내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

Summary

여기서 엡스타인 바 바이러스에서 내인적으로 발현된 RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 연구하는 데 사용되는 방법은 인간 B-림프구및 근육 생검 유래 위성 세포가 심투로 분화되어 설명된다.

Abstract

RYR1 유전자에 있는 700개 이상의 변이체는 악성 고열증 감수성, 코어 근병증 및 중핵 근병증을 포함하여 다른 신경 근육 무질서를 가진 환자에서 확인되었습니다. RYR1 돌연변이에 연결된 다양한 표현형 때문에 미래의 치료 내정간섭을 위해 환자에 의해 운반된 이체를 분류하고 비 병원성 이체를 확인하기 위하여 그들의 기능적인 효력을 특성화하는 것이 근본적입니다. 많은 실험실은 환자의 세포에서 발현된 RYR1 돌연변이를 기능적으로 특성화하는 방법을 개발하는 데 관심이 있습니다. 이 접근법은 돌연변이가 내인적으로 표현되고, RyR1은 과도하게 표현되지 않으며, 세포를 표현하는 이종성 RyR1의 사용은 피할 수 있습니다. 그러나, 환자가 RYR1을 제쳐두고 다른 유전자에 있는 돌연변이를 제출할 수 있기 때문에, 다른 유전 배경으로, 동일 돌연변이를 품고 있는 개별에게서 생물학 자료에서 결과를 비교하는 것이 중요합니다. 본 원고는 내인성 RYR1 변이체의 기능적 효과를 연구하기 위해 개발된 방법을 설명합니다: (a) 엡스타인 바 바이러스는 인간 B-림프구와 (b) 위성 세포가 근육 생검에서 파생되어 심튜브로 분화된다. 약리학 RyR1 활성제의 첨가에 의해 트리거된 세포내 칼슘 농도의 변경은 그 때 감시됩니다. 선택된 세포 유형은 형광칼슘 표시기와 세포내 [Ca^2+]변화가 형광 현미경 검사법에 의해 또는 분광성계를 이용한 세포 집단에서 단일 세포 수준에서 모니터링된다. 휴식 [Ca^2+],고뇌 용량 반응 곡선은 건강한 대조군에서 세포와 주어진 변이체의 기능적 효과에 대한 통찰력으로 이어지는 RYR1 변이체를 수용하는 환자 사이에서 비교됩니다.

Introduction

현재까지 700개 이상의 RYR1 변이체가 인간 인구에서 확인되었으며 악성 고열혈증(MHS), 운동 유도 래브도모분해증, 중앙핵심질환(CCD), 다중미니코어질환(MmD), 원핵근병증(CNM)^1,2,3,3 ; 그럼에도 불구 하 고, 그들의 기능 효과 특성화 하는 연구는 뒤쳐지고 돌연변이의 단지 약 10%는 기능적으로 테스트 되었습니다. 다른 실험 적 접근 방식은 주어진 RyR1 변종의 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다, WT 및 돌연변이 RYR1 cDNA^4,5,WT 및 돌연변이 RYR1 cDNA에 대한 인코딩을 이용한 소화관 마우스 섬유아세포의 트랜스듀싱, 마이오-다이코-D-D-Tube로의 트랜스포메이션을 포함하는 등 이종세포의 이식 , 돌연변이 RyR1s^7,8,9,RYR1 변종을 내인적으로^10,11,12로표현하는 환자로부터 세포의 특성화를 운반하는 형질전환 동물 모델의 생성. 이러한 방법은 다른 돌연변이가 RyR1 Ca²⁺ 채널에 기능적으로 미치는 영향을 확립하는 데 도움이 되었습니다.

여기서, RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 평가하기 위해 개발된 방법이 기재되어 있다. 세포내 칼슘 간이성의 다양한 매개 변수는 심오튜브및 엡스타인 바 바이러스(EBV) 불멸의 B-림프구를 포함하여 RyR1 칼슘 채널을 내인성으로 표현하는 인간 세포에서 조사됩니다. 세포는 환자로부터 얻어지며, 배양에서 확장되고 후라-2 또는 인도-1과 같은 형광칼슘 내감이 적재된다. 휴식 [Ca^2+]를포함하는 병원성 RYR1 돌연변이로 인해 변경되는 것으로 보고된 파라미터는 상이한 약리학 작용제에 대한 민감도 및 세포내 Ca²⁺ 상점의 크기가 단일 세포 수준에서 측정되며, 형광 현미경 을 사용하거나, 불소계를 사용하는 세포 집단에서 측정된다. 돌연변이 운반대에서 세포에서 얻은 결과는 건강한 통제 가족 구성원에게서 얻은 것과 비교됩니다. 이러한 접근법은 (i) MHS에 연결된 많은 돌연변이가 휴식의 증가[Ca^2+]및 KCl 유도탈극화 또는 약리학 RyR1 활성화에 대한 투여반응 곡선의 좌측으로의 이동을 4-클로로-m-cresol^{10,11,12,13으로}유도하는 것으로 입증되었다. (ii) CCD에 연결된 돌연변이는 RyR1의 약리학적 활성화에 의해 방출된 피크 [Ca^2+]의감소로 이어지고 세포내 Ca^{2+ 저장12, 13,14,15;} (iii) 일부 변종은 Ca2 + 항상성^(13)에영향을 미치지 않습니다. 이 실험적인 접근법의 장점은: RyR1 단백질은 과발현되지 않으며 생리학적 수준이 존재하며, 세포는 돌연변이를 포함하는 세포주를 제공하는 불멸(근육 세포 및 B-림프구 모두)이 존재할 수 있다. 몇몇 단점은 환자가 칼슘 항상성 및/또는 자궁 수축 커플링 (ECC)에 관련되되거나 흥분 수축 에 관련되되거나 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에 있는 돌연변이를 전송할 수 있다는 사실과 관련이 있고 이것은 실험적인 결론을 복잡하게 할 수 있습니다. 예를 들어, 2개의 JP-45 변이체는 MHS 및 대조군 군수에서 확인되었고, 이들의 존재는 디하이드로피리딘 수용체(DHPR)의 감도에 영향을 미치는 것으로^{나타났다(16).} 환자는 사용할 수 있어야, 생물학적 물질은 갓 수집할 필요가 있으며 윤리적 허가는 지역 윤리 위원회에서 얻을 필요가있다.

Protocol

아래에 설명된 프로토콜은 에티코미미션 노르드웨스트-und Zentralschweiz EKNZ의 윤리 지침을 준수합니다.

1. 엡스타인 바 불멸의 B 림프구 세포주^11의 준비

1. 통보된 동의 후에는 RYR1 돌연변이를 운반하는 프로밴드와 돌연변이가 없는 건강한 가족 구성원으로부터 EDTA 처리된 멸균 관에서 30mL의 전혈을 수집합니다.
   참고: 모든 솔루션을 멸균 상태로 유지하고 조직 배양 후드에서 작업하십시오.
2. 밀도 그라데이션 원심 분리 매체(예: Ficoll-Hypaque, .077 g/L)에 의해 전혈에서 단핵 세포를 분리합니다.
   1. 50mL 원물 멸균 튜브에 멸균 혈액 30mL를 놓습니다.
   2. 밀도 그라데이션 원심 분리 매체를 포함하는 파스퇴르 파이펫의 끝을 튜브 의 바닥에 놓고 20 mL 의 밀도 그라데이션 원심 분리 미디어 용액의 밀도 그라데이션 원심 분리 미디어 용액을 혈액 아래에 천천히 놓습니다.
   3. 18°-20°C에서 900 x g에서 30분 동안 원심분리기는 휴식 없이.
      참고: 단핵 세포 층은 밀도 그라데이션 원심 분리 미디어 층과 혈소판 농축 플라즈마를 포함하는 상부 층 사이의 중간 단계에서 흐린 고리로 나타납니다.
3. 멸균 파이펫을 사용하면 단핵 세포(약 3-5mL)를 함유한 상 간 층을 부드럽게 제거하고 용액을 깨끗한 50mL 멸균 원문 튜브로 이송한다.
4. 20mL의 인산염 완충식염식염수(PBS)를 추가하여 세포를 헹구고, 실온에서 600 x g에서 10분 동안 원심분리기를 추가하고 PBS에서 펠릿을 재놓습니다. 총 세 번 반복; 이렇게 하면 모든 미디어가 제거됩니다.
5. 마지막 세척 후, 조직 배양 배지의 1-2 mL에서 세포를 다시 중단 (RPMI 배지는 10 % 태아 송아지 혈청, 2 mM L-글루타민, 그리고 페니실린과 연쇄 절제술의 100 단위로 보충). 조직 배양 배지의 20mL를 포함하는 T125 조직 배양 플라스크에 단핵 세포(약 1 x 10⁶ 세포)를 놓습니다.
6. 엡스타인-바 바이러스로 단일 핵 세포를 감염시보종.
   1. B95.8 세포주 배양(--80°C에 비축된 10^2-103 변환 단위/mL 포함)로부터 의 초월제를 EBV의 원천으로 사용한다.
   2. 1 x 10⁶ 단핵 세포를 조직 배양 배지의 20mL에서 1.5단계에서 재중단하고 감염을 위한 사이클로스포린 A(0.2 μg/mL 최종 농도)의 존재시 B95.8 세포주에서 2mL의 초판에 노출한다.
7. 플라스크를 37°C 세포 배양 인큐베이터에 배치하고 세포가 성장할 수 있도록 합니다. 1 주일 후 문화 매체를 변경합니다.
   참고: 일단 B 세포가 증식하기 시작하면 인식 가능한 덩어리를 형성하고 배양을 확장하고 동결할 수 있도록 빠르게 성장합니다.
8. EBV 불멸의 B-림프구^{세포주(11)로부터} 게놈 DNA를 추출하여 주어진 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인한다.

2. 셀룰러 Ca²⁺ 측정

참고: EBV 변형 B-림프구 세포주의 세포수의 세포내 칼슘 농도의 변화는 37°C로 설정된 자기 교반기 및 큐벳 홀더가 장착된 분광성계와 함께 세포 집단에서 모니터링될 수 있다. 대안적으로 Ca²⁺ 변경은 형광 현미경 검사법에 의해 단하나 세포에서 감시될 수 있다. 두 경우 모두 세포가 조직 배양 플라스크로부터 제거되고, 크렙스 링거용(140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl_2,20mM HEPES, 1mM NaHPO_4,5.5mMMMM포도당, pH 7.4함유 1mM CaCl_2)으로두 번 세척하고 계산하였다.

1. 분광성로계^11,13,14를 이용한 세포 집단실험용
   1. 크렙스 링거의 용액에서 1 x 10⁷ 셀/mL의 최종 농도로 세포를 다시 중단하고 최종 농도5 μM Fura-2/AM의 최종 농도로 30분 동안 37°C에서 배양합니다.
   2. 원심분리기 세포는 900 x g에서 10분 동안 2 x 10⁶ 셀/mL 농도로 크렙스 링거의 용액에서 다시 분리합니다.
   3. 최대 속도로 설정된 자기 교반기가 장착된 분광성계를 사용하여 형광 변화(비율 340/380 nm)를 측정하여 37°C로 설정합니다.
   4. 실험 직전에 마이크로 센심 분리기에서 5 분 동안 900 x g에서 세포를 회전시키고 0.5 mMM EGTA로 Krebs Ringer의 용액의 1.5 mL에서 펠릿을 신속하게 재일시 중단하지만 Ca^{2 +}추가되지 않았습니다.
   5. 세포를 3mL 유리 분광계 큐벳에 넣고 형광 비율(340 nm/380 nm 발산, 510 nm 방출)을 기록합니다.
   6. 안정적인 베이스 라인(약 30초)을 달성하고, RyR1 작용제(4-클로로-m-크레솔 또는 4-cmc)의 선택된 농도를 추가하고 칼슘 과도를 기록한다.
      참고: DMSO에서 만든 4-cmc의 300 mM 스톡 솔루션은 시약으로 사용됩니다. 이 용액은 사전에 만들 수 있으며, 알리인용 및 수개월 동안 -20°C로 저장될 수 있다.
   7. 다른 4-cmc 농도에 대한 실험을 수행합니다.
      참고: 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM 내지 1mM를 포함하여 [Ca^2+]의변화에 비해 작용제의 투여 반응 곡선을 생성한다. 상이한 4-cmc 농도는 주식 용액으로부터 4-cmc의 적절한 부피를 후라-2 로드 셀을 포함하는 큐벳에 직접 첨가함으로써 얻어진다. 예를 들어, 300 μM 4-cmc의 최종 농도를 위해, 크렙스 링거용의 용액에서 1.5mL의 세포를 함유한 큐벳에 스톡 용액의 1.5 μL이 첨가된다. 저고농가 농도의 경우, 300mM 스톡 용액은 DMSO로 75mM로 희석되어야 하며 크렙스 링거 용액에 1.5mL의 세포를 함유한 큐벳에 적절한 부피를 첨가해야 한다.
   8. 세포 내 저장소에 존재하는 Ca²⁺ 총 양을 계산하기 위해 셀에 400 nM thapsigargin을 추가합니다. 피크 Ca²⁺기록합니다.
   9. 주어진 4-cmc 농도에 의해 유도 된 피크 칼슘을 플롯 하 고 100%로 간주 되는 최고 칼슘, 프로밴드와 건강 한 친척에서 세포를 비교 하는 4 cmc 용량 응답 곡선을 구성
2. 단일 세포에 대한^{실험용 13}
   1. 폴리 L-리신 을 희석 1:10 멸균 H₂O에 넣고 유리 커버립을 30 분 동안 미리 처리하십시오. 멸균 조직 배양 후드 아래에서 공기 건조를 허용하십시오.
   2. EBV 변형 B-림프구를 1 mM CaCl_2를 포함하는 Krebs 링거의 용액에서 1 x 10⁶ 세포/mL의 최종 농도로 재중단하고 5 μM Fura-2/AM의 최종 농도를 추가합니다.
   3. EBV 세포가 적재 시 유리 커버슬립에 충실할 수 있도록 30분 동안 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 폴리-L-리신 처리커버리 처리된 커버립및 인큐베이션에 1mL의 세포를 배치한다.
   4. 관류 챔버에 커버 슬립을 놓고 1 mM Ca^{2 +}크렙스 링거의 용액으로 관류 (2 mL / 분의 속도로)를 시작합니다.
   5. 반전형 현미경(40배 오일 침지 목표(0.17 개구체), 필터(BP 340/380, FT 425, BP 500/530)를 사용하여 소프트웨어 제어 충전 결합 장치(CCD) 카메라 부착 장치(CCD) 카메라 부착장치(CCD) 카메라 부착장치로 온라인 측정을 기록합니다.
   6. 고정 된 노출 시간에 1 간격으로 이미지를 획득 (340- 및 380-nm 흥분 파장에 대한 100 ms. 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광의 변화를 분석합니다. 각 셀의 평균 픽셀 값을 340 및 380 nm^13의각 셀에서 측정합니다.
   7. 세포 자극을 달성하기 위해 12개의 밸브가 있는 세포 관류 자극기를 사용하고 4-cmc의 다른 농도를 추가하십시오. 플러시 밸브에는 Ca²⁺ 플러스 100 μM La^3+가 추가되지 않은 크렙스 링거의 솔루션이 포함되어 있어 세포내 매장에서만 칼슘 방출을 모니터링합니다.
   8. 전술한 바와 같이 [Ca^2+]의변화 대 4-cmc의 투여량 반응 곡선을 구성한다.

3. 근육 생검에서 인간 심투의 준비^10,12,15

참고: 위성 세포 유래 근세포 및 근궤투를 얻기 위해 다른 실험실에서 다른 방법을 사용했습니다. 다음은 바젤에서 사용되는 방법에 대한 설명입니다.

1. 멸균 PBS로 근육 생검을 헹구고 과도한 혈액을 제거하고 약 0.5-1 mm의 작은 조각으로 자른다.
2. 삽입하여 6 개의 잘 조직 문화 요리를 준비하십시오. 각 우물에 인간 근육 성장 매체의 1.5 mL을 추가하고 각 삽입에 인간 근육 성장 배지의 0.5 mL.
   참고: 성장 배지는 다음과 같이 구성: 500 mL 의 Dulbecco의 수정 된 독수리의 매체 높은 포도당, 또는 DMEM (4.5 mg/mL), 포함 10% 말 혈 청, 5 ng/mL 인슐린, 3 mM 글루타민, 600 ng/mL 페니실린 G 와 streptomyin G 와 streptomyin, 7M, 7M 시판되는 골격 근육 성장 배지도 사용할 수 있습니다.
3. 각 인서치(도1A)에2-3개의 작은 근육 조각을 넣고 배양 접시를 세포 배양 인큐베이터(5% CO_2,37°C)에 넣습니다. 약 8-10일 후에 위성 세포는 인서트(도1,B 및 C, 화살표)에 부착된 근육 생검에서 자라는 것을 볼 수 있다.
4. 생검에서 충분한 수의 세포를 방출 (약 10-14 일 후), 다음과 같이 트립시니즈 :
   1. 모든 배양 배지를 제거하고, PBS 1mL로 세포를 헹구고, 트립신/EDTA 용액(0.025% 트립신 및 0.01% EDTA)을 넣고 37°C에서 5분 동안 배양한다.
   2. 트립신의 효과를 중화시키고 위성 세포를 새로운 T25 세포 배양 플라스크로 전송하기 위해 세포에 성장 배지 1mL을 추가합니다. 성장 배지의 3mL를 추가하고 세포 배양 인큐베이터 (5 % CO_2,37 °C)에 세포를 배치합니다.
   3. 다음날 성장 배지를 변경하여 EDTA를 제거하고 주당 한 번씩 배지를 변경합니다.
5. 근사세포가 약 75% 컨실수있는 경우, 트립시니화하여 라미닌 처리 유리 커버슬립으로 옮겨넣습니다.
   참고: 비율로, 하나의 T25 플라스크에서 성장하는 세포는 하나의 직경 43mm 라미닌 처리 유리 커버 슬립에 전달되어야한다. 유리 커버슬립은 성장 배지의 3mL를 포함하는 60mm 직경 조직 배양 판 내에 놓아야 한다.
6. 세포 배양인배기(5%_CO2,37°C)에서 성장 배지에서 유리 커버슬립에 세포를 성장시키면 배지를 일주일에 한 번 변화시키게 된다. 90%의 합류율에서, 다음과 같이 구성된 분화 매체로 전환: 높은 포도당 DMEM (4.5 mg/mL), 0.5% 소 혈청 알부민, 10 ng/mL 표피 성장 인자, 0.15 mg/mL 크레아틴, 5 ng/mL 인슐린, 200 mM글루타민, 600 ng/mL 페니실린 G 및 연쇄절제술, 및 7 mM HEPES, pH 7.4). 시판적으로 이용 가능한 분화 배지도 사용될 수 있다. 일주일에 한 번 분화 매체를 변경합니다.
7. 분화 배지에서 7-10일 후에, 다중 핵으로 된 근소튜브가 보입니다. 아래에 설명된 바와 같이 1주일 이내에 [Ca^2+]변경 사항을 평가합니다.

4. [Ca²⁺] 후라-2로 결정된_i 비율 측정

1. 로드 유리 커버슬립은 37°C에서 30분 동안 DMEM에서 희석된 후라-2/AM(최종 농도 5 μM)으로 심튜브를 재배했습니다. 간단히, 유리 커버슬립 성장 세포로부터 분화 배지를 제거하고 2mL 의 신선한 분화 배지를 추가한다. 1mM의 스톡 용액으로부터 후라-2 AM10μL을 추가하고 세포 배양 인큐베이터(5% CO_2,37°C)에서 30분 배양한다.
2. 2 mM CaCl_2를포함하는 크렙스 링거의 용액으로 유리 커버슬립을 관류 챔버로 옮기고 세포를 헹구는다.
3. EBV 단세포 섹션에서 상술한 바와 같이 온라인 [Ca^2+]측정을 수행하여 20배 물 침수 FLUAR 목표(0.17 수치 조리개)를 사용한다.

Results

[Ca^2+]_EBV 불멸의 B 림프구의 인구에서 측정
1차 B-림프구는 B 세포 항원 수용체 자극 시신호^{공정(17)에서}Ca²⁺ 방출 채널로 작동하는 RyR1 이소형을 발현한다. EBV를 이용한 B세포의 불멸은 유전학자가 일상적으로 환자의 게놈 정보를 포함하는 세포주를 얻기 위해 사용되는 절차로서, RYR1 돌연변이를 품고 있는 환자에서 돌연변이 RyR1 Ca²⁺ 채널을 발현하는 세포주를 생성하는 이점을^{제공한다1 11,13.} 【Ca²⁺】 4-클로로-m-크레솔(18)과 같은 특정 RyR1 작용제의

Discussion

이 논문에 기술된 프로토콜은 칼슘 항상성에 RYR1 돌연변이의 충격을 연구하기 위하여 몇몇 실험실에 의해 성공적으로 이용되었습니다. 이 논문에 설명된 접근법의 중요한 단계는 생물 물질의 불임, 세포 배양 기술 및 기술 및 가용성을 다룹니다. 원칙적으로 EBV-불멸의 B 림프구의 사용은 간단하며 돌연변이 RyR1 채널을 포함하는 세포주를 생성할 수 있습니다. 세포는 수년 동안 액체 질소에 동결및 저장될 수 있으며 배양은 언제든지 다시 시작할 수 있습니다. 추가적으로, 세포 인구에 있는 칼슘 항상성을 감시할지 또는 단 하나 세포 수준에서 선택할 수 있습니다. 이전 방법은 간단하고, 형광 현미경을 필요로하지 않으며, 조사관이 짧은 기간 내에 다른 개별에게서 생성된 세포주를 시험할 수 있게 합니다. 제한은 세포 성장의 속도와 완전 장착 (가열 및 자기 교반기) 분광계의 가용성인. 형광칼슘 지표와 함께 세포측정을 사용하는 대체 접근법으로 EBV-불멸의 B 림프구에서 칼슘 플럭스를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 방식으로 세포내 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-chloro-m-cresol	Fluka	24940
혈액 수집 튜브	Sarstedt	172202
소 혈청 알부민(BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
카페인	Merk	102584
캐스케이드 125+ CCD 카메라	광도 캐
스케이드 128+ CCD	광도 측정
크레아틴	, 시그마-알드리치	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific	, 11965092
DMSO	시그마	41639
EGTA,	플루카	3778
표피 성장 인자(EGF)	시그마-알드리치,	E9644
Ficoll Paque	, Cytiva	17144002
태아 송아지 혈청	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
말 혈청	Thermo Fisher Scientific	16050122
인슐린	ThermoFisher Scientific	A11382II
Ionomycin	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Lanthanum	Fluka	61490
Microperfusion system	ALA-Scientific	DAD VM 12 밸브 매니폴드
Origin Software	OriginLab Corp	소프트웨어
페니실린/스트렙토마이신	Gibco Life Sciences	15140-122
관류 챔버 POC-R	Pecon	000000-1116-079
폴리-L-라이신	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
분광 형광계	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
조직 배양 접시	Falcon	353046
조직 배양 플라스크	Falcon	353107
조직 배양 인서트	Falcon	353090
트립신/EDTA 솔루션	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	Visitron Systems GmbH	Software
Zeiss Axiovert S100 TV 현미경	Carl Zeiss AG
Zeiss 유리 커버 슬립	Carl Zeiss AG	0727-016