여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.
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방법 논문
이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
교모세포종 (GBM), 학년 IV 악성 교모종, 때문에 그들의 공격적인 특성의 인간 암의 치명적인 유형 중 하나입니다. 이 종양의 유전학에 있는 중요한 어드밴스에 있는 중요한 어드밴스에 도 불구하고, GBM 세포가 건강한 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법 잘 이해되지 않습니다. 특히, GBM 세포가 다른 경로를 통해 회고적 공간을 침범하는 것으로 나타났습니다. 이 논문의 주요 관심사는 백색 물질 지역(WMT)을 따라 가는 경로입니다. 회고신경세포 성분을 가진 종양 세포의 상호 작용은 잘 특징지 않다. 본명, GBM 세포 침략에 대한 뉴런의 영향을 평가하는 방법이 기재되어 있다. 이 논문은 뉴런에 GBM 줄기 와 같은 세포의 이동을 분석하여 WMT 침공을 모방 하는 체외 분석에서 고급 공동 배양 제시. 뉴런이 있는 GBM 셀의 동작은 오픈 소스 및 자유 액세스 소프트웨어와 함께 자동화된 추적 절차를 사용하여 모니터링됩니다. 이 방법은 많은 응용 프로그램에 유용하다, 특히, 기능 및 기계학 연구뿐만 아니라 뉴런에 GBM 세포 이동을 차단 할 수있는 약리학 에이전트의 효과를 분석하기위한.
서론
GBM을 포함하여 1 차적인 악성 gliomas는, GBM 환자를 위해 보고된 12 15 달의 중간 생존율로, 치명적인 종양입니다. 현재 치료는 방사선 요법과 결합된 큰 종양 질량 절제술 및 화학요법에 의존합니다, 이는 단지 몇 달까지 생존율을 연장합니다. 치료 실패는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 가난한 약물 전달과 밀접한 관련이 있으며, 경피 공간, 수막 및 WMTs1을따라 침습적인 성장과 관련이 있다. 혈관 공동 선택이라고도 불리는 혈관 침전은 잘 연구된 과정이며 분자 메커니즘이 해명되기 시작했습니다. 그러나, WM을 따라 GBM 세포 침공의 과정은 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포는 Scherer의 이차 구조물2를따라 건강한 뇌로 이동합니다. 실제로, 거의 1세기 전, 한스-요아킴 셰러는 GBM의 침략적인 경로를 설명했는데, 이는 현재 복막 사텔리토시스, 각성 사텔리토증, 피증 확산 및 WMT(그림1A)를따라 침략하는 것으로 불린다.
기질 세포 유래 인자-1α(SDF1α) 및 C-X-C 모티프 케모키네 수용체 4(CXCR4)와 같은 일부 체모키네 및 그 수용체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 아닌 WMT 침입
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프로토콜
통보 된 서면 동의는 모든 환자로부터 얻어졌다 (지역 윤리위원회 규정에 따라, 노르웨이 베르겐, 하우켈랜드 병원에서). 이 프로토콜은 보르도 대학 인간 및 동물 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 임신 한 쥐는 보르도 대학의 동물 시설에서 보관및 치료되었다. E18 시간 임신 쥐의 안락사는 CO2를사용하여 수행되었다. 모든 동물 절차는 제도적 지침에 따라 수행되었으며 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 상용 제품은 재료 표에서참조됩니다.
1. 패턴 슬라이드의 준비
- 마이크로패터닝을 위한 기판 준비
- 공기/플라즈마 활성화로 18mm 원형 유리 커버립을 5분 동안 처리합니다. 커버립을 1시간 동안 건조기(3-aminopropyl) 트리에톡시실레인100 μL로 닫힌 챔버에 놓습니다.
- 100 mg/mL의 폴리(에틸렌 글리콜)-succinimidyl valerate(분자량 5,000(Peg-SVA)를 10mM 의 탄산완충제, pH > 8, 1h로 배양한다. 초순수물로 광범위하게 헹구고 화학 후드 아래에서 건조시다.
참고: 이 단계에서 는 샘플을 어두운 상태에서 4°C로 저장하여 추가 사용을 위해 할 수 있습니다. - 포산염 ....
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결과
형광 GBM 세포와 공동 배양패턴 뉴런은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고, 추적 실험이 수행되었다. GBM 세포는 뉴런에서 마이그레이션하는 동안 신속하게 모양을 수정(그림 1B: 패널 6 및 비디오 1). 세포는 무작위 운동(비디오 1)에서신경 확장을 따라 마이그레이션되었습니다. 형광GBM 세포 및 비형성 뉴런은 쉽게 구별될 수 있으며, 이는 프로토콜섹션(그림 2)에기재된 바와 같이 피지 매크로를 사용하여 세포 이동의 추적을 허용했다. 피지는 이미지 처리 및 분석을 용이하게 하는 개방형 라이센스 소프트웨어입니다. 수많은 이미지 의 분석에 상대적으로 시간이 많이 걸리는 수동 프로시저는 매크로에서 자동화할 수 있습니다. 이미지는 끌어오기 및 드롭 프로시저, 처리 및 정량화되어 ROI 관리자를 사용하여 사용할 수 있는 데이터를 생성.......
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토론
교모세포종은 주변 혈관의 공동 옵션, 간질 침입 또는 WMTs18에대한 침략 : 다양한 모드를 사용하여 parenchyma를 광범위하게 침공한다. 이 후자의 모드는 WMT 침공과 관련된 생체 외 또는 생체 내 모델에 적합한 것을 찾는 데 어려움이 있기 때문에 문학에서 잘 특징지 지않습니다. 여기서, 배양된 설치류 뉴런이 라미닌 코팅 표면에 패턴화되고 형광 GBM 줄기와 같은 세포가 뉴런 위에 시드되는 단순화된 모델이 제안되었다. 이 연구에서는 종양 세포 부착, 침략 및 증식의 분석을 개선하기 위해 그리드 형상 패턴이 사용되었습니다. GBM 세포는 이러한 실험에서 라미닌이었던 매트릭스에서 직접보다 뉴런 의 상단에 더 효율적으로 마이그레이션. 셀 형상은 기록 과정 전반에 걸쳐 변경되고 셀 표면적이 동시에 증가했습니다. GBM 줄기 같이 세포는 특정 신호 통로 (즉, NOTCH2/SOX2)4 또는 분비된 요인 및 뉴런.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 Fondation ARC 2020, 리그 콘트르 르 암 (코미트 드 라 지롱드), ARTC, 계획 암 2021, INCA PLBIO에 의해 지원되었다. 알베올은 에이전시 내셔널 드 라 레체쉬 (그랜트 라벡스 브레인 ANR-10-LABX-43)에 의해 지원됩니다. 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원(추 툴루즈)의 펠로우십 수혜자입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | 시그마 | 440140-100ML | 아미노기는 mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | 20°C에 저장; C (장기) 또는 4 ° C (단기), 구 해리 효소 |
| B27 | Gibco | 12587 | -20 °에 저장; C, 사용 전 해동 |
| 기본 섬유아세포 성장 인자 | Peprotech | 100-18B | -20 °에 저장; C, 사용 전 해동 |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | 세포 계수에 사용 |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | 세포 배양 기질 |
| Dessicator 카트리지 | Sigma | Z363456-6EA | (3-aminopropyl) 트리에톡시실란 처리 중 mosture를 줄이는 데 사용 |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | 4에 보관 &데그; C |
| Fiji 소프트웨어, MTrack2 매크로 | ImageJ | 사진을 분석하는 데 사용됨 | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| 헤파린 나트륨 | Sigma | H3149-100KU | 4°C에 보관; C |
| Laminin | 114956-81-9 | 뉴런 접착 촉진 | |
| Leonardo 소프트웨어 | 구상 된 마이크로 패턴의 로딩 | ||
| MetaMorph 소프트웨어 | Molecular Devices LLC | NA | 현미경 자동화 소프트웨어 |
| 메틸셀룰로오스 | 시그마 | M0512 | 2% 최종 농도를 위해 NBM에 희석 |
| Neurobasal 배지 | Gibco | 21103-049 | 4°C에 보관; C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | 전동 스테이지가 장착된 도립 현미경 | ||
| 페니실린 - 스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | 에 보관; C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | PEG 브러시 분해에 사용되는 광개시 |
| 폴리(에틸렌 글리콜)-숙시니미딜 발레레이트(mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | 방오 코팅으로 사용 |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | DMD(Digital micromirror device) 기반 UV 프로젝션 장치 |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | 세포 계수에 사용 |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | 부착 세포 분리에 사용 |
참고문헌
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63
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재인쇄 및 허가
