우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.
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방법 논문
체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
불변성 천연 킬러 T(iNKT) 세포는 비다형성 MHC 급 I 관련 분자 CD1d.전임상 및 임상 연구에서 암, 자가면역 및 감염성 질환에서 iNKT 세포에 대한 역할을 지원하는 자체 또는 미생물 지질 항원에 특이적인 반불변성 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체이다. iNKT 세포는 종 전체에 걸쳐 매우 보존되고 그들의 조사는 CD1d 결핍 또는 iNKT 결핍 마우스를 포함하여 마우스 모델에 의해 촉진되고, 반 불변 TCR에 특이적인 CD1d 테트라머 또는 mAbs를 가진 마우스와 남자에서 명백하게 검출할 가능성. 그러나 iNKT 세포는 드물며 모든 연구를 위해 관리 가능한 숫자에 도달하기 위해 확장되어야 합니다. 시험관 내의 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성이 어렵다는 것이 입증되어 왔으니, iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)로부터 비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하기 위한 견고한 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 30배 더 빈번하다. 우리는 여기에서 1 차적인 비장 iVα14Tg iNKT 세포가 면역자기 분리 과정을 통해 풍부해질 수 있다는 것을, 대략 95-98% 순수한 iNKT 세포를 산출한다는 것을 여기에서 보여줍니다. 정제된 iNKT 세포는 안티 CD3/CD28 구슬플러스 IL-2 및 IL-7에 의해 자극되며, 85-99%의 순도로 배양의 날 +14까지 30배 확장됩니다. 확장된 iNKT 세포는 쉽게 유전적으로 조작될 수 있으며, 생체 외에서 활성화 및 기능 메커니즘을 해부하고, 더 중요한 것은 생체 내에서의 입양 전달시에도 귀중한 도구를 제공합니다.
서론
불변성 천연 킬러 T 세포(iNKT 세포)는 반불변성 αβ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체로, 비정체 Vα14-Jα18 사슬에 의해 마우스에서 형성된 다양한 Vβ 사슬1의한정된 세트와 결합되어 MHC 급 I-관련 분자CD1 CD에의해 제시된 지질 항원특이이다. iNKT 세포는 여러 성숙 단계3,4를통해 발생하는 흉선에서 이미 활성화 / 타고난 이펙터 표현형을 획득하는 결과 고뇌선별 프로그램을 거치며 CD4+ 및 CD4- 하위 세트를 생성합니다. 이 프로그램을 통해 iNKT 세포는 T-bet, GATA3, PLZF 및 RORγt의 발현에 의해 식별 가능한T-H(iNKT1),TH2(iNKT2) 및 TH17(iNKT17)과 같은 T 조머(TH)이펙터 표현형을 획득한다. iNKT 세포는 다양한 미생물 지질을 인식하지만 암 및 자가 면역2와같은 세포 스트레스 및 조직 손상의 병리학적 상황의....
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프로토콜
여기에 설명 된 절차는 검토 및 샌 라파엘과학 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (No. 1048)에 의해 승인되었다.
참고: 모든 절차는 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 사용되는 모든 시약은 재료 표에나열됩니다.
1. 비장 가공
- 기관 정책에 따라 CO2의 흡입에 의한 iVα14-Jα18 마우스의 안락사.
참고: iVα14-Jα18 마우스는 8주 이상이어야 한다. 세포의 생체 내 전달에서 세포의 거부를 피하기 위해, 여성 마우스로부터 분리 된 세포가 남성 및 여성 수신자 모두에서 입양적으로 전달 될 수 있음을 고려, 남성 마우스에서 분리 된 세포는 남성 받는 사람에서만 전송 될 수 있습니다. 시험관 내 실험의 경우 성 편견을 고려해야 합니다. 더 많은 마우스를 더 많은 세포를 얻기 위하여 풀로 만들 수 있습니다. - 마우스 비장을 해부하고 70 nm 세포 스트레이너를 통해 분쇄하여 2%의 태아 소 혈청(FBS)을 가진 10mL의 인산완충식염수(PBS)에서 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
- 300 x g의 원심분리기는 5분 동안.
- 반전으로 상체를 제거하고 ....
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결과
본 원고에 기재된 프로토콜은 도 1A에요약된 면역자기 분리 과정을 통해 iVa14-Ja18 형질성 마우스의 비장으로부터 iNKT 세포를 풍부하게 할 수 있다. 총 비장 T 세포는 먼저 B 세포와 단세포를 고갈하여 부정적으로 선택되고, PBS-57 지질 항원로드 CD1d 테트라머를 사용하여 iNKT 세포 양성 면역자기 분류를 통해 iNKT 세포만 구체적으로 염색할 수 있게 된다. 이 프로토콜은 단일 iVa14-Ja18 Tg 마우스의 비장으로부터 95-98% 순수 iNKT 세포의 약 2 x 106을 산출합니다. 아니 또는 정말 소수의 iNKT 세포는 음수 분수(도 1B)에서검출 될 수있다.
농축 후, iVa14 iNKT 세포는 항 CD3/CD28 구슬플러스 IL-2 및 IL-7(도2A)으로확장될 수 있으며.......
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토론
여기에서 우리는 수백만 개의 즉시 사용할 수 있는 iNKT 셀을 얻기 위해 재현 가능하고 실행 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 생체 내에서 이러한 세포의 빈약성으로 인해 이를 확장하는 방법이 매우 필요했습니다. 우리가 제안하는 프로토콜은 특정 계측이나 많은 수의 마우스를 필요로하지 않습니다. 당사는 절차에 필요한 마우스의 수를 줄이기 위해 iVα14-Jα18 형질전환 마우스를 의도적으로 이용했습니다.
iVα14-Jα18 형질전환 마우스로부터 iNKT 세포 확장을 위한 또 다른 성공적인 프로토콜은문헌(10)에서사용할 수 있다. 이 프로토콜은 iNKT 세포 정화 6일 전에 신선한 골수 유래 수지상 세포의 생성을 포함하고, 그 후에 α 갈라토실세라미드와 조사, 플러스 IL-2 및 IL-7로 로드됩니다. 우리는 시술에 관여하는 마우스의 수의 감소를 프로토콜의 큰 이점으로 간주합니다. 세포 배양의 설정이 일주일 대신 하루 지속되기 때문에 그것은 또.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 파올로 델라보나와 줄리아 카소라티에게 과학적 지원과 원고의 비판적 독서에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 CD1d 테트라머에 대한 NIH 테트라머 코어 시설에 감사드립니다. 이 연구는 폰다지오네 카리플로 그랜트 2018-0366 (M.F.) 및 이탈리아 암 연구 협회 (AIRC) 펠로우십 2019-22604 (G.D.에)에 의해 투자되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 가정용 | 암모늄-염화-칼륨(ACK) 용액 | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| 안티 FITC 마이크로비즈 | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| 안티 PE 마이크로비즈 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | 클론 6D5 |
| CD1d-테트라머 -PE | NIH 테트라머 코어 시설 | 마우스 PBS57-Cd1d-테트라머 | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | 클론 RM4-5 |
| Fc 차단제 | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | 사용 전 .22 열 비활성화 및 여과 |
| eBioscience | 00-5523-00 | ||
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | 클론 AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS 완충액(MB) | 사내 | 0.5% 소 혈청 알부민(BSA; Sigma-Aldrich) 및 2Mm EDTA | |
| MS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 비필수 아미노산 | Gibco | 11140-035 | |
| 페니실린 및 스트렙토마이신(Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate 완충 식염수(PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| 사전 분리 필터(30 &마이크로; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| 리콤비나트 마우스 IL-7 | R& D 시스템 | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | 클론 H57-597 |
| α CD3CD28 마우스 T 활성제 Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-메르캅토에탄올 | Gibco | 31350010 |
참고문헌
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. <....
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재인쇄 및 허가
