이 프로토콜은 돼지 유도 만능 줄기세포(piPSC)에서 유래한 신경전구세포의 화학적 분화 및 배양 방법을 설명합니다.
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이 프로토콜은 돼지 유도 만능 줄기세포(piPSC)에서 유래한 신경전구세포의 화학적 분화 및 배양 방법을 설명합니다.
iPSC 유래 뉴런은 주로 설치류와 같이 전임상 연구에 사용되는 대부분의 동물 모델이 연구 결과를 임상에 적용할 수 있는 기준을 충족할 수 없는 경우 정신 질환의 신경 발생 및 초기 표현형 변화를 연구하는 데 매력적인 체외 모델입니다. 인간이 아닌 영장류, 송곳니 및 돼지는 주로 인간과의 생리학적, 유전적, 해부학적 유사성으로 인해 생물 의학 연구 및 약물 개발 목적에 더 적합한 모델로 간주됩니다. 돼지 모델은 중개 신경 과학에서 특별한 관심을 불러일으켜 안전성 및 동종 이식 테스트를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 돼지 iPSC의 생성과 함께 신경전구세포(NPC)로의 추가 분화에 대해 설명합니다. 생성된 세포는 RT-qPCR로 확인된 NPC 마커 Nestin 및 GFAP를 발현했으며 면역형광에 의해 Nestin, b-Tubulin III 및 Vimentin에 대해 양성이었습니다. 이러한 결과는 재생 및 중개 의학 연구를 위한 흥미롭고 적절한 모델인 대형 동물 모델의 화학 억제제로 체외 유도 후 NPC 유사 세포가 생성된다는 증거를 보여줍니다.
많은 연구자들이 인간에 대한 신경 질환의 세포 메커니즘 및 병리학적 발달을 더 잘 이해하는 것을 목표로 하고 있지만, 자기공명영상(MRI)과 같은 비침습적 기술을 인간에게 사용하는 데에는 많은 제한이 있으며, 대부분의 경우 요로 추적 및 세포 내 기록과 같은 침습적 기술을 적용하는 것이 불가능합니다1. 또한 기증자의 장기간의 고통 상태가 뇌에 영향을 미치고 연구를 방해할 수 있기 때문에 좋은 품질의 사후 뇌 조직을 얻는 것도 어렵다2. 따라서 수십 년 동안 중개 연구에서 사용되어 온 동물 모델은 오늘날까지 관련성이 있고 의심스러울 필요가 있습니다. 특정 동물 모델의 선택은 최근 실험 설계 및 계획에서 핵심 질문이 되고 있으며, 일관된 결과를 얻기 위해서는 가장 적절한 모델을 선택하는 데 다양한 종의 생리학뿐만 아니라 중요하게는 연구의 특정 목표에 대한 깊은 지식이 필요하다는 것이 분명해지고 있습니다3.
그러나 동물 모델은 인간의 뇌 구조와 발달을 항복 할 때 종종 한계를 제시하는데, 이는 인간의 뇌가 독특한 발달, 해부학적, 분자적, 유전적 특징을 가지고 ....
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이 실험은 상파울루 대학교 동물 과학 및 식품 공학 학부의 동물 실험 윤리 위원회(허가 번호: n° 5130110517 및 n°4134290716)의 승인을 받았습니다.
참고: 세포 배양 및 배양과 관련된 모든 절차는 통제된 대기(공기 중 38.5°C 및 20% CO2 , 최대 습도)에서 수행됩니다. 세포 계대는 해리 시약으로 5분 배양으로 수행하고, 원심분리(300 x g) 후 세포를 회수하였다.
1. 돼지 섬유아세포를 iPSC로 재프로그래밍(reprogramming)
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piPSC의 특성화
특성화는 재프로그래밍된 세포의 다능성 획득을 결정하는 것을 목표로 했습니다. 이를 위해 배아 형성, 다능성 마커를 위한 면역형광 염색, 유전자 발현 및 배아체(EB)로의 자발적 분화를 수행했습니다.
생성된 세포 군집은 piPSC16, 17 에서 예상할 수 있듯이 잘 정의된 경계를 가진 세포 클러스터에서 평평하고 조밀한 형태를 나타내며 섬유아세포 형태와는 매우 다릅니다. 이들은 알칼리성 인산가수분해효소 양성(그림 3)이었고 OCT4, SOX2에 대해 양성이었으며 SSEA1 및 TRA 1-60 염색에 대해 부분적으로 양성이었습니다(그림 4). 이 세포는 EB를 형성할 수 있었고 내인성 다능성 유전자 OCT4
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이 프로토콜을 통해 섬유아세포는 OCT4, SOX2, c-MYC 및 KLF4의 외인성 발현을 사용하여 체외 에서 재프로그래밍되었습니다. 재프로그래밍된 세포는 20회 이상의 계대 동안 시험관 내에서 유지되었습니다. 이러한 계통을 화학적 억제제를 사용하여 신경 분화에 투여했을 때, RT-qPCR로 확인된 신경 전구 세포의 마커 Nestin 및 GFAP을 발현했으며 면역형광에 의해 Nestin, β-Tubulin III 및 Vimentin에 대해 양성이었습니다. 흥미롭게도, NPC와 같은 세포로 분화하는 데 사용되는 재프로그래밍된 돼지 섬유아세포의 배아 특성으로 인해 Nesten의 존재와 발현은 재프로그래밍 및 분화의 모든 단계에서 다른 수준에서 감지되었습니다. 실제로, Nespin의 시공간 발현은 인간과 돼지의 신생아 및 태아 섬유아세포에서 보고되었습니다.
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저자는 공개할 내용이 없습니다.
Kristine Freude 교수는 프로토콜 및 과학적 토론에 도움을 준 공로를 인정받았습니다. 이 작업은 상파울루 연구 재단 (FAPESP) (# 2015 / 26818-5, # 2017 / 13973-8 및 # 2017 / 02159-8), 국립 과학 기술 개발위원회 (CNPq # 433133 / 2018-0) 및 고등 교육 인력 개선을위한 조정 (CAPES) (자금 조달 코드 001).
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 293FT | Invitrogen | # R70007 | |
| 6 웰 플레이트 | Costar | # 3516 | |
| anti-B-Tubulin III | abcam | # ab7751 | |
| anti-NANOG | abcam | # ab77095 | |
| anti-NESTIN | Millipore | # ABD69 | |
| anti-OCT4 | Santa Cruz 생명공학 | # SC8628 | |
| anti-SOX2 | abcam | # ab97959 | |
| anti-SSEA1 | Millipore | # MAB4301 | |
| anti-TRA1-60 | Millipore | # MAB4360 | |
| anti-VIMENTIN | abcam | # ab8069 | |
| B27-Minus Vitamin A | Life Technologies | # 12587010 | |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | # 11960 | |
| 당나귀 안티 염소 488 | Invitrogen | # A11055 | |
| EGF | Sigma | # E9644 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | # 10099 | |
| FGF2 | Peprotech | # 100-18B | |
| GlutaMAX | Gibco | # 35050-061 | |
| Glutamine | Gibco | # 25030-081 | |
| 염소 안티-마우스 594 | Invitrogen | # A21044 | |
| 염소 안티-토끼 488 | Invitrogen | # A11008 | |
| 헥사디메트린 브로마이드 | 시그마 알드리 | 치# 107689 | |
| HighCapacity kit | Life Technologies | # 4368814 | |
| IMDM | Gibco | # 12200-036 | |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | # 12660-012 | |
| Knockout 세럼 교체용 | Gibco | # 10828-028 | |
| LDN-193189 | Sigma-Aldrich | # SML0559 | |
| Leukocyte 알칼리 인산가수분해효소 키트 | Sigma Aldrich | # 86R | |
| Lipofectamine P3000™ | Invitrogen | # L3000-015 | |
| Matrigel | Corning | # 354277 | |
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | # M4287-2MG | |
| N2 | Life Technologies | # 17502048 | |
| Nanodrop ND-1000 | Nanodrop Technologies, Inc. | ||
| Neurobasal medium | Life Technologies | # 21103049 | |
| 비필수 아미노산 | Gibco | # 11140-050 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | # 15140-122 | |
| Revita Cell | Gibco | # A2644501 | |
| Rnase | out Life Technologies | # 10777019 SB431542 | |
| Stemgent | # 72232 | ||
| StemPro Accutase | Gibco | # A11105-01 | |
| SW28 로터 | Beckman Coulter | # 342207 | |
| Trizol | Life Technologies | # 15596026 | |
| TrypLE Express | Gibco | # 12604-021 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | # 21985-023 |
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