우리는 모델 척추 동물 머리 세포 시스템에서 모터 명령 중 발포성 뉴런 활동의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
감각 시스템은 행동을 지시하는 데 필수적인 단서를 수집하지만 동물은 생물학적으로 관련된 정보를 해독해야합니다. 운동운동은 동물이 주변 환경의 관련 감각 단서에서 벗어나야 한다는 재흡수성 단서를 생성합니다. 예를 들어, 물고기가 수영할 때, 신체 기복으로부터 생성된 흐름은 모발 세포를 포함하는 기계광 신경종에 의해 검출되어 측면 선 시스템을 구성한다. 모발 세포는 감각 발포성 뉴런을 통해 센서에서 뇌로 유체 운동 정보를 전송합니다. 동시에, 모터 명령의 동시 방전은 감각 과부하를 방지하기 위해 모발 세포에 릴레이된다. 운동 중 예측 모터 신호의 억제 효과를 고려하므로 측면 선 시스템의 감도를 평가할 때 매우 중요합니다. 우리는 몇 시간 동안 지속될 수 있는 제브라피시 애벌레(4-7일 후 수정)에서 후방 측면선 발포성 뉴런 및 복부 모터 루트 활성을 동시에 모니터링하는 생체 내 전기생리학적 접근법을 개발했습니다. 포이발성 뉴런의 세포외 기록은 단일 또는 다중 뉴런에서 활동을 감지할 수 있는 느슨한 패치 클램프 기술을 사용하여 달성됩니다. 복부 뿌리 기록은 모터 뉴런 활동을 검출하기 위해 유리 전극으로 피부를 통해 수행됩니다. 당사의 실험 프로토콜은 척추동물과 동작하는 그대로 모터 동작에 걸쳐 내인성 또는 유발된 감각 입력의 변화를 모니터링할 수 있는 잠재력을 제공합니다.
서론
메카노 감각 시스템의 발포성 뉴런은 청력과 균형 동안 모발 세포에서 뇌로 정보를 전송합니다. 전기 생리학은 직접 기록을 통해 포성 뉴런의 감도를 나타낼 수 있습니다. 모발 세포에서 전체 세포 패치는 어려울 수 있지만, 다운스트림 포성 뉴런에서 기록하는 것은 더 쉬우며 제어 자극1,2,3에대한 응답으로 작용 잠재력의 평가를 할 수 있습니다. 자극하는 모발 세포는 메카노감각 구조를 수정하는 편향으로 이어지므로 포근성 뉴런4,5,6에서작용 잠재력(스파이크)의 증가를 유발한다. 외부 자극이 없는 경우, 발포성 뉴런은 모발 세포로부터 발구성 시냅스 후 단자7,8로글루타민트 누출로 인해 자발적으로 스파이크하고, 감도9,10을유지하는 데 기여하는 것으로 나타났다. 포....
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프로토콜
모든 동물 관리 및 실험은 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 전기 생리적 기록을 위한 재료 준비
- 실리콘 엘라스토머 바닥 녹음 접시를 만드십시오.
- 실리콘 엘라스토머 성분(예: 실가드)을 커버 글래스 바닥 조직 배양 접시에 분배하여 얕은 우물의 테두리와 함께 레벨을 넘습니다. 약 0.5 mL이 충분합니다.
- 실온에서 최소 48시간 동안 접시를 덮고 치료하십시오.
- 해부 핀을 만듭니다.
- DC 전원 공급 장치를 사용하여 100mL 의 에트텐 비커(3M KOH)에 음전하(5V)를 제공하고 텅스텐 와이어(0.002인치; 50.8 μm 직경)를 양전하 출력에 부착한다.
주의: 잠재적인 화재 위험을 초래할 수 있는 불꽃을 생산할 위험이 있으므로 이 절차 중에 음수 및 양수 와이어가 서로 연락해서는 안 됩니다. - 에칭 텅스텐 와이어신속하고 반복적으로 팁이 날카로운 지점으로 좁힐 때까지 에탕 목욕에 와이어의 끝을 찍어. 스테레오현미경 아래에서 가장자리 면도날로 끝에서 약 1mm 의 와이어를 잘라냅니다. 세 번 더 반복한 다음 미세 한 집게를 사용하여 경화 된 녹음 접시에 핀을....
- DC 전원 공급 장치를 사용하여 100mL 의 에트텐 비커(3M KOH)에 음전하(5V)를 제공하고 텅스텐 와이어(0.002인치; 50.8 μm 직경)를 양전하 출력에 부착한다.
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결과
제브라피시 애벌레가 제대로 고정되고 후방 측면선 포렌트 신경절및 VR 레코딩이 달성된 후, 포퍼런트 및 모터 뉴런 모두에서의 활동을 동시에 측정할 수 있다. 녹화 채널은 비응성 및 VR 활동을 지속적으로 모니터링하기 위해 간격이 없는 레코딩 프로토콜(단계 1.4)을 사용하여 표시됩니다. 실시간으로, 자발적인 포성 스파이크 속도의 감소는 가상의 수영 시합을 나타내는 VR 활동과 동시 관찰될 수있다(그림 1E). 최상의 결과와 정확한 스파이크 감지는 최소 0.5의 신호 대 노이즈 비율을 달성한 레코딩 제품임을 발견했습니다. 사용자 정의 서면 사전 처리 스크립트는 포퍼런트 및 VR 스파이크 감지의 시각화를 지원하기 위해 플롯을 생성합니다. 자발적인 포이퍼트 스파이크는 임계값, 최소 지속 시간(0.01 ms) 및 최소 간 스파이크 간격(ISI; 1 ms)과 같은 스파이크 매개 변수의 조합을 사용하여 식별됩니다. 기록을 설정하는 동안 음압을 증가하면 종종 한 번에 여러 포퍼트 단위의 .......
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토론
설명된 실험 프로토콜은 척추동물과 동작하는 그대로 모터 거동에 걸쳐 감각 입력의 내인성 변화를 모니터링할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 특히, 유충 제브라피시의 측면 선 포성 뉴런과 복부 모터 뿌리의 동시 세포 외 레코딩을 수행하는 생체 내 접근법을 자세히 설명합니다. 자발적인 발포활성은 이전에 잠재적 동시모터활동1,2,39,40,41을고려하지 않고 제브라피시를 특징으로 하였다. 복부 뿌리 기록과 모터 활동의 존재를 모니터링하지 않고, 발포활성을 해독하는 것은 자발적인 수영 중, 심지어 그 후에도 효능 억제의 영향으로 인해 과소평가될 가능성이 높다.
생체 내 전기 생리학적 기록은 본질적으로 .......
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공개 사항
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
국립보건원(DC010809), 국립과학재단(IOS1257150, 1856237), 휘트니 해양생물과학연구소의 지원을 J.C.L에 감사드립니다. 랴오랩의 과거와 현 멤버들에게 토론을 자극해 주신 것에 대해 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mL 비커 | PYREX | 1000 | 리셉터클 |
| 10x 침수 대물 | Olympus | UMPLFLN10xW | 유충 위치 지정 및 기록 전극용 저배율 |
| 40x 수침 대물렌즈 | Olympus | LUMPLFLN40XW | 전극 팁 위치 지정을 위한 더 높은 배율 및 패치 클램프 |
| abfload.m | 추가 코딩 파일, | 원시 전기 생리학 기록을 .mat 파일로 변환하기 위한 사용자 정의 작성 MATLAB 스크립트 | |
| , AffVR_preprocess.m | 추가 코딩 파일, | 기록 데이터 전처리를 위한 사용자 정의 작성 MATLAB 스크립트 | |
| BNC 동축 케이블 | ThorLabs | 2249-C-12 | 연결 증폭기 및 디지타이저 채널, 4 |
| 붕규산 유리 모세관 및 필라멘트 | Warner 필요 악기 | G150F-3 | 내경 : 0.86, 외경 : 1.50; 기록 전극을 형성하는 데 사용되는 모세관 유리 |
| burst_detect AffVR_preprocess.m | 실행하는 데 필요한 추가 코딩 파일 사용자 정의 작성된 MATLAB 기능 | ||
| N / | A N / A | 모든 컴퓨터가 작동해야합니다 | |
| DC 전원 공급 장치 | Tenma | 72-420 | 전기 에칭 해부 핀에 사용 |
| 전기생리학 디지타이저 | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | 를 통해 패치 클램프 데이터 필라멘트 획득 |
| Sutter Instrument Company | FB255B | 마이크로피펫 풀러에 사용되는 2.5mm 상자 | |
| 필라멘트 | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) 품목 번호 11295-10 | 유충 조작 및 핀 고정 |
| 스테이지 DIC 삽입에 사용 현미경 | 클램프 기록을 시각화하고 설정하는 데 사용되는 | Olympus | BX51WI |
| 유연하고 테이퍼진 피펫 팁 | Fisher Scientific | 02-707-169 | 유연한 팁으로 기록 전극에 삽입하여 팁에서 세포 외 용액을 분배할 수 있습니다 |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | 커버 유리 바닥 접시 녹음 접시 |
| KimWipe | KimTech | 34155 | 의 과도한 체액을 흡수하는 데 사용됩니다 |
| . | 710172 | 자가 믹싱 실가드 엘라스토머 | |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | 데이터 전처리를 위한 명령줄 소프트웨어 |
| 미세 전극 증폭기 | Axon Instruments, 분자 장치 | MultiClamp 700B | 패치 이중 채널 녹음용 클램프 증폭기 |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish 녹음 전극 |
| micromanipulator 제어 장치 | Siskiyou | MC1000-eR/T | 마이크로 매니퓰레이터 제어를 위한 4축 다이얼 코디네이터 |
| 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | 모세관 유리를 기록 전극으로 끌어당기기 위한 |
| 현미경 제어 장치 | Siskiyou | MC1000e | 는 고정 스테이지 및 준비 |
| 전동 마이크로 매니퓰레이터 | 주위에 현미경을 배치합니다.Siskiyou | MX7600 | 은 패치 클램프 녹음을 위한 헤드스테이지 및 부착된 녹음 전극을 배치합니다 |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | Axon MultiClamp 700B Commander 다운로드 페이지에서 다운로드 가능 |
| 광학 에어 테이블 | Newport Corporation | VH3036W-OPT | 브레드보드 절연 테이블로 현미경을 플로팅하고 기록 |
| 중 진동을 최소화합니다.Molecular Devices | 10.7.0 | 다운로드 가능 Axon pCLAMP 10 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 다운로드 페이지 | |
| 영구 잉크 마커 | amazon.com 에서 | Sharpie | 홀더에 삽입할 때 올바른 방향을 보장하기 위해 VR 전극의 앞쪽 가장자리 쪽을 표시하기 위한 |
| 페트리 접시 | Falcon | 35-3001 | 마비성 피펫 홀더에 유충을 담그는 데 사용 |
| Molecular Devices | 1-HL-U | 기록 전극을 잡고 헤드 스테이지에 연결합니다. | |
| 공압 트랜스듀서 | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | 기록 제어용 전극 내부 압력 |
| 수산화칼륨 | Sigma-Aldrich | 221473-25G | 에칭 박부 핀 |
| 실리콘 튜빙 | Tygon | 14-169-1A | 공압 트랜스듀서를 피펫 홀더에 연결하기 위한 튜빙 |
| spike_detect | 보충 코딩 파일 | ||
| 핀 팁을 시각화하는 데 사용되는 | 실체 현미경 | Carl Zeiss | Stemi 2000-C |
| 준비 중에 직선 가장자리 면도날 | Canopus | 주문 amazon.com | 해부 핀을 만들면서 텅스텐 와이어를 절단 |
| swimbout_detect | AffVR_preprocess.m | ||
| 주사기 | Becton Dickinson Compoany | 309602 | 기록에 주입하기 위해 세포 외 용액으로 채워진 |
| MATLAB 기능 이송 피펫 | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | 유충 |
| 트리카인 메탄설포네이 | Syndel | 12854 | 고용량으로 유충을 안락사시키는 데 사용되는 제약 마취제. |
| 텅스텐 와이어 | 세계 정밀 기기 Inc. | 715500 | 0.002 인치, 50.8 & m 직경; 해부 핀을 만드는 데 사용 |
| 진공 여과 장치 | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | 일회용, 멸균, 진공 여과 장치 전기 생리학에 사용되는 세포 외 용액을 살균하는 데 사용되는 전극 링거 |
| 전압 클램프 전류 클램프 헤드 스테이지 | 분자 장치 | CV-7B | 으로 사용되는 MultiClamp 700B 증폭기와 함께 제공 |
| ThermoFisher | B1601 | - 기록 전에 유충을 고정시키기 위한 |
참고문헌
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C.
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재인쇄 및 허가
