 세십시오. 죽었거나 더 이상 플레이트에 없는 모든 복제에 유의하십시오(중도절단). 자손의 수가 기록되면 5일차 플레이트를 폐기합니다.
    8일차
25. 각 Day 6 플레이트에 대한 실행 가능한 자손을 세십시오. 죽었거나 더 이상 플레이트에 없는 모든 복제에 유의하십시오(중도절단). 자손의 수가 기록되면 Day 6 플레이트를 폐기합니다.
    9일차
26. 각 Day 7 플레이트에 대한 실행 가능한 자손을 세십시오. 가장 큰 선충(부모)을 세지 마십시오. 죽었거나 더 이상 플레이트에 없는 모든 복제에 유의하십시오(중도절단). 자손의 수가 기록되면 7일차 플레이트를 폐기합니다.
    참고: 이 분석은 생존을 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 각 선충이 언제 죽었는지 기록합니다. 실험이 끝나면 7일간의 실험 동안 살아남은 선충의 비율을 각 처리에 대해 비교할 수 있습니다. 선충은 때때로 음식/병원균 공급원에서 기어 나와 페트리 플레이트의 슬라이드를 오르려고 합니다. 계속 진행하기 전에 플레이트의 모든 영역을 확인하십시오. 죽은 선충은 일반적으로 사체를 남깁니다. 찾을 수 없는 선충을 검열하고 해당 선충을 죽은 것으로 간주하지 마십시오. 자손과 생존에 대한 최종 분석에 중도절단된 데이터를 포함하지 마십시오.
27. 데이터 세트의 정규성에 따라 일원 ANOVA 또는 Kruskal-Wallis를 사용하여 무리 크기 및 후기 번식에 대한 데이터를 분석하고, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 치료 그룹 간의 유의미한 차이를 식별하기 위한 사후 Tukey/Dunn의 다중 테스트를 사용합니다. Wilcoxon 로그 순위 검정을 사용하여 생존 곡선 간의 차이를 탐지합니다.

3. 계통 확장 분석

참고: 의 대표 데이터는 보충 표 2 에 나와 있고 회로도는 그림 2A에 나와 있습니다.

1. 0.2g/L 스트렙토마이신 설페이트, E. coli OP50 배양물, LB, C. albicans 배양물, YPD, M9 완충액, Wire Pick, 15mL 원추형 튜브가 보충된 NGM 한천을 포함하는 100mm x 15mm 페트리 플레이트를 얻거나 준비합니다.
   -2일차
2. 50mL의 LB에 2mL의 YPD 및 E. coli(OP50)에 C. albicans 균주를 접종하고 30°C에서 밤새 성장합니다.
   일 -1
3. 플레이트당 300μL의 마스터믹스가 함유된 스트렙토마이신이 보충된 100mm x 15mm NGM 한천 플레이트를 시드합니다(표 3). 멸균 금속 스프레더를 사용하여 마스터믹스를 플레이트에 펴 바릅니다. 플레이트를 30 ° C에서 밤새 배양하십시오. 치료당 6회 반복하는 것이 좋습니다. 따라서 처리당 7개의 플레이트(동기화된 선충의 경우 1개의 플레이트, 각 성체 선충의 경우 6개의 플레이트)를 준비합니다.

	대장균(OP50) 제어 조건			C. 알비칸스 & 대장균 (OP50). 처리 조건
1회 반복의 경우	오피50	H2O	합계	오피50	C. 알비칸스	H2O	합계
	1.25 ul	8.75 ul	10 ul	37.5 ul	7.5 ul	255 ul	300 ul

표 3: 계통 확장 분석을 위해 선충을 감염시키는 데 필요한 E. coli 및 C. albicans 배양의 마스터믹스 부피.

선충 개체군 증가: 0일차

4. 각 대조군(OP50만 해당) 및 처리(C. albicans + OP50)에 대해 단일 플레이트에 선충류와 플레이트 10-25 알을 동기화하고 20°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   2일차:
5. 각 제어 및 처리 Day 0 플레이트에서 단일 L4 웜을 동일한 처리의 시딩된 플레이트로 옮깁니다. L4 숙주는 몸의 등쪽 중앙에 있는 작은 주머니로 식별할 수 있다²².
6. 20 ° C에서 5 일 동안 배양합니다 (동기화 후 총 1 주일).
   7일차:
7. p1000 피펫을 사용하여 5mL의 M9 완충액을 사용하여 각 플레이트에서 전체 선충 집단을 세척하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
8. 4°C에서 1시간 동안 보관하여 선충이 더 쉽게 계수할 수 있도록 가라앉을 수 있도록 합니다.
9. 각 원뿔형을 M9 완충액으로 최종 부피 10mL로 희석합니다.
10. 각 생물학적 복제에 대해 20μL 분취액의 선충 수를 계산합니다. 이를 반복하여 각 생물학적 복제물에 대해 6개의 기술 복제물을 얻습니다. 뒤로 계산하여 총 모집단 크기를 결정합니다. 샘플이 너무 희석된 경우(즉, 샘플당 선충이 10개 미만인 경우) 개체군을 더 적은 양의 M9 완충액에 농축합니다.
    참고: 살아있는 선충의 원심분리는 선충에 해를 끼치지 않습니다.
    계산 예:
    70개 호스트 = X(총 호스트)
    20 μL (분취량) 10,000μL (총 부피)
11. 데이터 세트의 정규성에 따라 일원 ANOVA 또는 Kruskal-Wallis를 사용하여 계보 확장에 대한 데이터를 분석하고, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 치료 그룹 간의 유의미한 차이를 식별하기 위한 사후 Tukey/Dunn의 다중 테스트를 사용합니다.

결과

여기에서는 C. elegans를 감염 모델로 사용하여 C. albicans 독성을 치명적이지 않은 표현형으로 측정하는 두 가지 분석을 제시합니다. 첫 번째 분석법인 번식력(fecundity)은 C. albicans 감염이 자손 생산과 생존을 위해 단일 숙주에 어떤 영향을 미치는지 모니터링합니다. 두 번째 분석법인 계통 확장은 C. albicans 감염이 여러 세대에 걸쳐 개체군 성장에 어떤 영향을 미치는지 측정합니다.

번식력 분석법은 C. albicans 감염 중 숙주 적합성에 대한 여러 측정을 가지고 있습니다. C. albicans 감염이 숙주 적응도, 생존 및 번식의 두 가지 뚜렷한 측정에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위해 개별 숙주를 모니터링하는 번식력 분석¹⁹...

토론

여기에서는 진균 독성을 측정하는 두 가지 간단한 분석을 제시합니다. 두 분석 모두 C. elegans 를 치명적 및 치명적이지 않은 숙주 표현형에 대한 모니터링을 포함하는 숙주 시스템으로 활용합니다. 예를 들어, 번식력 분석은 개별 감염 숙주의 번식 성공을 조사하는 동시에 개별 생존을 측정합니다. 일일 모니터링은 총 무리 크기뿐만 아니라 생식 시기 및 사망 시간도 제공합니다. 계통 확장 분석은 번식력 분석의 단순화된 버전으로 개발되었으며, 숙주 전달과 일일 계수가 더 적기 때문에 덜 번거롭습니다. 계통 확장 분석은 숙주 적합성의 여러 측면을 결합하는 다세대 및 정량적 측정을 제공합니다. 이러한 분석은 돌연변이 균주 및 다양한 임상 분리물을 포함한 C. albicans 균주의 독성을 신속하게 스크리닝할 수 있는 강력한 방법입니다. 또한, 숙주가 병원체를 먹이 공급원으로 삼아 사육되는 감염 분석의 용이성을 감안할 때, 이는 다른 미생물 병원...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL eppendorf microtubes 3810X	Millipore Sigma	Z606340
100 mm x 15 mm 페트리 플레이트	Sigma-Aldrich	P5856-500EA
15 mL Falcon Conicals	Fisher Scientific	14-959-70C
50 mL Falcon Conicals	Fisher Scientific	14-432-22
아데닌	Millipore Sigma	A8626
한천(과립, 세균 등급)	Apex BioResearch는	20-248
알루미늄 와이어(95% Pt, 32 게이지)를 생산합니다.	Genesee Scientific	59-1M32P
염화암모늄	Millipore Sigma	254134
Bacterial Cell Spreader	SP Scienceware	21TP50
BactoPeptone	Fisher BioReagants	BP1420-500
일회용 배양 튜브(20 x 150mm)	FIsherBrand	14-961-33
해부 현미경(NI-150 고강도 조명기)	Nikon Instrument Inc.
E. coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
Glucose	Millipore Sigma	50-99-7
Medium Petri Dish (35 X 10 mm)	Falcon	353001
Metal Spatula	SP Scienceware	8TL24
선충 성장 매체 (NGM)	Dot Scientific	DSN81800-500
칼륨 인산염 일염기	시그마	P0662-500G
염화나트륨	피셔 사이언티픽	BP358-1
인산나트륨	피셔 사이언티픽	BP332-500
스트렙토마이신 설페이트	써모-피셔 사이언티픽	11860038
트립톤	밀리포어 시그마	91079-40-2
우리딘	밀리포어 시그마	U3750
야생형 C. elegans	Caenorhabditis 유전학 센터	N2
효모 추출물	Millipore Sigma	8013-01-2