여기서 엡스타인 바 바이러스에서 내인적으로 발현된 RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 연구하는 데 사용되는 방법은 인간 B-림프구및 근육 생검 유래 위성 세포가 심투로 분화되어 설명된다.
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이 논문에서
요약
초록
RYR1 유전자에 있는 700개 이상의 변이체는 악성 고열증 감수성, 코어 근병증 및 중핵 근병증을 포함하여 다른 신경 근육 무질서를 가진 환자에서 확인되었습니다. RYR1 돌연변이에 연결된 다양한 표현형 때문에 미래의 치료 내정간섭을 위해 환자에 의해 운반된 이체를 분류하고 비 병원성 이체를 확인하기 위하여 그들의 기능적인 효력을 특성화하는 것이 근본적입니다. 많은 실험실은 환자의 세포에서 발현된 RYR1 돌연변이를 기능적으로 특성화하는 방법을 개발하는 데 관심이 있습니다. 이 접근법은 돌연변이가 내인적으로 표현되고, RyR1은 과도하게 표현되지 않으며, 세포를 표현하는 이종성 RyR1의 사용은 피할 수 있습니다. 그러나, 환자가 RYR1을 제쳐두고 다른 유전자에 있는 돌연변이를 제출할 수 있기 때문에, 다른 유전 배경으로, 동일 돌연변이를 품고 있는 개별에게서 생물학 자료에서 결과를 비교하는 것이 중요합니다. 본 원고는 내인성 RYR1 변이체의 기능적 효과를 연구하기 위해 개발된 방법을 설명합니다: (a) 엡스타인 바 바이러스는 인간 B-림프구와 (b) 위성 세포가 근육 생검에서 파생되어 심튜브로 분화된다. 약리학 RyR1 활성제의 첨가에 의해 트리거된 세포내 칼슘 농도의 변경은 그 때 감시됩니다. 선택된 세포 유형은 형광칼슘 표시기와 세포내 [Ca2+]변화가 형광 현미경 검사법에 의해 또는 분광성계를 이용한 세포 집단에서 단일 세포 수준에서 모니터링된다. 휴식 [Ca2+],고뇌 용량 반응 곡선은 건강한 대조군에서 세포와 주어진 변이체의 기능적 효과에 대한 통찰력으로 이어지는 RYR1 변이체를 수용하는 환자 사이에서 비교됩니다.
서론
현재까지 700개 이상의 RYR1 변이체가 인간 인구에서 확인되었으며 악성 고열혈증(MHS), 운동 유도 래브도모분해증, 중앙핵심질환(CCD), 다중미니코어질환(MmD), 원핵근병증(CNM)1,2,3,3 ; 그럼에도 불구 하 고, 그들의 기능 효과 특성화 하는 연구는 뒤쳐지고 돌연변이의 단지 약 10%는 기능적으로 테스트 되었습니다. 다른 실험 적 접근 방식은 주어진 RyR1 변종의 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다, WT 및 돌연변이 RYR1 cDNA4,5,WT 및 돌연변이 RYR1 cDNA에 대한 인코딩을 이용한 소화관 마우스 섬유아세포의 트랜스듀싱, 마이오-다이코-D-D-Tube로의 트랜스포메이션을 포함하는 등 이종세포의 이식 , 돌연변이 RyR1s7,8,9,RYR1 변종을 내인적으로
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프로토콜
아래에 설명된 프로토콜은 에티코미미션 노르드웨스트-und Zentralschweiz EKNZ의 윤리 지침을 준수합니다.
1. 엡스타인 바 불멸의 B 림프구 세포주11의 준비
- 통보된 동의 후에는 RYR1 돌연변이를 운반하는 프로밴드와 돌연변이가 없는 건강한 가족 구성원으로부터 EDTA 처리된 멸균 관에서 30mL의 전혈을 수집합니다.
참고: 모든 솔루션을 멸균 상태로 유지하고 조직 배양 후드에서 작업하십시오. - 밀도 그라데이션 원심 분리 매체(예: Ficoll-Hypaque, .077 g/L)에 의해 전혈에서 단핵 세포를 분리합니다.
- 50mL 원물 멸균 튜브에 멸균 혈액 30mL를 놓습니다.
- 밀도 그라데이션 원심 분리 매체를 포함하는 파스퇴르 파이펫의 끝을 튜브 의 바닥에 놓고 20 mL 의 밀도 그라데이션 원심 분리 미디어 용액의 밀도 그라데이션 원심 분리 미디어 용액을 혈액 아래에 천천히 놓습니다.
- 18°-20°C에서 900 x g에서 30분 동안 원심분리기는 휴식 없이.
참고: 단핵 세포 층은 밀도 그라데이션 원심 분리 미디어 층과 혈소판 농축 플라즈마를 포함하는 상부 층 사이의 중간....
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결과
[Ca2+]EBV 불멸의 B 림프구의 인구에서 측정
1차 B-림프구는 B 세포 항원 수용체 자극 시신호공정(17)에서Ca2+ 방출 채널로 작동하는 RyR1 이소형을 발현한다. EBV를 이용한 B세포의 불멸은 유전학자가 일상적으로 환자의 게놈 정보를 포함하는 세포주를 얻기 위해 사용되는 절차로서, RYR1 돌연변이를 품고 있는 환자에서 돌연변이 RyR1 Ca2+ 채널을 발현하는 세포주를 생성하는 이점을제공한다1 11,13. 【Ca2+】 4-클로로-m-크레솔(18)과 같은 특정 RyR1 작용제의
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토론
이 논문에 기술된 프로토콜은 칼슘 항상성에 RYR1 돌연변이의 충격을 연구하기 위하여 몇몇 실험실에 의해 성공적으로 이용되었습니다. 이 논문에 설명된 접근법의 중요한 단계는 생물 물질의 불임, 세포 배양 기술 및 기술 및 가용성을 다룹니다. 원칙적으로 EBV-불멸의 B 림프구의 사용은 간단하며 돌연변이 RyR1 채널을 포함하는 세포주를 생성할 수 있습니다. 세포는 수년 동안 액체 질소에 동결및 저장될 수 있으며 배양은 언제든지 다시 시작할 수 있습니다. 추가적으로, 세포 인구에 있는 칼슘 항상성을 감시할지 또는 단 하나 세포 수준에서 선택할 수 있습니다. 이전 방법은 간단하고, 형광 현미경을 필요로하지 않으며, 조사관이 짧은 기간 내에 다른 개별에게서 생성된 세포주를 시험할 수 있게 합니다. 제한은 세포 성장의 속도와 완전 장착 (가열 및 자기 교반기) 분광계의 가용성인. 형광칼슘 지표와 함께 세포측정을 사용하는 대체 접근법으로 EBV-불멸의 B 림프구에서 칼슘 플럭스를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 방식으로 세포내 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 원고에 설명 된 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNF)과 스위스 근육 재단의 보조금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| 혈액 수집 튜브 | Sarstedt | 172202 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 카페인 | Merk | 102584 | |
| 캐스케이드 125+ CCD 카메라 | 광도 캐 | ||
| 스케이드 128+ CCD | 광도 측정 | ||
| 크레아틴 | , 시그마-알드리치 | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | , 11965092 | |
| DMSO | 시그마 | 41639 | |
| EGTA, | 플루카 | 3778 | |
| 표피 성장 인자(EGF) | 시그마-알드리치, | E9644 | |
| Ficoll Paque | , Cytiva | 17144002 | |
| 태아 송아지 혈청 | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| 말 혈청 | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| 인슐린 | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 밸브 매니폴드 | |
| Origin Software | OriginLab Corp | 소프트웨어 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| 관류 챔버 POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| 폴리-L-라이신 | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| 분광 형광계 | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| 조직 배양 접시 | Falcon | 353046 | |
| 조직 배양 플라스크 | Falcon | 353107 | |
| 조직 배양 인서트 | Falcon | 353090 | |
| 트립신/EDTA 솔루션 | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV 현미경 | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss 유리 커버 슬립 | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
참고문헌
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings i....
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재인쇄 및 허가
