고체 상태 NMR에 의한 자연 막의 단백질에 대한 고해상도 연구

요약

이 작업은 동위원소 표지된 막 단백질 샘플을 준비하고 최신 고체 상태 NMR 분광법으로 고해상도로 분석하는 방법에 대한 강력한 기본 루틴을 자세히 설명합니다.

초록

멤브레인 단백질은 세포 기능에 필수적이므로 중요한 약물 표적입니다. ssNMR(Solid-state Nuclear Magnetic Resonance) 분광법은 복잡성이 증가하는 생물학적 막에서 이러한 단백질의 구조와 역학을 조사할 수 있는 고유한 액세스를 제공합니다. 여기에서는 천연 지질막과 원자 규모에서 단백질의 구조와 역학을 연구하기 위한 도구로서 최신 고체 상태 NMR 분광법을 제시합니다. 이러한 분광 연구는 고감도 ssNMR 방법, 즉 양성자(^1H) 검출 ssNMR 및 DNP(Dynamic Nuclear Polarization) 지원 ssNMR을 사용하여 이점을 얻습니다. 박테리아 외막 베타 배럴 단백질 BamA와 이온 채널 KcsA를 사용하여 동위원소 표지 막 단백질을 준비하고 ssNMR에 의해 구조 및 운동 정보를 도출하는 방법을 제시합니다.

서론

생리학적으로 관련된 환경에서 막 단백질에 대한 구조 및 운동 연구는 전통적인 구조 생물학 기술에 도전을 제기합니다¹. 현대의 고체 상태 핵 자기 공명 분광법(ssNMR) 방법은 막 단백질 ^2,3,4,5,6,7의 특성 분석을 위한 고유한 접근 방식을 제공하며 막 내장 단백질 펌프⁸, 채널 ^9,10,11 또는 수용체 ^12,13을 포함한 막 단백질을 연구하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다 ^,14,15. 초고 자기장>1,000MHz), 빠른 마법각 회전 주파수>100kHz, 과분극 기법¹⁶과 같은 기술적 발전으로 ssNMR은 리포좀에서 세포막, 심지어 전체 세포에 이르기까지 점점 더 복잡해지는 환경에서 막 단백질을 연구하기 위한 강력한 방법으로 자리 잡았습니다. 예를 들면, DNP는 그런 실험을 위한 강력한 공구가 되었다 (참고 자료 17,18,19,20,21,22,23,24,25를 보십시오). 보다 최근에는 ¹H-검출 ssNMR 이 높은 스펙트럼 해상도와 감도 25,26,27,28,29에서 막 단백질을 연구할 수 있는 가능성을 높입니다. 이 연구는 필수 기능, 즉 단백질 삽입과 이온 수송에 관여하는 두 가지 박테리아 막 단백질을 강조합니다. 해당 단백질, BamA 25,30,31,32,33 및 KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (또는 이의 키메라 변이체 ^10,40)를 ssNMR에 의해 검사했습니다 10년 이상 동안 방법.

박테리아 유래 막 단백질의 준비 및 ssNMR 특성화를 위한 대표적인 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 프로토콜의 여러 단계가 그림 1에 나와 있습니다. 먼저 BamA의 표현, 동위원소 표지, 정제 및 막 재구성에 대해 설명합니다. 그런 다음 ssNMR에 의한 막 단백질의 특성화를 위한 일반적인 작업 흐름이 제시됩니다. 특히, 빠른 마법각 회전에서 ¹H-검출 ssNMR을 사용하여 막 단백질 골격을 할당합니다. 마지막으로, ssNMR 신호 감도를 크게 향상시키는 DNP(Dynamic Nuclear Polarization) 지원 실험의 기본 설정 및 획득에 대해 자세히 설명합니다.

프로토콜

1. 획일하게 레테르를 붙인 ²H, ¹³C, ¹⁵N 레테르를 붙인 BamA-P4P5의 생산

참고: 이 프로토콜은 비병원성 그람 음성 박테리아에 대한 작업을 요구하지만, 보안경, 실험복, 장갑을 착용하고 미생물 작업을 위한 제도적 표준 운영 절차를 따르는 등 기본적인 생물학적 안전 절차를 준수해야 합니다.

1. E. coli BamA-P4P5에 대한 pET11aΔssYaeT 플라스미드 인코딩을 포함하는 E. coli BL 21 Star(DE3)의 단일 콜로니를 사용하여 50μg/L의 암피실린이 보충된 용원 배지 50mL를 접종합니다.
2. 37°C에서 200rpm에서 OD₆₀₀ 이 0.6에 도달할 때까지 배양물을 성장시킵니다. 2,000 x g 에서 10분 동안 회전합니다. 펠릿을 50mL의 M9( 표 1 참조)에서 최대 OD₆₀₀ 0.1로 재현탁합니다.
   알림: 향후 모든 성장 단계는 달리 명시되지 않는 한 위에 명시된 조건에서 발생합니다.
3. 0.5의 OD₆₀₀ 까지 배양을 성장시킵니다. 실온에서 2,000 x g 에서 10분 동안 회전합니다. 펠릿을 90%_D2O를 함유하는 50mL의 M9(레시피는 표 1 참조)에서 최대 OD₆₀₀ 중 0.1로 재현탁합니다. 30°C에서 200rpm으로 하룻밤 동안 배양물을 성장시킵니다.
4. 실온에서 10분 동안 2,000 x g 에서 배양물을 스핀다운합니다. 예열된 50mL 90% D₂O M9에서 펠릿을 최대 OD₆₀₀ 0.1로 재현탁합니다. 1.0의 OD₆₀₀ 에 도달할 때까지 성장합니다.
5. 실온에서 10분 동안 2,000 x g 에서 배양물을 스핀다운합니다. 동위원소가 농축된 양의 비농축 포도당 및 염화암모늄이 포함된 100% D₂O M9 배지 100mL를 준비합니다. 100% D₂O M9 매체에서 최대 OD₆₀₀ 0.1까지 재현탁합니다. 0.7의 OD₆₀₀ 에 도달할 때까지 성장합니다.
6. 실온에서 10분 동안 2,000 x g 에서 배양물을 스핀다운합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 동위원소가 있는 100%_D2OM9배지 500mL( 표 1 참조)에서 최대 OD₆₀₀ 중 0.1로 재현탁합니다.
7. 0.6-0.9의 OD₆₀₀ 에 도달할 때까지 배양이 성장하도록 합니다. 1mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도합니다. 4시간 동안 Express하고 실온에서 15분 동안 4,000 x g 에서 세포를 수확합니다.

2. 정제, 재접기 및 BamA-P4P5 프로테오 리포좀 형성

알림: 이 섹션의 모든 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다. 원심분리 후 튜브를 열면 유해한 에어로졸이 제한될 때 특별한 주의를 기울여야 합니다.

1. 펠릿을 얼음에 녹입니다. 펠릿을 20mL의 차가운 버퍼 1에 재현탁시킵니다. 버퍼에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.
2. 4°C에서 20분 동안 4,000 x g 에서 용액을 스핀다운합니다. 펠릿을 20mL의 차가운 증류 H₂O에 재현탁시킵니다. 현탁액을 10분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
3. 4,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 현탁액을 스핀 다운합니다. 10mL의 차가운 버퍼 2에 재현탁하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
4. 혼합물에 콜드 버퍼 2 10mL를 추가로 보충하고 얼음 위에서 30분 더 배양합니다. 0.5% n-Dodecyl-B-D-Maltoside(DDM)를 넣고 부드럽게 소용돌이칩니다.
5. 10초 길이의 켜기/끄기 펄스가 악렬하게 사용될 때까지 13kHz의 얼음 위에서 샘플을 초음파 처리합니다. 25,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 스핀다운합니다. Buffer 3 20 mL로 3회 세척합니다. 25,000 x g 에서 4°C에서 20분간 원심분리기.
6. 펠릿을 20mL의 버퍼 4에 재현탁합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양합니다. 13kHz의 얼음 위에서 샘플을 초음파 처리하고 10초 동안 긴 켜기/끄기 펄스를 사용할 때까지 사용합니다.
7. 25,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 샘플을 스핀다운합니다. 2.4-2.6단계를 반복하여 프로테아제 억제제를 첨가하지 않고 37°C에서 배양합니다.
8. 펠릿을 물 20mL로 세척하고 버퍼 3으로 두 번 세척합니다. 25,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 스핀다운합니다. 현탁액을 1mL 마이크로 원심분리기 튜브로 분취하고 벤치탑 원심분리기에서 마이크로 원심분리기 튜브를 최대 속도로 20분 동안 회전시킵니다. 개재체 순도는 10% SDS-Page gel로 평가됩니다(그림 2A 참조). 라벨링된 정제된 BamA-P4P5의 예상 수율은 30mg/L입니다.
9. 200 μL의 Buffer 5 및 300 μL의 H₂O에 개질체를 용해합니다. 6M 염화구아니듐(GdnCl)을 추가합니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 부피를 H₂O. 혼합물을 와류로 1mL로 조정하고 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 마이크로원심분리기 튜브를 주기적으로(30분마다) 소용돌이치십시오.
10. 100,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 회전합니다. Beer-Lambert의 법칙을 사용하여 단백질 농도를 280nm까지 측정합니다. 몰 흡광 계수는 117,120 M^{입니다-1 cm-1}. 농도가 >100μM인 경우 1x 버퍼 5로 6M GdnCl로 희석합니다. 버퍼 6에서 단백질을 10배 빠르게 희석합니다. 혼합물을 실온에서 밤새 배양합니다.
    참고: 초원심분리의 경우 초원심분리 등급 1.5mL 튜브를 사용하십시오.
11. semi-native SDS-Page gel을 사용하여 재접힘 효율을 측정합니다. 2.10단계에서 10μL 분취액 2개를 취하여 각 분취액에 10μL의 Lameili 완충액(버퍼 8)을 추가합니다. 1 개의 샘플을 95 ° C에서 10 분 동안 끓입니다. 다른 부분 표본은 얼음에 그대로 둡니다. 그런 다음 10% SDS-Page 젤에서 14mA로 두 샘플을 모두 실행합니다. 겔의 적층 및 실행 부분에는 환원제와 SDS가 부족합니다. 단백질 염색은 Coomassie 염료를 사용하여 이루어집니다. 예상 결과는 그림 2B에 나와 있습니다.
12. 4°C에서 20분 동안 4,000 x g 에서 샘플을 스핀다운합니다. 30kDa 원심 필터를 사용하여 시료를 8mL의 작업 부피로 농축합니다. 4,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 샘플을 회전시킵니다. 280nm에서 단백질 흡광도를 측정합니다. 2.10단계에서와 같이 단백질 농도를 측정합니다.
13. 10:1 지질 대 단백질 비율(LPR-mol/mol)에 필요한 지질의 양을 계산합니다. 클로로포름 스톡에서 2.12단계에서 계산한 대로 필요한 양의 지질을 100mL 둥근 바닥 플라스크(RBF)에 추가합니다. 부드러운 질소 흐름 아래에서 RBF에서 클로로포름을 배출합니다. RBF를 3시간 동안 고진공 상태로 놓습니다. Buffer 7 1mL로 지질막을 수화합니다. RBF를 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
14. 단백질 혼합물(2.12단계)을 RBF에 추가합니다.
15. 단백질/지질 혼합물(단계 2.14)을 RBF에서 최종 부피 50mL로 희석합니다. DMSO에 용해된 1x 프로테아제 억제제가 보충된 Buffer 7을 사용하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
16. 2주 동안 100 부피의 Buffer 7에 대해 투석합니다(12-14 kDa 분자량 차단 투석 튜브 사용). 처음 24시간 동안은 8시간마다 새로운 Buffer 7을 추가하여 실온에서 투석을 수행합니다. 그 후, 하루에 한 번 버퍼를 교체하고 4 °C에서 투석을 수행합니다.

3. ssNMR 로터 충전

1. 2.16단계 후 4°C에서 10,000 x g 에서 30-60분 동안 원심분리하여 펠릿이 형성되도록 합니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.
   참고: 아래에서 논의된 기술은 3.2mm 로터에 최적화되어 있지만 거의 모든 로터 직경에 적용할 수 있습니다.
2. 샘플을 로터에 피펫으로 넣고 테이블 원심 분리기로 동일하게 부드럽게 회전시킵니다.
   참고: 시료의 일관성에 따라 밀도 측정 도구를 사용하여 시료를 압축하거나 피펫 대신 주걱을 사용하여 시료를 로터에 넣을 수 있습니다.
3. 로터가 올바른 높이로 채워질 때까지 이 과정을 2-3회 반복하고 밀도 조정 도구의 마커 선으로 표시된 대로 캡을 위한 충분한 공간이 남아 있는지 확인합니다. 평평한 표면에서 캡 배치 도구로 로터를 닫습니다. 로터의 하단 가장자리 절반을 표시합니다.
   알림: 새로운 ssNMR 로터 세대는 로터 회전 주파수의 광학 감지를 위해 하단 가장자리에 내구성 있는 레이저 마크가 함께 제공됩니다. 그렇지 않으면 샤피 펜을 사용하는 것이 좋습니다. MAS 검출기는 Sharpie 잉크에 특별히 최적화되어 있습니다.
4. 돋보기를 사용하여 캡이 잘 배치되었는지 확인하십시오.

4. 2D ¹³C- ¹³C ssNMR 분광법에 의한 샘플 특성화

1. MAS 장치의 자동 회전 루틴을 사용하여 로터를 자석에 삽입하고 샘플을 10kHz에서 20kHz MAS 사이의 원하는 MAS 주파수까지 회전시키면서 샘플을 270K 설정 온도로 냉각합니다. ^1H및 ^13C채널을 조정하고 일치시킵니다.
   참고: MAS 주파수를 선택하려면, 스펙트럼 Cα 영역과 카르보닐 탄소 영역 사이의 화학적 이동 거리를 회전 주파수와 실수로 일치시키는 것, 즉 1차 회전 공진 조건(⁴¹)을 피하는 것을 피하십시오.
2. 양성자 채널의 rf 전력을 25-80kHz로 변경하여 ^{1 H-13}C 교차 편광⁴² (CP) 실험을 최적화합니다. 일반적인 매개변수는 ^13C에서 45kHz rf 전력, 80-100kHz 헤테로핵 ^1H-디커플링⁴³ , 획득 중 1.8-2.0초 재활용 지연 및 64회 스캔입니다.
   1. 지방족 탄소에서 최대 신호 감도를 위해 CP 접촉 시간을 최적화합니다.
   2. ¹³C-CP 실험에서 시작 펄스에 4를 곱하여, 즉 360° 펄스를 최적화하여 ^1H90° 펄스 길이를 결정하고 신호가 사라질 때까지 길이를 변경합니다. CP 전송 직후에 직사각형 펄스를 포함하고 ^13C90° 펄스 길이를 유사하게 최적화합니다.
3. 30ms의 자화 전달 시간으로 PARIS와 같은 2D ^{13 C-13}C 양성자 구동 스핀 확산(PDSD) 유형 실험을 실행하여 잔류 내 상관 관계를 감지하고 시료 품질을 측정합니다. 이전에 최적화된 ¹³C-CP 실험에서 전력 수준, 접촉 시간 및 90° 펄스 길이를 전송합니다. 간접 차원에서 4-6ms의 수집 시간을 사용합니다. QSIN(Squared Sin Bell Function)으로 스펙트럼을 처리하거나, 민감하지 않은 샘플의 경우 두 차원 모두에서 지수 라인 확장으로 스펙트럼을 처리합니다.
4. 고립된 교차 피크의 슬라이스를 추출하고 절반 높이에서 선폭을 확인합니다. ~0.3-1.0 ¹³C ppm 사이의 선폭은 ssNMR 특성화에 이상적인 잘 정렬된 샘플을 나타내는 반면, 1.0 ¹³C ppm 이상의 선폭은 ssNMR 특성화를 손상시킬 수 있는 구조적 이질성을 나타냅니다. 그림 3A 에 나타난 BamA의 2D CC PARIS 스펙트럼은 고품질 스펙트럼을 제공하는 잘 정렬된 단백질의 예입니다.

5. ¹H-검출 3D ssNMR 분광법에 의한 백본 할당

1. 2D NH 분광 지문 획득
   1. 위에서 설명한 대로 1.3mm 로터에 샘플을 채웁니다. 로터를 자석에 삽입하고 샘플을 10-20kHz MAS로 회전시키고 ssNMR 프로브 헤드의 사양에 따라 샘플을 240-250K 설정 온도 이하로 냉각합니다. MAS 장치 인터페이스를 사용하여 5kHz에서 60kHz MAS 단위로 MAS 주파수를 점진적으로 증가시킵니다.
   2. ¹³C 및 ¹⁵N CP 실험에서 CP 진폭, 접촉 시간 및 90° 펄스 길이를 최적화합니다. 이종핵 채널에서 약 30-50 또는 70-100kHz의 진폭을 사용하고 ^1H채널의 진폭을 80-180kHz로 변경합니다. 0.7-1.2초의 재활용 지연과 15kHz 저전력 이종핵 양성자 디커플링⁴⁴를 사용합니다. 또한 CP ssNMR 실험을 설정하는 방법에 대한 자세한 내용은 참조⁴⁵를 참조하십시오.
   3. ^1H해상도를 측정하기 위해 2D NH 실험을 획득합니다. ¹⁵개의 N-CP 매개변수를 전송하고 직접 및 간접 차원에서 약 15 및 25ms의 수집 시간을 사용합니다. 처음 ¹H - ¹⁵N CP 전송의 경우 이전에 최적화된 접촉 시간을 사용합니다. ^15N에서 ^1H역전달의 경우 0.7-1.0ms 접촉 시간을 사용하여 잔류 자화 전달을 최소화합니다.
   4. 샘플 수분 함량에 따라 50-250ms 물 MISSISSIPPI 억제⁴⁶을 사용합니다. 두 차원 모두에서 QSIN(제곱 사인 벨 함수)으로 스펙트럼을 처리합니다. 고립된 교차 피크의 슬라이스를 추출하고 절반 높이에서 선폭을 확인합니다. 고품질 2D NH 스펙트럼²⁵ 의 예는 그림 3B에서 멤브레인 내장 BamA-P4P5에 대해 나와 있습니다.
2. 백본 할당
   1. 1D ¹⁵N to ¹³Cα 특정 CP 실험^{최적화 47}. ^13C캐리어를 약 55ppm의 Cα 영역 중간에 놓습니다. 20kHz의 ^13Crf 진폭을 사용하고 Cα 신호로의 최대 전달과 카르보닐 신호로의 최소 전달을 위해 ^15N진폭을 35kHz에서 45kHz로 변경합니다. 접촉 시간을 3ms에서 10ms까지 1ms 단위로 최적화합니다.
   2. 3D CαNH 실험을 실행합니다. 이전에 최적화된 단계에서 모든 CP 진폭, 접촉 시간 및 펄스 길이를 전송합니다. 간접 및 직접 획득 차원에서 약 10ms 및 30ms를 사용합니다. QSIN(제곱 죄종 함수)을 사용하여 3차원 모두에서 스펙트럼을 처리합니다.
   3. 1D Cα에서 CO DREAM으로의 자화 전달 최적화⁴⁸. ¹⁵N에서 ¹³Cα 특정 CP 전송으로 시작합니다. 그런 다음 ^13C채널의 스핀 잠금을 사용하여 Cα에서 CO로 자화를 전달합니다. 최적의 전송을 위해 rf 진폭을 20kHz에서 35kHz로 변경합니다. 전송 시간을 4ms에서 10ms로 최적화합니다.
   4. 3D Cα(CO)NH 실험을 실행합니다. 이전에 최적화된 단계에서 모든 rf 진폭, 접촉 시간 및 펄스 길이를 전송합니다. 간접 및 직접 획득 차원에서 약 10ms 및 30ms를 사용합니다. QSIN(제곱 죄종 함수)을 사용하여 3차원 모두에서 스펙트럼을 처리합니다.
   5. 유사한 3D CONH 및 CO(Cα)NH 실험에 대해 1-4단계를 반복하고 조정합니다. 그림 4²⁸의 KcsA 예에서 볼 수 있듯이 순차적 Cα 및 CO 워크에 대한 이 3D 실험 4중주를 사용하여 단백질 골격을 할당합니다.

6. ¹H-검출 ssNMR 분광법에 의한 단백질 역학

1. ¹⁵N T₁ 연구의 경우, 60 kHz MAS에서 이전에 최적화된 2D NH 실험을 사용하고 첫 ^{번째 1}H - ¹⁵N 교차 편광 단계 이후의 지연을 포함합니다. 일련의 2D NH 실험을 획득하고 예를 들어 0, 2, 4, 8, 16초의 단계를 사용하여 지연을 0에서 16초까지 변경합니다.
2. 해결된 신호에 대한 정규화된 농도를 증가하는 지연 시간의 함수로 플로팅합니다. T₁ 감쇠를 y = exp^(-x/T1)에 따라 단일 지수에 맞추고, y는 감쇠 시간 x에서의 신호 강도입니다.
3. 유사하게, ¹⁵N T_1rho 연구의 경우, 처음 ¹H 내지 ¹⁵N 교차 편광 단계^26,49 이후 15-20 kHz 사이의 rf 진폭을 갖는 ¹⁵N 채널의 펄스 프로그램에 스핀 잠금 펄스를 포함하십시오. 일련의 2D NH 실험을 획득하고 지연을 0에서 150ms까지 다양하게 조정하고 해결된 신호의 T_1rho 감쇠를 단일 지수에 맞춥니다. 그림 5, ^{27, 28}에 멤브레인 내장 K⁺ 채널에 대한 예시적인 ¹⁵N T_1rho 데이터가 나와 있습니다.

7. 동적 핵 분극

참고: 다음 준비 단계는 3.2mm 사파이어 MAS 로터를 사용하는 상용 DNP 설정의 사용과 관련이 있습니다(그림 6)²⁰. 지르코니아 로터 또는 기타 DNP 장비를 사용하면 DNP 신호 향상이 낮아질 수 있습니다.

1. 50μL의 중수소화 DNP 완충액(60%(v/v) 중수소화 d8- 및 글리세롤 및 15mM AMUPol⁵⁰)에 막 단백질 펠릿(단계 3.1)을 재현탁합니다. 800MHz에서 실험하는 경우 10mM NATriPOL-3⁵¹을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 DNP ssNMR 실험에 대한 추가 실용적인 측면에 대해서는 참고 문헌⁵² 를 참조하십시오.
2. 펠릿이 형성되도록 4 °C에서 100,000 x g 에서 10-20분 동안 원심분리기를 사용합니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.
3. 원심 어댑터와 3.2mm 사파이어 MAS 로터 구성 요소를 <4°C로 예냉각합니다. DNP 에이전트가 줄어들지 않도록 다음 단계(7.4-7.7)를 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
4. 3.2mm 사파이어 로터를 원심분리기 어댑터에 넣고 7.2단계의 프로테오 리포솜 현탁액으로 채웁니다.
5. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 재현유탁된 멤브레인 단백질 샘플을 로터의 내벽에 조심스럽게 피펫팅합니다. 용액이 로터 바닥으로 미끄러지도록 합니다. 기포가 형성되지 않았는지 확인하십시오.
6. 4°C에서 4,500 x g 에서 5-10분 동안 로터에서 샘플을 스핀다운합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 과도한 DNP 주스를 포함하는 상등액을 제거합니다. 로터가 가득 찰 때까지 6.4-6.6단계를 반복합니다.
7. 로터 상단에 있는 스페이서 나사를 사용하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 스페이서를 조심스럽게 배치합니다.
8. 로터 플런저(⁵³ )에 로터의 캡이 아래를 향하도록 놓고 로터를 액체 질소에 넣습니다. 로터와 s에 최소 30-60초를 허용합니다.amp르가 얼다.
9. 열교환기 장치를 시동하고 DNP 프로브를 ~90K로 냉각합니다.
10. MAS 장치를 수동 모드로 설정하고 가변 온도(VT)를 135l/h로 설정하고 베어링 및 구동 가스 흐름을 ~6l/h로 설정합니다.
11. MAS 콘솔에서 Eject 를 사용합니다.
12. 냉동 샘플을 액체 N7.8에서 s로 옮기십시오.ample catcher를 찾아 프로브에 놓습니다(참조⁵³ 참조).
13. "인서트"를 작동시키기 전에 프로브 베어링 압력(Bp)을 ~500mbar로 수동으로 높입니다. 이것은 로터의 안정적이고 안전한 회전을 위해 바람직합니다.
14. 참조⁵³에 설명된 절차를 사용하여 MAS rate를 원하는 값으로 높입니다.
15. 다차원 실험, 예를 들면, 이 기사의 단면도 3에서 기술된 2D CC 실험으로 진행하기 전에 표준 1D CP 실험 (예를들면, 참고^{문헌 51,54}) (그림 7) 사용하여 마이크로파의 유무에 관계없이 DNP 증진을 검사하십시오.

결과

그림 2는 개재체(inclusion body purity)(패널 A) 및 개재체(inclusion body)의 재접힘(refolding)(패널 B3)에 대한 대표적인 겔을 보여줍니다. 그림 2 는 ^{13 C,15}N 표지 BamA-P4P5의 성공적인 정제를 확인합니다.

그림 3A는 잘 정렬된 막 단백질의 전형적인 2D ^{13 C-13}C 스펙트럼을 보여주고, 그림 3B는 과류효소 막 단백질²⁵의 전형적인 고품질 2D ¹⁵N¹H 스펙트럼을 보여줍니다. 이 막 단백질은 봉입체(inclusion body)로 발현되어 막횡단...

토론

막 단백질은 원핵생물과 진핵생물 모두에서 중요한 세포 기능을 조절하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 따라서 원자 분해능 수준에서 이들의 작용 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 기존의 구조 생물학 기술은 막 단백질에 대한 과학적 이해를 상당히 발전시켰지만, 막이 없는 체외 시스템에서 수집한 실험 데이터에 크게 의존해 왔습니다. 이 기사에서는 최첨단 고체 상태 NMR 기술, 즉 fast-MAS 및 DNP를 활용하여 네이티브와 같은 멤브레인에 내장된 두 개의 박테리아 막 단백질의 구조와 기능에 대한 원자적 통찰력을 얻을 수 있는 실험적 접근 방식을 제시합니다. 이 방법은 다른 박테리아 막 단백질에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 높은 수율 및 순도로 표지된 삼중 동위원소 BamA를 생산 및 정제하는 강력한 방법론을 설명하는 것으로 시작하며 (그림 2A<...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암모늄 몰리브 데이트	머크	277908
암모늄 -15N 염화물	Cortecnet	CN80P50
암피실린	시그마 Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonase	EMD Millipore Corp	70746-3
붕산	Merck	B6768
브로 모페놀 블루	시그마	B0126
칼슘 디클로라이드	머크	499609
콜린 클로	시그마	C-1879
코발트 클로라이드	머크	449776
구리 황산염	머크	C1297
D-비오틴	머크	8512090025
중수소 산화물	Cortecnet	CD5251P1000
디메틸 설폭사이드	Merck	D9170
에틸렌디아민 테트라아세트산	시그마 알드리치	L6876
엽산	시그마	F-7876
포도당 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
글리세롤	Honeywell	G7757
글리세롤 (12C3, 99.95% D8, 98%)	유리동위원	CDLM-8660-PK
글리세롤(비농축)	Honeywell	G7757-1L
글리신	시그마 알드리치	50046
구아니딘 염산염	Roth Carl	NR.0037.1
황산철	Merck	307718
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Thermofisher	R0392
lysogeny broth	Merck	L3022
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876
염화마그네슘 - 헥사하이드레이트	Fluka	63064
마그네슘 황산염	Merck	M5921
인산일칼륨	Merck	1051080050
Myoinositol	Sigma	I-5125
n-Dodecyl-B-D-maltoside	Acros 유기물	3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxide	Merck	40236
Nicatinamide	Sigma	N-3376
Panthotenic acid	Sigma	21210-25G-F
프로테아제 억제제	Sigma	P8849
피리독살-HCl	시그마 알드리치	P9130
리보플라빈	알드리치	R170-6
염화나트륨	머크	K51107104914
인산나트륨 - 일수화물	시그마 알드리치	1,06,34,61,000
데실황산나트륨	Thermo-scientific	28365
수산화나트륨	머크	1,06,49,81,000
설탕	시그마 생명 과학	S9378
티아민 -HCl	머크	5871
트리스 -HCl	시그마 알드리치	10,70,89,76,001
염화 아연	머크	208086
대장균 BL21 DE3 *	뉴 잉글랜드 Biolabs	C2527
1.5 mL 울트라 튜브	Beckman Coulter	357448
30 kDa 원심 필터	Amicon	UFC903024
3.2 mm 사파이어 DNP 로터, 캡 포함	Cortecnet	H13861
3.2 mm 테플론 인서트	Cortecnet	B6628
3.2 mm 샘플 포장기/언패커	Cortecnet	B6988
3.2 mm Regular Wall MAS 로터	Cortecnet	HZ16913
3.2mm 레귤러 월 MAS 로터	Cortecnet	HZ09244
3.2mm 얇은 벽 로터용 도구	키트 Cortecnet	B136904
1.3mm MAS 로터 + 캡	Cortecnet	HZ14752
1.3mm 충전 도구	Cortecnet	HZ14714
1.3mm 샘플 패커	Cortecnet	HZ14716
1.3mm 캡 제거제	Cortecnet	HZ14706
1.3mm 캡 세트 도구	Cortecnet	HZ14744
투석 튜빙 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - Black	Merck	HS15094