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방법 논문

프로그래밍 가능한 자동 나노리터 인젝터 를 사용한 초파리 멜라노가스터 에서의 종양 동종이식

2.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62229

⸱

2021년 2월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Tulane University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 신생물의 다양한 측면을 연구하기 위해 초 파리 종양을 성인 숙주의 복부로 초기 및 지속적인 세대 동종 이식에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 자동 인젝터 장치를 사용하여 연구원은 기존의 수동 방법에 의해 달성 된 것과 비교하여 향상된 효율과 종양 수율을 달성 할 수 있습니다.

초록

이 프로토콜은 자동 나노리터 주사 장치를 사용하는 초파리 멜라노가스터 에서 종양의 동종이식을 기술한다. 자동 인젝터 장치를 사용하면 숙련 된 작업자가 수동 인젝터를 사용하여 얻은 것보다 더 효율적이고 일관된 이식 결과를 얻을 수 있습니다. 여기에서, 우리는 연대순으로 주제를 다룹니다 : 초파리 선의 교차에서부터 원발성 종양의 유도 및 해부, 원발성 종양을 새로운 성인 숙주로 이식하고 확장 된 연구를 위해 종양의 지속적인 세대 이식에 이르기까지. 실증으로서, 여기서 우리는 세대 이식을 위해 노치 세포내 도메인 (NICD) 과발현 유도 타액선 상상 고리 종양을 사용한다. 이들 종양은 먼저 유충 타액선 상상 고리 내의 전이 구역 미세환경에서 확실하게 유도될 수 있고, 이어서 동종이식편되고 생체내에서 배양되어 지속적인 종양 성장, 진화 및 전이를 연구할 수 있다. 이러한 동종이식 방법은 잠재적인 약물 스크리닝 프로그램뿐만 아니라 종양-숙주 상호작용을 연구하는데 유용할 수 있다.

서론

이 프로토콜은 자동 나노리터 주사 장치(예를 들어, Nanoject)를 사용하여 초파리 유충 타액선(SG) 상상 고리 종양을 성인 숙주의 복부 내로의 동종이식을 위한 단계별 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 새로운 세대의 성인 숙주로의 종양의 후속 재동종이식편에 대한 지침을 제공하며, 이는 종양 진화 및 종양-숙주 상호작용과 같은 종양 특성에 대한 지속적인 종단 연구를 위한 기회를 제공한다. 이 프로토콜은 또한 약물 스크리닝 실험에 적용될 수 있다.

이 방법은 수동 인젝터1을 사용하여 초파리에서 종양 동종 이식을 수행하는 효능을 향상시키기 위해 개발되었으며, 이는 종종 흡입 및 주사력에 일관성이 없어 종양 동종 이식에 대한 차선책의 결과를 초래합니다. 자동 인젝터 장치는 더 나은 제어를 제공하며 동종 이식 후 파리 사망률을 낮출 수 있습니다. 훈련된 작업자는 수동 인젝터를 사용했을 때 약 80%에 비해 자동 인젝터로 90% 이상의 호스트 생존율을 달성할 수 있었습니다1. 전체 종양 획득률은 동종이식편 후 8-12일째에 60%-80%이다. 평균 주입 시간도 수동 인젝터를 사용하여 비행 당 30-40 초에서 자동 인젝터를 사용하여 비행 당 20-25 초로 향상되었습니다.

이 프로토콜은 초파리 종양 동종 이식에서 자동 주입기 장치를 사용하는 처음 몇 가지 프로토콜 중 하나입니다. 최근의 한 연구는 또한 종양성 신경 줄기 세포의 동종이식을 위해 자가주입기를 사용하였다2. 이전에, 자가 인젝터 장치는 초파리 에서 박테리아 독성3, 기생충 감염 및 숙주 방어4를 연구하고 다른 화합물5의 생체 활성을 스크리닝하기 위해 사용되었습니다. 우리의 프로토콜은 종양 주사 사용을 위해 자동 인젝터 장치를 적응시키고 Drosophila 연구원에게 상당한 시간을 절약하면서 더 높은 품질과 일관된 결과를 제공하고자합니다. 이 프로토콜은 종양의 동종 이식에 사용될 수있을뿐만 아니라 유사한 구경6의 야생형 및 돌연변이 조직의 동종 이식에도 적합 할 수 있습니다.

이 프로토콜에 사용 된 초파리 NICD 종양은 SG 상상 고리 전이 구역, 높은 수준의 내인성 야누스 키나제 / 신호 변환기 및 전사 활성제 (JAK-STAT) 및 c-Jun N 말단 키나아제 (JNK) 활성을 나타내는 "종양 핫스팟"에서 Yang et al.7 에 의해 처음 도입되었습니다. 추가적으로, 전이 영역은 높은 수준의 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (MMP1)7을 가지며, 이는 이 영역을 특히 종양 발생에 도움이 되게 한다. NICD 과발현 단독을 통한 노치 경로 활성화는 종양 형성을 일관되게 개시하기에 충분하다. 이들 종양은 종양 세포 분열, 침윤 및 종양-숙주 상호작용을 포함하는 광범위한 주제의 조사를 허용하기 위해 후속적으로 동종이식될 수 있다.

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프로토콜

1. SG 상상고리종양의 제조

  1. 교차 성인은 UAS-NICD (남성 : 10-15 파리)와 Act-Gal4, UAS-GFP / CyO; tub-Gal80ts (처녀 암컷 : 10-15 파리)의 유전자형을 가지고 파리를 다니며 18 °C에서 1 일 동안 번식 할 수 있도록합니다. 선택한 성인 파리는 높은 비옥도를 보장하기 위해 5-9 일 이상이어야합니다.
  2. 성인 파리가 18 °C에서 24 시간 동안 바이알에 들어있는 파리 사료에 알을 낳도록 허용한 다음 성인 파리를 제거하십시오.
    참고 : 플라이 푸드는 Drosophila Stock Center8의 표준 옥수수 가루 식품 레시피를 사용하여 준비됩니다. 각 바이알에는 약 10mL의 플라이 푸드가 들어 있어야합니다.
  3. 난자가 18°C에서 6일 동안 배양되도록 허용한다. 이 기간 동안 애벌레는 부화 할 것입니다.
  4. 유충을 함유하는 바이알을 29°C 인큐베이터로 옮기고 또 다른 7일 동안 인큐베이션한다.
    참고: 이 인큐베이션 단계는 특정 실험 설계에 따라 선택 사항입니다.

2. 동종이식을 위한 성인 야생형 초파리 의 제조

  1. 야생형 또는 적절한 돌연변이 성인 파리를 100%CO2로 마취시키고 성별에 따라 파리를 분류합니다. 수컷과 암컷 파리 모두 종양 숙주로 사용할 수 있습니다.
  2. 5cm 길이의 플라이 테이프 조각을 현미경 슬라이드에 고정하고 끈적 끈적한면을 양쪽 끝에 하나씩 두 개의 작은 테이프 조각으로 고정하십시오.
  3. 날개를 테이프에 부착하여 파리를 고정시킵니다. 파리를 조종하는 동안 포셉을 사용하십시오.
    1. 동종 이식편 수용체로 사용되는 60-80 마리의 성인 파리에 대해 위의 단계를 반복하십시오.
      참고 : 파리를 깔끔한 행으로 구성하는 것이 가장 좋으며, 나중에 더 시간 효율적인 주입 과정을 위해 신체 축이 서로 평행하게 정렬되어 있습니다. 그림 1에서는 이러한 방식으로 테이핑된 호스트 파리의 행을 보여 줍니다.

3. 자동 인젝터 장치의 조립

  1. 자동 인젝터 장치와 전원 코드를 컨트롤러 상자에 연결합니다.
    1. 주입 부피를 59.8 nL로 설정하십시오. 이것은 동종 이식 중에 적절한 양의 흡입 및 주사력을 유지하는 데 도움이됩니다.
  2. 컨트롤러 상자와 자동 인젝터를 광학 현미경의 반대쪽에 놓습니다.
    참고: 오른손잡이 작업자의 경우, 컨트롤 박스는 현미경의 왼쪽에 배치해야 하며 오른쪽에는 인젝터가 있어야 합니다. 왼손잡이 연산자의 경우도 마찬가지입니다.
  3. 포셉으로 닫힌 끝을 잘라내어 사용할 3.5 ''유리 모세관을 준비하십시오.
    1. 4 단계 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관의 한쪽 끝을 처리하고 계측기의 다음 사양을 사용하여 좁고 닫힌 끝으로 가열하십시오 : 열 = 650, 힘 = 200 및 거리 = 8. 모세 혈관을 풀러 장치에 깔끔하게 배치하고 위의 설정을 입력 한 후 프로그램을 실행하십시오.
    2. 포셉을 사용하여 모세관을 약 60 ° 각도로 클립하여 성인 비행 복부에 쉽게 들어갈 수 있도록 더 선명한 끝을 만듭니다1. 잘 잘린 모세관의 예를 보려면 그림 2 를 참조하십시오.
  4. 인젝터의 캡을 가볍게 풉니다. 전체 길이의 70%-80%가 표시될 때까지 Empty 버튼을 눌러 인젝터 바늘을 전진시킵니다. 모세관 진행을 가속화하려면 채우기 버튼을 한 번 누른 채 빈 버튼을 누른 채 누릅니다.
  5. 주사기를 사용하여 유리 모세관을 미네랄 오일로 채 웁니다. 그런 다음 전자가 인젝터의 고무 마개에 단단히 부착 될 때까지 유리 모세관을 인젝터 바늘에 조심스럽게 삽입하십시오. 이제 인젝터 캡을 단단히 조이십시오.
    1. 유리 모세관 커버의 외부 표면에 남아 있는 미네랄 오일을 닦아내어 동종이식 동안 매질을 오염시키지 않도록 합니다.

4. SG 상상고리 종양의 해부

  1. 유충 중 하나를 선택하고 100 μL의 슈나이더 배지로 채워진 해부 플레이트로 옮겨 SG 상상 고리 종양 해부를 준비하십시오.
    참고 : 종양을 보유하고있는 표본 만 애벌레로 남아 있습니다. 이는 종양 성장이 애벌레의 발달과 진행을 지연시키기 때문이다9. 표본의 삼분의 일은 종양을 보유하지 않을 것이므로 번데기 / 성인으로 진행될 것입니다.
    1. 해부 및 동종 이식 목적을 위해, 10x-20x 배율 범위의 입체 현미경을 사용하십시오.
  2. 애벌레 몸체의 중간 부분을 잡기 위해 한 쌍의 포셉을 사용하여 다른 포셉을 사용하여 애벌레 머리를 꼬집고 길게 스트레칭 힘을 가하십시오.
  3. 유충의 Y 자형 SG를 찾아 나머지 애벌레 조직(10)에서 분리하십시오.
  4. 인접한 조직을 제거하여 SG 상상 고리 종양을 해부하고 분리한다. 이 해부 과정을 묘사하려면 그림 3 을 참조하십시오.
  5. 연구 요구에 따라 추가 10-20개의 SG 상상 고리 종양에 대해 4.1-4.4단계를 반복합니다.

5. 원발성 SG 상상고리 종양의 동종이식편

  1. 모세관을 원발성 SG 상상 고리 종양이 들어있는 슈나이더 배지에 잠급니다. 채우기 버튼을 눌러 유리 모세관을 슈나이더 미디엄으로 채워 상단 0.5cm 세그먼트까지 채웁니다. 이 상단 세그먼트는 미네랄 오일로 채워져 있어야합니다.
    참고: 채우기 단추를 누른 상태에서 빈 단추를 한 번 눌러 이 프로세스를 가속화하십시오.
  2. 원발성 종양을 찾고 종양이 모세관으로 흡입 될 때까지 채우기 버튼을 누릅니다.
    1. 종양이 모세관의 끝 또는 모세관의 끝에서 몇 밀리미터 떨어진 곳에 있는지 확인하십시오. 이것은 종양이 표류하고 모세관 내에 포함 된 용액에서 손실되는 것을 방지하는 데 도움이됩니다. 모세관에 앉을 때 적절한 종양 위치의 입증을 위해 도 4A 를 참조한다.
  3. 현미경 슬라이드에서 테이프에 고정되어있는 성인 파리를 찾습니다. 포셉을 사용하여 하복부를 부드럽게 잡으십시오. 그런 다음 모세관으로 복부의 아래쪽 측면 큐티클을 관통하십시오. 종양이 새 숙주 복부에 들어갈 때까지 Empty 버튼을 누릅니다. 이 기술의 데모는 그림 4B 를 참조하십시오.
  4. 포셉을 사용하여 호스트의 날개를 부드럽게 꼬집어 테이프에서 제거하십시오. 주인을 신선한 음식으로 새로운 바이알에 넣으십시오. 주사 후 초기 24 시간 동안 바이알을 옆으로 놓는 것이 가장 좋습니다. 각 바이알에는 최대 20 마리의 파리 만 포함되어야합니다.
    참고 : 일부 숙주 파리는 주사 후 몸에 날개와 다른 상처가 없으며 바이알을 똑바로 세우면 플라이 푸드에 달라 붙을 수 있습니다.
  5. 단계 5.2 내지 5.4를 반복하여 나머지 원발성 종양을 그들의 새로운 성인 숙주에 이식한다.
  6. 모세 혈관을 날카로운 용기에 넣고 장치를 상자에 다시 교체하기 전에 자동 인젝터 외부에서 미네랄 오일 잔류 물을 청소하십시오.
  7. 숙주의 바이알을 실온에서 1일 동안 보관한 다음, 바이알을 29°C의 인큐베이션 챔버로 옮긴다. 비행 호스트를 2-3 일마다 새로운 바이알로 옮기십시오.
  8. 매일 비행 호스트를 모니터링하고 생존율을 계산하십시오. 일주일 후, 종양은 형광 어댑터가있는 스테레오 현미경으로 볼 수 있어야하며 크기와 진행을 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.

6. 이식된 종양의 재동종이식편

  1. 동종이식편 후 약 10-14일 후, 형광 현미경을 사용하여 숙주 복부에서 성장한 종양을 스크리닝한다.
  2. 숙주를CO2 로 마취시키고 100 μL 슈나이더 매질로 채워진 해부 플레이트에 놓는다. 성장한 동종이식편된 종양을 두 쌍의 포셉을 사용하여 숙주 밖으로 해부한다.
    1. 한 쌍의 포셉을 사용하여 복부를 누르고 다른 한 쌍은 복부 큐티클을 절개하여 동종 이식 된 종양을 노출시킵니다1.
    2. 지침으로 형광 마커를 사용하여 가능한 한 많이 부착된 숙주 조직으로부터 종양을 조심스럽게 분리한다.
  3. 단계 6.2를 반복하여 2 내지 세 개의 추가적인 동종이식편된 종양을 준비한다.
  4. 수확된 종양을 포함하는 해부 플레이트를 광학 현미경의 스테이지 상으로 옮긴다.
  5. 멸균 바늘을 사용하고 종양을 모세관 크기에 적합한 작은 조각으로 해부하십시오.
  6. 새로운 세대의 성인 숙주를 준비하기 위해 단계 4.1-4.5를 반복하고 5.1-5.7 단계를 반복하여 종양의 동종 이식을 완료하십시오.
    참고: 성공률은 일반적으로 원발성 종양의 성공률과 비교하여 비원발성 종양의 경우 더 높습니다.
  7. 연구에 사용 된 모든 후속 세대의 파리에 대해 6.1-6.6 단계를 반복하십시오.
    참고: 실험적 요구에 적합한 초파리 숙주 라인을 선택하십시오.

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결과

여기에서는 나노리터 주사 자동 주입 장치를 사용하여 SG 상상 고리 종양의 세대 동종 이식을 수행하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 후속 종양 라이브 이미징을 수행하여 종양 성장, 종양 세포 이동 및 종양 - 숙주 상호 작용에 대한 주제에 대해 더 깊이 파고 들었습니다. 파리를 장착 할 때 현미경 슬라이드에 붙이고 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 블록11을 통해 제지하십시오.

도 5A는 동종이식 후 10일째에 성인 숙주 복부에서 성장하는 1세대 (G1) SG 상상의 고리 종양의 라이브 이미징 캡처를 특징으로 한다. 이러한 수준의 영상화는 종양 분열의 과정을 추적하는데 사용될 수 있다. 도 5B 는 동종이식 후 10일째에 숙주 복부의 많은 부분을 차지하는 6세대 (G6) SG 상상 고리 종양을...

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토론

종양 동종 이식은 연구자가 초파리 종양 성장 및 진행 중에 발생하는 특정 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러한 도전 중 하나는 원발성 종양 배양12 동안 종양을 가진 유충 또는 성인의 조기 사망을 우회하는 것입니다. 이러한 맥락에서, 지속적인 종양 동종이식은 종양이 무기한으로 성장할 수 있게 하여, 종양 성장, 전이 및 진화에 대한 종단 연구를 용이하게 한다. 종양 동종이식은 또한 숙주-종양 상호작용7,13의 다양한 양태를 평가하는데 유용하다. 숙주 유전자형은 종양 동종이식편 전에 조작되어 종양 성장 및 이동에 대한 숙주 효과의 평가를 허용하고, 종양-유도된 악액질14,15에 대한 숙주 효과를 허용할 수 있다. 상이한 유전자형을 갖는 플라이 호스트는...

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공개 사항

저자들 사이에서 선언 할 이해 상충은 없습니다.

감사의 글

우리는 전 실험실 구성원 인 Sheng-An Yang 박사와 Juan-Martin Portilla 씨가이 프로토콜을 개발하는 데 기여한 것에 대해 감사드립니다. 북경 대학 생명 과학 대학원의 Yan Song 박사의 실험실에서 수동 동종 이식에 대한 프로토콜을 공유 한 것에 감사드립니다. 우리는 또한 Calder Ellsworth와 Everest Shapiro 씨가 원고를 비판적으로 읽어 주신 것에 감사드립니다.

WMD는 국립 보건원 (https://www.nih.gov/)으로부터이 작업에 대한 자금 (GM072562, CA224381, CA227789)과 국립 과학 재단 (htps://nsf.gov/)으로부터 자금 (IOS-155790)을 받았다. 기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경ZeissLSM 980일명 "Zeiss LSM 980
"옥수수 가루 플라이 푸드블루밍턴 초파리 재고 센터N / A"BDSC Standard Cornmeal Food"
해부 바늘 (30Gx1 / 2)BD PrecisionGlide305106
Dissection PlateFisher Scientific12-565B
플라이 테이프Fisherbrand159015A
전자 현미경 과학SFA-UV용 형광 어댑터"NightSea 형광 어댑터"라고도 함
형광 현미경Zeiss495015-0001-000"Zeiss Stereo Discovery.V8"이라고도 함.
펜치파인 사이언스 도구11251-10"Dumont #5 Forceps"라고도 합니다 
유리 모세관 (3.5 "): Drummond3-000-203-G / X
접착제ElmerE305일컬어 "Elmer Washabale Clear Glue"
광 현미경: Zeiss435063-9010-100일컬어 "Zeiss Stemi 305"
마이크로 피펫 풀러세계 정밀 기기PUL-1000일컬어 "Four Step Micropipette Puller""
Nanoject ApparatusDrummond3-000-204일컬어 "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
슈나이더의 매체ThermoFisher21720001
주사기 (27G x1 / 2)BD PrecisionGlide305109
바이알FisherbrandAS507
Stero 현미경 , ,

참고문헌

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  9. Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
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  15. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  16. Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).

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