형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

Summary

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

진화적으로 보존된 옥시스테롤 결합 단백질(OSBP)-관련 단백질(ORP)/OSBP 동종학(Osh) 패밀리의 몇몇 구성원은 최근 효모 및 인간 세포에서 새로운 지질 전달 단백질(LTP) 그룹을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그들은 내피 성 망상 (ER)에서 PS /phosphatidylinosol 4-인산염 (PI(4)P) 교환 주기를 통해 혈장 막 (PM)으로 인산화 (PS)를 전송합니다. 이 발견은 신호 프로세스에 중요한 PS가 세포 전체에 분포되는 방법과 이 과정과 인포이노시타이드 (PIP) 대사 사이의 링크의 조사를 더 잘 이해할 수 있게 합니다. 새로운 형광 기반 프로토콜의 개발은 분자 수준에서 시험관내의 이 새로운 세포 기계장치의 발견 그리고 특성화에 중요한 역할을 했습니다. 이 논문은 두 개의 형광 표기 지질 센서, NBD-C2_Lact 및 NBD-PH_FAPP의생산 및 사용을 설명하며, PS 또는 PI(4)P를 추출하는 단백질의 능력을 측정하고 인공 막 사이에 이러한 지질을 전달합니다. 첫째, 프로토콜은 이 두 구문중의 고순도 샘플을 생성, 레이블 및 얻는 방법을 설명합니다. 둘째, 이 논문은 Osh6p를 사례 연구로 사용하여 단백질이 리포솜에서 PS 또는 PI(4)P를 추출할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 형광 마이크로 플레이트 판독기와 이러한 센서를 사용하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 정의된 지질 조성물의 지질성 간의 PS/PI(4)P 교환의 운동학을 정확하게 측정하고 표준 형광계를 사용하여 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의한 지질 전달 속도를 결정하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

다른 막 사이 및 진핵 세포의 막 내지질의 정확한 분포^1,2는 심오한 생물학적 연루가 있습니다. LtP함수가 세포 생물학^{3,4,5,6에서}중요한 문제이며 시험관 내 접근 방식은 이 문제점^{7,8,9,10,11을}해결하는 데 큰 가치가 있다. 여기서, 체외,형광계 전략은 여러 ORP/Osh 단백질이 PS/PI(4)P 교환을^{세포막(12)과} 형성....

Protocol

1. NBD-C2_수유의 정화

참고: 이 프로토콜은 박테리아를 부러뜨리기 위해 세포 파괴기의 사용을 자세히 설명하지만, 다른 용해전략(예: 프랑스 언론)을 사용하도록 수정할 수 있습니다. 정화의 시작 부분에서, 시스테인의 산화를 방지하기 위해 2mM 디티오스레이톨(DTT)으로 갓 탈착, 여과 및 보충되는 버퍼를 사용해야 한다. 그러나 단백질 라벨링 단계의 경우 DTT를 완전히 제거하는 것이 중요합니다. 단백질 분해를 피하기 위해 얼음이나 차가운 방에서 많은 단계를 수행해야 합니다. 30 μL 부피의 샘플은 15% 아크릴아미드 젤을 사용하여 나트륨 도데킬설페이트-폴리아크릴라미드 젤 전기포에 의해 분석을 수행하기 위해 프로토콜의 상이한 단계에서 수집되어야 정제의 진행 상황을 확인한다. 각 알리쿼트와 충분한 데칭 Laemmli 샘플 버퍼를 혼합하고 혼합물을 95°C에서 가열합니다. 동결 및 분석 될 때까지 -20 °C에 튜브를 저장합니다.

1. 에슈리치아 대장균의 GST-C2_Lact 의 표현
   1. BL21 골드 유능한 셀의 20 μL을 멸균 된 물 18 μL과 혼합합니다. 그런 다음 pGEX-C2_Lact 플라스미드(~65 ng/μL)....

Results

그림 1: 형광 지질 센서 및 시험관 내 작용에 대한 설명. (A)소 락타데린의 C2 도메인의 결정 구조를 기반으로 NBD-C2_Lact 및 NBD-PH_FAPP의 3차원 모델 (PDB ID: 3BN6⁴⁸⁾및 인간 FAPP1 단백질(PDB4K4K)의 PH 도메인의 NMR 구조(PDB4K: ID). An N,N'-dimethyl-N -(티오아세틸)-N'-(7-니트로벤츠-2-옥사-1,3-diazol-4-yl)에틸렌디아민모에티, 수동으로 그리고 정력적으로 최소화,.......

Discussion

이러한 아세의 결과는 형광 지질 센서의 신호에 직접적으로 의존합니다. 따라서, NBD를 가진 1:1 비율로 표기된 이들 프로브의 정제는 무료 NBD 불소포아 오염 없이 이 프로토콜에서 중요한 단계이다. 또한 검사 중인 LTP가 제대로 접혀 집계되지 않았는지 확인해야 합니다. 추출 분석에서 테스트된 LTP의 양은 이 LTP가 이러한 지질을 효율적으로 추출하는지 여부를 적절하게 측정하기 위해 접근 가능한 PS 또는 PI(4)P 분자보다 동일하거나 높아야 합니다. 실제로, NBD-C2_Lact 및 NBD-PH_FAPP는 각각 고전적인 포화 결합 곡선에 따라 PS와 PI(4)P에 결합합니다. PS와 PI(4)P에 대한 각각의 친화성을 감안할 때, 이러한 프로브는 리포솜이 이러한 리간드의 잔류 흔적을 포함하더라도 리포솜에 크게 묶여 있습니다. 이것은 LTP가 효율적으로 이 지질을 추출하지 않는다는 잘못된 결론으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 및 시판 가능한 PC, PS 및 PI(4)P .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-시스테인 ≥ 97 % (FG)	Sigma	W326305-100G	물에 10mM L-시스테인 원액을 준비합니다. 부분 표본은 -20 °에 저장됩니다. C
2 mL 앰버 바이알, PTFE/Rub Lnr, CHCL3	Wheaton	W224681
4 mm 직경의 유리 구슬	Sigma	Z265934-1EA
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	Falcon
Ä의 지질 저장용; KTA 청정기	GE 헬스케어		FPLC
알루미늄 호일
Amicon Ultra-15는 MWCO가 3 및 10 kDa	Merck	UFC900324이고, UFC901024
Amicon Ultra-4는 MWCO가 3 및 10 kDa	Merck	UFC800324이며, UFC801024
Ampicillin			은 여과 및 멸균된 물로 50 mg/mL 재고 용액을 준비하고 -20 & deg;C입니다.
Bestatin	Sigma	B8385-10mg
BL21 골드 컴피턴트 셀	애질런트
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P	Echelon Lipids	P-4016-3	1mg의 C16:0/C16:0-PI(4)P 분말을 250 µ에 용해시킵니다. MeOH의 L 및 250 &마이크로; CHCl3의 L. 그런 다음 CHCl3를 1mL로 만듭니다. 해결책이 명확해져야 합니다.
CHCl3(10mg/mL)의 C16:0/C18:1-PS(POPS)
	Sigma		물에 10mM CaCl2 원액을 준비합니다.
세포 교란 물질	상수 역학
클로로포름(CHCl3) RPE-ISO	Carlo Erba	438601
완전한 EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일	Roche	5056489001
탈이온(Milli-Q) 물
디메틸포름아미드(DMF), 무수, >99% 순수
DNAse I 재조합, RNAse 무료, 분말내	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	Milli-Q 물에 1 M DTT 원액을 준비합니다. 1mL 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
Econo-Pac 크로마토그래피 컬럼(1.5 × 12 cm).	Biorad	7321010
Electroporation 큐벳 2 mm	Ozyme	EP102
Electroporator Eppendorf 2510	Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes	Beckman	Spinning the batcerial lysate
Glass-syringes (10, 25, and 50 µ L) 형광 실험용	Hamilton
Glass-syringes (25, 100, 250, 500, and 1000 µ L) 지질 원료 용액 처리	Hamilton	1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
글루타티온 세파로스 4B 비드	GE Healthcare	17-0756-05
글리세롤 (99% 순수)	Sigma	G5516-500ML
캡이 있는
HEPES, >99% 순수	Sigma	H3375-500G
Illustra NAP 10 탈염 컬럼	GE 헬스케어	GE17-0854-02
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)	Euromedex	EU0008-B	Milli-Qwater에서 1M IPTG 원액을 준비합니다. 1mL 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
K-Acetate	Prolabo	26664.293
Lennox LB 포도당			milli-Q 물로 제조하고 오토클레이브합니다.
액체 질소	린데
메탄올 (MeOH) ≥ 99.8%	VWR	20847.24
MgCl2	Sigma		2 M MgCl2 용액을 준비합니다. 0.45 µ를 사용하여 용액을 필터링합니다. M 필터.
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding	Greiner Bio-one	655900
미니 압출기, 1mL 기밀 Hamilton 주사기 2개	, Avanti Polar Lipids	610023
모노크로메이터 기반 형광 플레이트 리더	TECAN	M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD 아미드)	분자 프로브는		2.5mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 25mg의 IANBD를 용해하고 100 µ의 25개 부분 표본을 준비합니다. 1.5mL 나사 캡 튜브의 L. 캡을 완전히 조이지 마십시오. 그런 다음 동결 건조기에서 DMSO를 제거하여 튜브당 1mg의 건조 IANBD를 얻습니다. 튜브는 닫히고 -20 °에서 보관됩니다. 어둠 속의 C.
NaCl	시그마	S3014-1KG
PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, 4°C에서 고압멸균 및 보관.
배 모양의 유리 플라스크 (25 mL, 14/23, Duran 유리)	Duran Group
Pepstatin	Sigma	p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid			우리 실험실에서 요청 시 사용 가능
pGEX-PHFAPP 우리			실험실에서 요청 시 사용
가능 Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &지; 98.5% (GC)	Sigma	P7626-25g
폴리카보네이트 필터(직경 19mm)에 200mM PMSF 원액을 준비합니다. m	Avanti Polar Lipids	610006
Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼(0-2 mL 베드 용량 및 10 mL 리저브 포함)Biorad		7311550
Prefilters(직경 10 mm).	Avanti Polar Lipids	610014
PyMOL	http://pymol.org/		단백질의 3D 모델 구성(그림 1A)
UV/가시광선 형광용 석영 큐벳(최소 부피 600 µ L)	Hellma
석영 큐벳	Hellma
냉장 원심분리기  Eppendorf 5427R	Eppendorf
Rotary evaporator	Buchi	B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)	Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tube (0.5, 1, and 2 mL)	Eppendorf
SYPRO orange			SDS-PAGE 젤에서 단백질을 검출하기 위한 형광 염색
Thermomixer	Starlab
THROMBIN, 인간 플라즈마	Sigma	10602400001	20 단위를 1 mL의 milli-Q 물에 용해시키고 25 µ를 준비합니다. 0.5 mL Eppendorf tube의 L 분취량. 그런 다음 얼리고 -80 °C에서 보관하십시오.
Tris, 초순수	MP	819623
초원심분리기 L90K	Beckman
UV/가시광선 분광 광도계	SAFAS
UV/가시광선 분광광도계 온도 제어 셀 홀더 및 교반 장치가 있는	Jasco 또는 Shimadzu	Jasco FP-8300 또는 Shimadzu RF-5301PC
진공 챔버
Sephacryl S200HR로 패킹된