Method Article

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포는 다양한 DNA 손상 제에 지속적으로 노출되어 다른 세포 반응을 유도합니다. 생화학적 및 유전적 접근을 적용하는 것은 DNA 손상의 사이트에 있는 DNA 복구 단지의 모집 그리고 조립과 관련되었던 세포 사건을 드러내는 데 필수적입니다. 지난 몇 년 동안, 몇 가지 강력한 도구는 사이트 특정 DNA 손상을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. 더욱이, 새로운 정액 기술은 우리가 고정및 살아있는 세포를 둘 다 사용하여 단세포 분해능 수준에서 이 프로세스를 공부할 수 있게 합니다. 이러한 기술은 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었지만, 본원에서 우리는 DNA 수리 분야에서 가장 널리 사용되는 프로토콜을 제시, 형광 면역 스테인링 (IF) 및 크로마티닌 면역 침전 (ChIP), 이는 엔토뇌 기반 사이트 별 DNA 손상과 함께 DNA 의 유전 적 점유 및 DNA 의 결합을 시각화하고 정량화 할 수 있도록 DNA 수리 요소의 유전 적 점유율을 정량화 할 수 있도록 각각. 이 기술은 DNA 수리 도중 그들의 미세 조정 규칙에 필요한 그들의 번역 후 수정뿐만 아니라 손상된 게놈 궤적에 묶인 새로운 단백질을 확인하기 위하여 연구원을 위한 강력한 공구를 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 게놈은 다양한 DNA 손상 에이전트에 의해 끊임없이 도전되고 있습니다. 이러한 공격은 자외선 이나 조사와 같은 환경 공급원뿐만 아니라 산화 스트레스 또는 복제 오류1,2로인한 대사 부산물과 같은 내인성 소스에서 유래할 수 있다. 이러한 병변은 하나 또는 두 DNA 가닥의 무결성에 영향을 미칠 수 있으며, 생성된 오류가 지속되면 자주 전좌 및 게놈 불안정으로 이어지며 종양 발생3,4가발생할 수 있습니다. 게놈 무결성을 유지하기 위해 진화 중에 여러 수리 시스템이 개발되었습니다. DNA 손상의 특정 유형의 화학 적 및 물리적 특성에 따르면, 여러 복구 메커니즘을 활성화 할 수있다. 불일치, 기본 부위, 단일 가닥 휴식 및 8-oxoguanine(8-oxoG)은 불일치 수리 또는 기본 절제 수리 경로5,6에의해 제거될 수 있다. UV 유도 광제품에 의한 병변 및 부피가 큰 부피가 큰 유도체는 뉴클레오티드 절제 수리(NER) 또는 DNA 이중 가닥 파손 수리(DSBR) 공정

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 특정 단백질의 면역 검출

  1. 세포 배양 및 실험 설정 준비
    1. 10% 태아 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 1% 항생제 항마이코틱 용액으로 보충된 DMEM 배양 배지의 단층층에서 U2OS 세포를 유지한다.
      참고: 엔도누클로스 기반 DNA 손상 유도의 경우, 시스템 누출을 방지하기 위해 숯 처리 또는 스테로이드가 없는 매체를 사용하십시오.
    2. 가습된 5%CO2 환경에서 37°C에서 80%의 수렴까지 세포를 성장시키고, 매 2-3일마다 배지를 갱신한다.
    3. 배지를 흡인하고 1x PBS로 셀을 세척합니다. 트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면, 세포에 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하여 세포 현탁액을 산출한다.
    4. 셀 카운팅 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다. 플레이트 2 x 104 셀/mL/웰 24웰 플레이트에 멸균 12mm 원형 커버립을 양호한 플레이트.
    5. 가습 5%CO2 분위기에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양하여 커버립에 부착할 수 있도록 한다.
    6. 손상된 에이전트를 배양 된 배지로 직접 파이프하여 네오카르지노스타틴 (NCS)의 10 ng /m....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포에서 사이트 지향 DSB 유도 수리 프로세스를 연구하는 것은 안정적이거나 일시적인 과도 성 전도를 통해 달성 될 수있다. 그러나, 안정적인 형질전환이 균일하고 안정적인 세포 집단을 보장한다는 점에 유의해야 하며, 이는 통일되고 따라서 더 신뢰할 수 있는 세포 반응을 제공합니다. 일시적인 과도의 경우, 세포 인구의 극히 비율만이 실험에 다양성을 도입하는 플라스미드를 차지하고 유지합니다. ER-I-PpoI 또는 ER-AsiSI 엔도누셀 기반 세포 시스템을 확립하려면 50% 컨실릭 세포 집단이 필요하며, 이는 엔도나클로리스를 코딩하는 플라스미드로 보다 효과적으로 연관됩니다. 형질 전환의 경우, 시판되는 트랜스페트 시약 또는 바이러스 감염 기반 방법도 사용될 수 있다. 현미경 시각화 기술이 적용되고 과도 성 과도 형질이 필요한 경우, 지시된 DSB는 ER-융합 엔도넬리스에 결합하고 핵 전좌 및 DSB 유도를 허용하는 트랜스퍼션 후 24h4H에 의해 유도될 수 있다. 가장 적합한 시간 점을 결정하기 위해 4-OHT 처리 에 이어 다른.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA 수리는 비교적 최근의 연구 분야이지만, 우리의 지식은 다양한 생화학 적 및 현미경 방법의 도움으로 급속하게 확장되고 있습니다. 유전 정보를 보존하는 것은 복구 프로세스에 관련되나는 유전자에서 생기는 돌연변이가 종양 발생의 주요 원인 중 하나이기 때문에 세포에 중요하고 그러므로 DNA 복구 통로의 중요한 단계를 해명하는 것은 필수적입니다.

생화학 적 기술 (즉, 서양 얼룩, 면역 침전, 질량 분석 등)은 많은 수의 세포를 필요로하며 연구 된 수리 과정은 원하는 세포 집단의 스냅 샷을 나타냅니다. ChIP 실험을 수행하는 것은 가공, 번거롭고 DSB 수리 과정을 연구하기 위해 특정 실험을 설계할 때 고려해야 합니다. 다음 단계는 몇 가지 예입니다: (I) 세포는 제대로 lysed해야; 크로마티틴 분획(II) 크로마틴에 대한 접근성이 높을 수 있도록 별도의 세포 및 핵 용해 버퍼를 사용하여 2단계 용해 방법을 적용하는 것이 매우 좋습니다. 초음파 처리의 적절한 조건은 사전에 각.......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국가 연구 개발 및 혁신 사무소 보조금 GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, 헝가리 과학 BO/27/20의 자노스 볼라이 연구 장학금, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO 단기 펠로우십 8513, 템퍼스 재단 8513.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHT시그마 AldrichH7904
AgaroseLonza50004
항생제-항진균 용액(100×), 안정화시그마 AldrichA5955
항감마 H2A. X (phospho S139) 항체Abcamab26350
소 혈청 분획 V 알부민BioseraPM-T1725
TrackIt™ 시안/노란색 로딩 버퍼Thermo Fisher Scientific10482035
Dem, 1.0 g/L 포도당, L-글루타민 없음Lonza12-707F
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 양 안티-마우스 IgGInvitrogen11202D
Dynabeads™ M-280 양 안티 토끼 IgGInvitrogen11204D
EDTA시그마 AldrichE6758
EGTA시그마 AldrichE3889
에탄올어금니 화학 물질02910-101-340
소 태아 혈청(남미 원산지), EU 승인GibcoECS0180L
포름알데히드 37% 용액 무산시그마 알드리치1.03999
글루타맥스&트레이드; 보충제Thermo Fisher Scientific35050038
글리신시그마 알드리치50046
IPure kit v2DiagenodeC03010015
이소 아밀 알코올시그마 알드리W205702
LiCl시그마 알드리치L9650
NaCl시그마 알드리치S5886
Na-DOC시그마 알드리치D6750
NaHCO3시그마 알드리치S5761
스트렙토마이세스 카지노스테틱스의 네오카르지노스타틴시그마 알드리치N9162
NP-40시그마 알드리치I8896
Ca2+, Mg2+가 없는 PBS 분말드리치L182-50-BC
페놀시그마 알드리치P4557
파이프Sigma AldrichP1851
Polysorbate 20 (Tween 20)몰 화학물질09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ DAPI ThermoFisher ScientificP36935
프로테아제 억제제 칵테일 세트 IRoche11873580001
Proteinase KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs 항체Abcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONa시그마 알드리치S2889
SDS시그마 알드리치L3771
트리스 아세테이트-EDTA 버퍼시그마 알드리치T6025
트리스-HCl시그마 알드리치91228
TRITON X-100어금니 화학 물질09370-006-340
돼지 췌장에서 추출한 트립신시그마 알드리치T4799
트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드Gibco15400054
치 알 없음

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

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