이 프로토콜은 신생물의 다양한 측면을 연구하기 위해 초 파리 종양을 성인 숙주의 복부로 초기 및 지속적인 세대 동종 이식에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 자동 인젝터 장치를 사용하여 연구원은 기존의 수동 방법에 의해 달성 된 것과 비교하여 향상된 효율과 종양 수율을 달성 할 수 있습니다.
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방법 논문
프로그래밍 가능한 자동 나노리터 인젝터 를 사용한 초파리 멜라노가스터 에서의 종양 동종이식
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 자동 나노리터 주사 장치를 사용하는 초파리 멜라노가스터 에서 종양의 동종이식을 기술한다. 자동 인젝터 장치를 사용하면 숙련 된 작업자가 수동 인젝터를 사용하여 얻은 것보다 더 효율적이고 일관된 이식 결과를 얻을 수 있습니다. 여기에서, 우리는 연대순으로 주제를 다룹니다 : 초파리 선의 교차에서부터 원발성 종양의 유도 및 해부, 원발성 종양을 새로운 성인 숙주로 이식하고 확장 된 연구를 위해 종양의 지속적인 세대 이식에 이르기까지. 실증으로서, 여기서 우리는 세대 이식을 위해 노치 세포내 도메인 (NICD) 과발현 유도 타액선 상상 고리 종양을 사용한다. 이들 종양은 먼저 유충 타액선 상상 고리 내의 전이 구역 미세환경에서 확실하게 유도될 수 있고, 이어서 동종이식편되고 생체내에서 배양되어 지속적인 종양 성장, 진화 및 전이를 연구할 수 있다. 이러한 동종이식 방법은 잠재적인 약물 스크리닝 프로그램뿐만 아니라 종양-숙주 상호작용을 연구하는데 유용할 수 있다.
서론
이 프로토콜은 자동 나노리터 주사 장치(예를 들어, Nanoject)를 사용하여 초파리 유충 타액선(SG) 상상 고리 종양을 성인 숙주의 복부 내로의 동종이식을 위한 단계별 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 새로운 세대의 성인 숙주로의 종양의 후속 재동종이식편에 대한 지침을 제공하며, 이는 종양 진화 및 종양-숙주 상호작용과 같은 종양 특성에 대한 지속적인 종단 연구를 위한 기회를 제공한다. 이 프로토콜은 또한 약물 스크리닝 실험에 적용될 수 있다.
이 방법은 수동 인젝터1을 사용하여 초파리에서 종양 동종 이식을 수행하는 효능을 향상시키기 위해 개발되었으며, 이는 종종 흡입 및 주사력에 일관성이 없어 종양 동종 이식에 대한 차선책의 결과를 초래합니다. 자동 인젝터 장치는 더 나은 제어를 제공하며 동종 이식 후 파리 사망률을 낮출 수 있습니다. 훈련된 작업자는 수동 인젝터를 사용했을 때 약 80%에 비해 자동 인젝터로 90% 이상의 호스트 생존율을 달성할 수 있었습니다1. 전체 종양 획득률은 동종이식편 후 8-12일째에 60%-80%이다. 평균 주입 시간도 수동 인젝터를 사용하여 비행 당 30-40 초에서 자동 인젝터를 사용....
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프로토콜
1. SG 상상고리종양의 제조
- 교차 성인은 UAS-NICD (남성 : 10-15 파리)와 Act-Gal4, UAS-GFP / CyO; tub-Gal80ts (처녀 암컷 : 10-15 파리)의 유전자형을 가지고 파리를 다니며 18 °C에서 1 일 동안 번식 할 수 있도록합니다. 선택한 성인 파리는 높은 비옥도를 보장하기 위해 5-9 일 이상이어야합니다.
- 성인 파리가 18 °C에서 24 시간 동안 바이알에 들어있는 파리 사료에 알을 낳도록 허용한 다음 성인 파리를 제거하십시오.
참고 : 플라이 푸드는 Drosophila Stock Center8의 표준 옥수수 가루 식품 레시피를 사용하여 준비됩니다. 각 바이알에는 약 10mL의 플라이 푸드가 들어 있어야합니다. - 난자가 18°C에서 6일 동안 배양되도록 허용한다. 이 기간 동안 애벌레는 부화 할 것입니다.
- 유충을 함유하는 바이알을 29°C 인큐베이터로 옮기고 또 다른 7일 동안 인큐베이션한다.
참고: 이 인큐베이션 단계는 특정 실험 설계에 따라 선택 사항입니다.
2. 동종이식을 위한 성인 야생형 <....
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결과
여기에서는 나노리터 주사 자동 주입 장치를 사용하여 SG 상상 고리 종양의 세대 동종 이식을 수행하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 후속 종양 라이브 이미징을 수행하여 종양 성장, 종양 세포 이동 및 종양 - 숙주 상호 작용에 대한 주제에 대해 더 깊이 파고 들었습니다. 파리를 장착 할 때 현미경 슬라이드에 붙이고 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 블록11을 통해 제지하십시오.
도 5A는 동종이식 후 10일째에 성인 숙주 복부에서 성장하는 1세대 (G1) SG 상상의 고리 종양의 라이브 이미징 캡처를 특징으로 한다. 이러한 수준의 영상화는 종양 분열의 과정을 추적하는데 사용될 수 있다. 도 5B 는 동종이식 후 10일째에 숙주 복부의 많은 부분을 차지하는 6세대 (G6) SG 상상 고리 종양을.......
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토론
종양 동종 이식은 연구자가 초파리 종양 성장 및 진행 중에 발생하는 특정 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러한 도전 중 하나는 원발성 종양 배양12 동안 종양을 가진 유충 또는 성인의 조기 사망을 우회하는 것입니다. 이러한 맥락에서, 지속적인 종양 동종이식은 종양이 무기한으로 성장할 수 있게 하여, 종양 성장, 전이 및 진화에 대한 종단 연구를 용이하게 한다. 종양 동종이식은 또한 숙주-종양 상호작용7,13의 다양한 양태를 평가하는데 유용하다. 숙주 유전자형은 종양 동종이식편 전에 조작되어 종양 성장 및 이동에 대한 숙주 효과의 평가를 허용하고, 종양-유도된 악액질14,15에 대한 숙주 효과를 허용할 수 있다. 상이한 유전자형을 갖는 플라이 호스트는.......
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공개 사항
저자들 사이에서 선언 할 이해 상충은 없습니다.
감사의 글
우리는 전 실험실 구성원 인 Sheng-An Yang 박사와 Juan-Martin Portilla 씨가이 프로토콜을 개발하는 데 기여한 것에 대해 감사드립니다. 북경 대학 생명 과학 대학원의 Yan Song 박사의 실험실에서 수동 동종 이식에 대한 프로토콜을 공유 한 것에 감사드립니다. 우리는 또한 Calder Ellsworth와 Everest Shapiro 씨가 원고를 비판적으로 읽어 주신 것에 감사드립니다.
WMD는 국립 보건원 (https://www.nih.gov/)으로부터이 작업에 대한 자금 (GM072562, CA224381, CA227789)과 국립 과학 재단 (htps://nsf.gov/)으로부터 자금 (IOS-155790)을 받았다. 기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Zeiss | LSM 980 | 일명 "Zeiss LSM 980 |
| "옥수수 가루 플라이 푸드 | 블루밍턴 초파리 재고 센터 | N / A | "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| 해부 바늘 (30Gx1 / 2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| 플라이 테이프 | Fisherbrand | 159015A | |
| 전자 현미경 과학 | SFA-UV | 용 형광 어댑터 | "NightSea 형광 어댑터"라고도 함 |
| 형광 현미경 | Zeiss | 495015-0001-000 | "Zeiss Stereo Discovery.V8"이라고도 함. |
| 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11251-10 | "Dumont #5 Forceps"라고도 합니다 |
| 유리 모세관 (3.5 ") | : Drummond | 3-000-203-G / X | |
| 접착제 | Elmer | E305 | 일컬어 "Elmer Washabale Clear Glue" |
| 광 현미경 | : Zeiss | 435063-9010-100 | 일컬어 "Zeiss Stemi 305" |
| 마이크로 피펫 풀러 | 세계 정밀 기기 | PUL-1000 | 일컬어 "Four Step Micropipette Puller"" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | 일컬어 "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| 슈나이더의 매체 | ThermoFisher | 21720001 | |
| 주사기 (27G x1 / 2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| 바이알 | Fisherbrand | AS507 |
참고문헌
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem....
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재인쇄 및 허가
