방법 논문

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

DOI:

10.3791/62226

⸱

2021년 2월 25일

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.

초록

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지질 기반 의약품 운반대는 작은 크기, 생체 적합성 및 높은 캡슐화 효율로 인해 임상 및 시판 가능한 전달 시스템에 사용되어 왔습니다. 지질 나노 입자 (LP)를 사용하여 핵산을 캡슐화하는 것은 RNA 또는 DNA를 저하로부터 보호하는 동시에 세포 섭취를 촉진하는 데 유리하다. LP는 종종 이온화 지질, 도우미 지질, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공액 지질을 포함한 여러 지질 성분을 포함한다. LP는 이온화성 지질 존재로 인해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있으며, 이는 낮은 pH에서 양이온이며 음전하 RNA 또는 DNA로 복합화를 허용합니다. 여기서 LPPs는 수성 상에서 지질 성분의 신속한 혼합을 사용하여 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 캡슐화함으로써 형성된다. 이 혼합은 정밀한 미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 수행되므로 라미나르 흐름을 유지하면서 나노 입자 자체 조립을 허용합니다. 유체역학적 크기와 다분산성은 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 측정됩니다. LNP의 유효 표면 전하는 제타 전위를 측정하여 결정됩니다. 캡슐화 효율은 힌지된 핵산을 정량화하기 위해 형광염을 사용하는 것이 특징입니다. 대표적인 결과는 이 방법의 재현성과 상이한 제형 및 공정 파라미터가 개발된 LNP에 미치는 영향을 입증한다.

서론

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약물 운반대는 낮은 세포 독성, 생체 이용률 증가 및 향상된 안정성1,2,3을포함한 전형적인 유리한 특성을 가진치료법을보호하고 전달하는 데 사용됩니다. 중합체 나노 입자, 미셀 및 지질 계 입자는 이전에 핵산 캡슐화 및전달을위해 탐구되었다4,5,6,7. 지질은 고안정성8과생체 적합성이기 때문에 지질및 지질 나노입자를 포함한 다양한 유형의 나노캐리어 시스템에서 사용되어 왔다. LP는 유전자전달9,10을위해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있다. 그들은 전신 순환(11) 동안 혈청 프로테아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고 LP의 표면 지형 및 물리적 특성이 그들의 생체분포에영향....

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프로토콜

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전체 프로세스의 회로도는 그림 1에서제공됩니다.

1. 버퍼 준비

참고: 완충제의 멸균 여과는 핵산 및 LNP 품질에 영향을 미칠 수 있는 미립자를 제거하기 위해 여기에서 매우 권장됩니다.

  1. 인산염 완충식식염수(PBS)
    1. 8m Na2HPO4,2mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl을 사용하여 1x PBS를 뉴클레아제 자유수역에서 준비하고 pH를 7.4로 조정한다.
    2. 0.22 μm 모공 크기의 필터를 사용하여 진공 여과로 살균하십시오.
  2. 체연성 버퍼
    1. 5mM 나트륨 구연산, 5mMM 구연산, 150mMM나트륨염화를 뉴클레아제 자유수분으로 사용하여 구연산 완충제를 준비하고 pH 4.5에 적응한다.
    2. 0.22 μm 모공 크기의 필터를 사용하여 진공 여과로 살균하십시오.
      참고: 구연산 버퍼는 mRNA가 LNP에서 캡슐화될 핵산인 경우에만 준비되어야 합니다. DNA가 캡슐화될 경우 1.2를 건너뛰고 1.3으로 진행한다.
      3. ....

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결과

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동일한 지질 제형 및 6의 N/P 비율을 가진 LP의 다중 배치는 기술의 재현성을 입증하기 위하여 별도의 일에 개발되었다. 배치 1 과 2 유사한 다분산성과 겹치는 크기 분포를 초래하였다(도2A)두 개의 상이한 배치(도2B)사이의 크기 또는 캡슐화 효율에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 캡슐화 효율은 각 배치(>98.5%)에 대해 높았으며 크기는 77nm LNP 직경과 유사했습니다. 입자는 배치 1의 경우 0.15의 평균 다분산지수 지수(PDI)와 배치 2의 0.18로 균일했습니다.

제형 파라미터의 변화는 N/P 비, 이온화지질 사용 및 캡슐화된 핵산에 대하여 일부 작지만 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 차이점이 논의되는 동안, 형성된 모든 LP는 .......

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토론

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재현성, 속도 및 저부피 스크리닝은 다른 기존 방법(예: 지질 필름 수화 및 에탄올 주입)에 비해 LP를 형성하기 위해 미세유체 혼합을 사용하는 데 상당한 이점이 있습니다. 우리는 다른 LNP 배치로 관찰 된 캡슐화 효율이나 입자 크기에 영향을 미치지 않고이 방법의 재현성을 입증했습니다. 이것은 LP를 포함하여 어떤 치료든지, 임상적으로 유효하게 하기 위한 필수적인 기준입니다.

여기에 설명된 기술은 단 몇 분의 시간 규모에 LNP 형성결과 비틀거리는 헤링본 미세 유체 혼합을 채택합니다. 이 혼합은 제어 및 단축 시간27에유리한 혼란스러운 흡인을 사용합니다. 이 믹서는 수성 및 유기 상이 효과적으로 서로27을 감싸수 있습니다. 비틀거리는 헤링본 혼합을 사용하여, 이전 연구는 입자가 가장 작은 열역학적으로 안정된크기(32)에서형성되는 것으로 나타났으며, 이.......

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공개 사항

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모든 저자는 사오피의 직원입니다. 저자는 이해 상충이나 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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아툴 살루자, 야틴 고칸, 마리아 테레사 페라키아, 월터 슈벵거, 필립 자카스가 LNP 개발에 대한 지도와 공헌에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)Avanti 극성 지질880151P
10 &마이크로; l 눈금이 매겨진 필터 팁  (RNase-,DNase-, DNA 프리)미국 과학1121-3810
1000 &마이크로; l 눈금이 매겨진 여과기 끝 (RNase-, DNase-, DNA 자유)미국 과학1111-2831
20 µ l 비스듬한 여과기 끝 (RNase-, DNase-, DNA가 자유로운)미국 과학적인1120-1810
200 µ l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol)Sigma-AldrichC8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Vacutainer 범용 주사기 바늘 (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
벤치탑 원심분리기Beckman coulter
Black 96 well platesThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)Thermo Fisher Scientific14-380-813
구연산Fisher Scientific02-002-611
Corning 500ml 진공 필터/보관 병 시스템, 0.22um 기공Corning430769
일회용 접힌 모세관 셀MalvernDTS1070
에틸 알코올, 순수 200 프루프Sigma-Aldrich459844
Fisher 브랜드 세미 마이크로 큐벳Thermo Fisher Scientific14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter UnitsThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblrBenchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificAM9930
ThermoFisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA 분석 키트Thermo Fisher ScientificR11490
염화나트륨Fisher Scientific02-004-036
구연산나트륨, 이수화물, 과립Fisher Scientific02-004-056
SpectraMax i3xMolecular Devices
Zetasizer NanoMalvern
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)Thermo Fisher Scientific 14-823-436

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.

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재인쇄 및 허가

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