여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 혈액 무승부에서 환자 특정 심근세포생성은 심혈관 질환에 대한 정밀 의학에 엄청난 관심을 끌고 있습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 심장 분화는 배아 심장 발달에 필수적인 정의된 신호 경로에 의해 변조됩니다. 2D 및 3D 플랫폼에 대한 수많은 심장 분화 방법은 다양한 효율성과 심근세포 수율로 개발되었습니다. 이러한 방법의 다양성은 따라하기 어려울 수 있기 때문에 이것은 필드 외부 의아해 수사관이있다. 여기서 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 환자 특정 심근 세포의 견고한 생성 및 확장을 정교하게 하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 먼저 비통합 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 고효율 iPSC 재프로그래밍 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 대부분의 인간 iPSC 라인에서 박동하는 심근세포를 강력하게 생성할 수 있는 작은 분자 매개 단층 분화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 확장 가능한 심근세포 팽창 프로토콜은 산업 및 임상 등급 응용을 위해 환자 유래 심근세포를 빠르게 확장할 수 있는 작은 분자(CHIR99021)를 사용하여 도입된다. 결국, 이러한 iPSC-CM의 분자 식별 및 전기 생리학적 특성화를 위한 상세한 프로토콜이 묘사된다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 발달과 줄기 세포 생물학에 대한 제한된 지식을 가진 초보자를 위한 실용적일 것으로 기대합니다.
서론
인간 유도 만능 줄기 세포의 발견은 현대 심장 혈관 의학1,2에혁명을 일으켰습니다. 인간 iPSCs는 심근세포, 내피 세포, 매끄러운 근육 세포 및 심장 섬유아세포를 포함하여 심장에 있는 모든 세포 모형을 자기 갱신하고 생성할 수 있습니다. 환자 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)는 유전적으로 상속가능한 심혈관 질환(CVDs)을 모델링하고 신약에 대한 심장 안전성 검사를 위한 무기한 자원역할을 할 수있다. 특히, 환자 iPSC-CM은 긴 QT 증후군4 및 확장된 심근병증(DCM)5와같은 심근세포의 결함에서 파생된 CVD의 유전적 및 분자 병각을 잘 조사할 태세입니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집과 결합된 환자 iPSC-CM은 선천성 심장 결함(CHDs)6,7,8을포함한 CVD의 복잡한 유전적 기초를 이해하는 전례 없는 길을 열었습니다. 인간 iPSC-CM은 또한 심장 마비 도중 손상된....
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프로토콜
인간 과목에 대한 실험 프로토콜 및 정보에 입각한 동의는 전국 아동 병원의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.
1. 세포 배양 매체, 솔루션 및 시약 의 준비
- PBMC 미디어 준비
- 기초 PBMC 문화 매체 (1 x)와 0.52 mL의 기초 PBMC 문화 매체의 20 mL을 혼합하십시오. 각각 20μL의 SCF및 FLT3(스톡 농도: 100 μg/mL), IL3, IL6 및 EPO4 μL(재고 농도: 100 μg/mL) 및 L-글루타민 대안(100x)의 200 μL을 추가합니다. 그들을 철저히 섞는다. 0.22 μm 필터 장치를 사용하여 멸균 후드를 필터링합니다. 이 이름을 완전한 혈액 미디어로 지정합니다.
- 기초 PBMC 문화 매체(1x)와 0.52mL의 기초 PBMC 배양 매체(1x)와 0.52mL의 보충제를 혼합합니다. L-글루타민 대체(100x)의 200 μL을 추가합니다. 그들을 철저히 섞는다. 0.22 μm 필터 장치를 사용하여 필터링합니다. 이 이름을 혈액 보조 자료로 지정합니다.
- 완전한 E8 미디어 준비
- E8 기저형 미디어 500mL와 10mL의 E8 보충제(4°C에서 하룻밤 동안 해동)를 혼합하여 완전한 E8....
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결과
PBMC에서 인간 iPSC 리프로그래밍
7일 동안 완전한 혈액 매체를 통해 사전 배양 후, PBMC는 눈에 보이는 핵과 세포질(도1B)으로커져 바이러스 이식에 대한 준비가 되었음을 나타냅니다. 센다이 바이러스 재프로그래밍 인자와 의전 후, PBMC는 또 다른 주 동안 후생 유전학 재프로그래밍 과정을 받게됩니다. 전형적으로, 우리는 1 x 105 PBMC의 트랜스퍼션에서 30-50 iPSC 식민지를 얻고 재프로그래밍 효율은 0.03%-0.05%입니다. 완전히 다시 프로그래밍된 세포는 완전한 E8미디어(그림 1C)에도입될 때 콜로니 형성을 부착하고 시작합니다. 이 초기 iPSC 식민지는 또 다른 7 일 동안 확장 된 다음 기계적으로 잘라 개별적으로 포착됩니다. 각 iPSC 식민지는 개별 iPSC 라인을 확립하기 위.......
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토론
iPSC 재프로그래밍 하는 동안, 그들은 명확한 핵과 세포질로 확대 될 때까지 1 주일 동안 PBMC를 배양하는 것이 중요합니다. PBMC가 증식하지 않기 때문에 바이러스 성 트랜스듀션에 적합한 세포 수는 성공적인 iPSC 재프로그래밍에 중요합니다. PBMC의 세포 수, 감염의 복합성 (MOI) 및 바이러스의 titer는 최적의 트랜스유도 결과에 도달하기 위하여 고려되고 조정되어야 합니다. 심장 분화의 경우 초기 시드 밀도는 CHIR99021이 투여되는 날에 iPSC가 90% 이상 수렴하는 데 매우 중요합니다. 한편으로는, iPSC가 심장 분화시에 덜 수렴되는 경우에, CHIR99021는 유독하고 실질적인 세포 죽음으로 이끌어 낼 것입니다. 한편, iPSC가 컨서우리(confluent)인 경우, 즉방향 심장 분화의 효율성을 저해하는 자발적인 분화를 받게 됩니다. 초기 iPSC-CM의 확장을 위해 타이밍과 심근세포 품질을 고려해야 합니다. 초기 iPSC-CM은 심근세포의 순도가 충분히 높을 때만 견고하게 증식할 수 있습니다. 배양.......
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공개 사항
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 심장 협회 (AHA) 경력 개발 상 18CDA34110293 (M-T.Z.), 추가 벤처 AVIF 및 SVRF 상 (M-T.Z.), 국립 보건원 (NIH /NHLBI) 보조금 1R01HL1HL13225 (1R01HL132520)에 의해 지원되었다. 밍타오 자오 박사는 전국 아동 병원의 아비가일 벡스너 연구소의 스타트업 기금으로도 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 고속 실시간 PCR 시스템 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B 미세전극 증폭기 | 분자 장치 | 미세전극 증폭기 | |
| B27 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 보충제 인슐린 마이 | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 키트 | BD Biosciences | 554714 | 고정/투과화 용액, 파마/세척 버퍼 |
| BD Vacutainer CPT 튜브 | BD Biosciences | 362753 | |
| CHIR99021Selleck | Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai 바이러스 재프로그래밍 키트 |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA 추출 키트 |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 E8 배지 iPSC 배양 | |
| GlutaMAX 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-글루타민 대체 |
| 성장 인자 감소 Matrigel | Corning | 356231 | 기저막 매트릭스 |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | 분자 소자 | 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 | |
| 재조합 인간 EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| 재조합 인간 FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| 재조합 인간 IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| 재조합 인간 IL6 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 재조합 인간 SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 매체, 포도당 없음 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | 장착 매체 |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC 배양 배지 |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR 마스터 믹스 |
| TrypLE Select Enzyme 10x, 페놀 레드 없음 | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM 해리 용액 |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC 해리 용액 |
| Y-27632 2HCl | Selleck 화학 물질 | S1049 |
참고문헌
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
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