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방법 논문

터너 증후군에서 유도 다능줄기 세포의 생성 (45XO) 증후군과 관련된 신경 적자의 다운 스트림 모델링을위한 태아 세포

2.7K 조회수

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DOI:

10.3791/62240

⸱

2021년 12월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 iPSC 특성화 및 신경 분화에 사용되는 방법에 대한 설명에 이어 핵에 의한 상피 플라스미드의 전달을 통해 태아 조직 섬유아세포로부터의 통합 무료 iPSC의 생성을 설명합니다.

초록

염색체 부추는 중추 신경계 기형 과 태아 죽음을 포함하여 가혹한 선천적인 기형을 일으키는 원인이 됩니다. 산전 유전자 검사는 순전히 진단이며 질병 메커니즘을 해명하지 않습니다. 무분유 태아의 세포는 염색체 골수 부추를 베어링 귀중한 생물학적 물질이지만, 이러한 세포는 단명하여 다운스트림 연구 실험에 대한 사용을 제한합니다. 유도된 다능성 줄기세포(iPSC) 모델의 생성은 무분비 특성의 영구보존을 위한 세포 제제의 효과적인 방법이다. 그(것)들은 배아 발달을 연상시키는 전문화한 세포로 자기 갱신하고 분화합니다. 따라서 iPSC는 초기 발달 이벤트를 연구할 수 있는 훌륭한 도구역할을 합니다. 터너 증후군 (TS)은 완전히 또는 부분적으로 누락 된 X 염색체와 관련된 드문 상태입니다. 증후군은 불모, 짧은 키, 내분비, 신진 대사, 자가 면역 및 심장 혈관 무질서 및 신경 인지 결함에 의해 특징입니다. 다음 프로토콜은 TS (45XO) 태아 조직에서 섬유 아세포의 격리 및 배양, 핵에 의한 상피 리프로그래밍 플라스미드의 전달을 통한 통합 무료 TSiPSC의 생성을 설명하고 특성화에 따른다. TSiPSCs를 다시 프로그래밍하는 것은 처음에 살아있는 세포 알칼리성 인산염 염색에 의해 검열되었고, 그 다음에 는 자공성 바이오마커에 대한 광범위한 탐구에 의해. 선택된 식민지는 기계적으로 해부되었고, 여러 번 통로를 통과하고 안정적인 자가 갱신 세포가 추가 실험을 위해 사용되었다. 세포발성 전사인 OCT4, NANOG, SOX2, 세포 표면 마커 SSEA 4 및 TRA1-81 전형만능 줄기 세포를 발현하였다. 원래 45XO karyotype은 사후 리프로그래밍을 유지했다. TSiPSCs는 배아 체를 형성하고 계보 특정 바이오마커((SRY BOX17), (MYOSIN 심실 헤비 차이네브/β), (βIII TUBULIN)를 발현하는 엔도름, 중구 및 이포더름의 세포로 분화할 수 있었다. 외인성 상피 플라스미드는 자발적으로 손실되었고 세포에서 15번 을 통과한 후에는 검출되지 않았다. 이러한 TSiPSCs는 터너 증후군과 관련 되 었던 신경 인지 적자를 일으키는 결함이 있는 분자 및 세포 신경 개발을 모델링을 위한 귀중 한 세포 자원.

서론

Aneuploidies는 출생 결함/ 선천적인 기형 및 인간에 있는 임신 손실로 이끌어 내는. ~50%-70%의 표본이 임신 손실에서 세포유전학적 이상을 나타낸다. 임신 초기에 잃어버린 Aneuploid 태아는 인간 배아 발생을 밀접하게 대표하는 그밖 모형을 개발하는 필요를 올리는 실험 분석을 위해 쉽게 얻을 수 없습니다. 유전질환으로 진단된 세포로부터 유래된 유도만능 줄기세포(iPSC)는 태아발달1,2,3,4에대한 대표적인 유전적 불규칙성 및 그 결과를 모델링하는 데 사용되어 왔다. 이 iPSCs는 발전 태아의 에피블라스트 세포를 닮고 태아 형성의 초기 사건을 회상할 수 있습니다. 그(것)들은 초기 포유류 태아에 있는 세포 혈통 및 패턴화의 발달 프로그램의 이해 그리고 특성화를 허용합니다. iPSCs는 단조로운 X (터너 증후군), 삼중 증후군 2 (워카니 증후군 2), 삼중 술 13 (파타우 증후군) 및 부분 삼각체 11과 같은 aneuploidy 증후군의 산전 진단 테스트에서 이전에 유래 된 피부 섬유아세포 및 아모니오시테; 22 (에마누엘 증후군) 실패 한 개발에 관한 귀중한 통찰력을 제공 했습니다4.

터너 증후군(TS)은 여성 불임, 짧은 키, 내분비 및 대사 장애, 자가 면역 질환의 위험 증가 및 심혈관 질환에 대한 경향을 특징으로 하는 드문질환이다 5. 유일한 생존 단조로운 증후군이지만 자발적인 낙태를 유발하는 발달 배아에 치명적입니다6. TS를 가진 살아남는 개별은 그들의 세포에 있는 X 염색체 물질의 변경의 정도와 함께 존재합니다. Karyotype은 1개의 X 염색체 (45,XO)의 완전한 손실에서 45, XO/46, XX 같이 모자이크에 구역 수색합니다; 45,XO/47,XXX, 링 염색체의 존재, Y 염색체 물질의 존재 등5.

증후군의 진단은 일반적으로 초기 aneuploidy 증후군을 검출하기 위하여 현상 개별 및 chorionic villi 샘플링 (CVS)의 karyotyping 혈액에 의해 행해합니다. aneuploidy 증후군은 자발적인 낙태의 ~30%를 차지하기 때문에, 자발적인 낙태시 개념작용제(POC)의 산물을 karyotype하는 것이 일상적입니다. 이러한 태아 세포는 세포유전학 적 이상을 소유하는 융모성 빌리와 그들로부터 유래된 iPSC는 골수성 증후군4,6을연구하기 위한 생물학적 물질의 귀중한 근원을 제공한다. TS iPSC는 이전에 레트로바이러스 재프로그래밍4,쇄신비리프로그래밍을통해 초리오닉 빌리의 섬유아세포(산전 진단을 통해 획득)를 통해, 혈액 단핵세포7에서 센다이 바이러스 재프로그래밍을 통해, 그리고 렌티바이러스 리프로그래밍을 통해 TS 개인의 피부 섬유아세포로부터4 . 우리 실험실의 주요 초점은 발달 실패를 이해하는 것입니다 때문에, 우리는 POC에서 TS iPSC, 특히 자발적인 낙태8의chorionic villi 구성 요소를 생성했습니다. 이 태아 조직으로부터 분리된 모든 세포는 45XO karyotype을 가지고 있었고 동일한 karyotype을 가진 iPSC를 산출했습니다. 이 iPSC는 중단된 태아에게서 생성되는 첫번째이고 aneuploidy 관련 임신 실패를 공부하기 위하여 귀중한 자원을 제공하기 때문에 독특합니다. 이 문서에서는 episomal 리프로그래밍을 통해 이 고유한 세포 소스에서 iPSC 생성에 대한 자세한 방법론을 제공합니다.

iPSC 생성의 초기 방법은 재프로그래밍 요인을 전달하기 위하여 바이러스성 전달 및 transposons를 이용했습니다. 세포를 자발성으로 유도하는 방법은 레트로바이러스 벡터9,절제가능한 렌티바이러스벡터(10,11) 및 트랜스포손계법(12)을 비통합 아데노바이러스벡터(13) 및 센다이 바이러스 기반벡터(14)를통합하는 것으로 진화하였다. 레트로 바이러스 및 렌즈 바이러스 기반 재프로그래밍, 비록 효율적이지만, 호스트 염색체에 재프로그래밍 요인의 통합을 포함, iPSCs에 예기치 않은 효과가 삽입 돌연변이를 일으키는. 또한 바이러스 기반 리프로그래밍은 iPSC의 번역 적용을 방지합니다. RNA 기반시스템(15) 및 직접 단백질전달(16)은 바이러스 및 DNA 트랜스펙트 사용과 관련된 잠재적 위험을 완전히 제거하기 위해 탐구되었다. 그러나 이러한 방법은 비효율적이는 것으로 입증되었습니다.

2011년, Okita 외.는 shRNA를 통해 TP53 억제로 증강된 상피 플라스미드에 의한 재프로그래밍효율을 향상시켰다. 그(것)들은 또한 hiPSCs의 안전을 강화하기 위하여 비 변환 LMYC (소세포 폐 암 과 관련된 MYC)로 cMYC를 대체했습니다. 이러한 상피 플라스미드는 5개의 리프로그래밍 인자를 표현합니다: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC 및 shRNA 용 TP5317,18. 이러한 벡터는 연속 배양 시 재프로그래밍된 세포로부터 염색체를 유지하고 손실되므로 10-15개의 항로 내에서 선이 변형되지 않습니다. 핵포션은 숙주 세포의 핵으로 직접 핵산을 전달하는 전문화된 형태의 전기기화이다. 다양한 세포 유형으로 플라스미드를 재프로그래밍하는 효율적인 방법입니다. 상피 플라스미드는 비용 효율적이며 핵포페션의 높은 비용을 보상한다. 이 방법은 다양한 체세포에서 안정적인 iPSC를 산출하는 최적화된 조건하에서 효율적이고 재현가능합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 episomal 재프로그래밍 plasmids의 핵에 의해 태아 조직에서 분리된 섬유아세포에서 iPSCs의 생성을 위한 방법을 기술합니다. 여기에 태아 융모 성 빌리에서 섬유 아세포 절연에 대한 상세한 프로토콜입니다, 플라스미드 정제, 핵, 리프로그래밍 플레이트에서 식민지의 따기 및 안정적인 iPSC의 설립.

새로 생성된 iPSC에서 흉부 특성의 존재를 확인하는 것이 필수적입니다. 여기에는 흉부 관련 요인의 데모가 포함됩니다(예: 알칼리성 인산염 발현, 나노G, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; 일반적으로 면역 불피성 또는 유전자 발현 분석으로 표시), 체외 분화 분석에 의한 3개의 세균 층식별, 염색체 함량을 확인하기 위한 카르요티핑, 염색체 의 특징, 특성화, 신장증의 피성, 신장증 의 식별 그리고 테라종 형성 및 테트라클로이드 보완과 같은 생체 내 소세포가 더욱 엄격합니다. 여기서는 카요타이핑, 살아있는 세포 알칼리인포스파아제 염색, 면역형광에 의한 pluripotency 관련 바이오마커의 검출, 외인성 유전자의 손실을 입증하는 체외 분화분석 및 방법을 설명한다.

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프로토콜

FCV는 매니팔 병원 승인의 윤리위원회에 따라, 벵갈루루 매니팔 병원에서 얻은.

참고: 모든 버퍼 및 솔루션의 구성에 대한 표 1을 참조하십시오.

1. 태아 초장 빌리에서 섬유 아세포의 격리 (FCV)

  1. 콜라게나제의 샘플 수집 및 조직 붕괴
    1. 인산염 완충식염(PBS)의 멸균 조건하에서 FCV를 수집하고(실온에서) 세포 배양 시설로 이송한다.
    2. 빌리를 60mm 페트리 접시로 옮기고 1x 항생제 항진성 용액(PBS-AA)을 포함하는 PBS에서 여러 번(최소 4회)을 세척합니다. 파이펫팅으로 PBS-AA를 완전히 제거합니다.
    3. 37°C에서 5분 동안 1mL 콜라게나아제 블렌드(5 mg/mL)로 초리오닉 빌리를 치료합니다.
    4. 10% 태아소 혈청(FBS)을 함유한 세포 배양 배지로 중화하고, 15mL 튜브및 원심분리기로 소화를 5분 동안 225 x g로 이송하여 붕괴된 빌리와 방출된 세포를 펠릿으로 수집한다.
  2. 하위 문화 및 재고 확장
    1. 플레이트는 완전한 배지(예를 들어, 암니오맥스)의 5mL를 포함하는 T25 배양 플라스크에서 방출된 세포와 함께 멸망을 분해하고 컨리치 섬유아세포 배양까지 성장한다.
    2. 다음과 같이 후속 형질 및 특성화 실험에서 사용하기 위해 주식을 준비하기 위해 배양에서 섬유 아세포를 확장하십시오.
      1. FCV 섬유아세포를 함유한 T25 플라스크에 0.05% 트립신 2mL을 넣고 3-5분 동안 37°C에서 배양하여 세포를 해리한다.
      2. 인큐베이션 후, FBS를 추가하여 트립신을 중화시다(트립신과 동일한 볼륨).
        참고: FBS를 포함하는 배양 매체는 1:3 트립신: 미디어 비율에 추가될 때 트립신을 중화시키는 데도 사용할 수 있습니다.
      3. 세포 펠릿을 얻기 위해 5 분 동안 225 x g에서 15 mL 튜브 및 원심 분리기에서 해리 된 세포를 수집합니다.
      4. 완전한 매체의 1 mL에서 셀 펠릿을 열수 및 재중단.
      5. 각 500 μL에서 60mm 의 조직 배양 처리 접시를 옮기고 부피를 5mL로 구성합니다. 이 분할 비율 1:2, 또한 후속 구절에 사용 되었다.
  3. 냉동 보존
    1. 단계 1.2.2.1 - 1.2.2.3 단계에 설명된 바와 같이 0.05% 트립신을 사용하여 효소 해리를 수행하고 세포 펠릿을 얻습니다.
    2. 1:9 디메틸 설산화물(DMSO): FBS로 구성된 1mL의 동결 혼합물에서 상체를 버리고 세포 펠릿을 재연한다.
    3. 내용물들을 멸균 극저온으로 옮기고 유리병을 냉동 용기에 놓습니다.
    4. 하룻밤 동안 동결 -80 °C 다음 액체 질소 (-196 °C)로 바이알을 전송 다음 날.

2. 플라스미드 DNA 격리 및 검증

  1. 세균 세포 준비
    1. 별도의 루리아 베르타니-암피실린 아가르 플레이트에 3개의 개별 플라스미드 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL(Addgene 에서)를 포함하는 대장균의 줄무늬 글리세롤 주식.
    2. 루리아 베르타니-암피실린 배지의 5mL의 선발 배양에 단일 콜로니를 접종. 37°C에서 8시간 동안 흔들어 서 있는 큐베이트(10 x g).
    3. 루리아 베르타니-암피실린 배지의 100mL로 이 스타터 배양의 200 μL을 접종한다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 흔들어 보시합니다.
    4. 4°C에서 15분 동안 6000 x g에서 원심분리하여 밤새 세균 배양을 수확하십시오.
  2. 미디 플라스미드 정화 키트를 곁들인 플라스미드 절연
    1. 4 mL 재서스펜션 버퍼에서 세균 펠릿을 다시 중단합니다.
    2. 용해 버퍼 4mL을 넣고 4-6번 적극적으로 반전하여 철저히 섞어 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 4mL의 미리 냉각된 중화 버퍼를 추가하고 튜브를 4-6번 뒤집어 철저히 섞습니다. 15분 동안 얼음에 배양합니다.
    4. 4°C에서 30분 동안 ≥20,000 x g의 원심분리기. 신선한 튜브에 상체를 수집하고 4 °C에서 15 분 동안 ≥20,000 x g에서 다시 원심 분리기를 수집합니다.
    5. 평형 버퍼 4mL을 적용하여 열을 상화합니다.
    6. 상부체를 열에 적용합니다.
    7. 10mL의 워시 버퍼로 컬럼을 두 번 씻으시다.
    8. 따뜻한 (65 °C) 용출 버퍼의 5 mL와 엘ute DNA.
    9. 용출된 DNA에 이소프로판올 3.5 mL을 추가하여 DNA를 침전시합니다. 잘 섞으세요. 원심분리기는 4°C에서 30분 동안 ≥15,000 x g의 원심분리기. 신중하게 상수.
    10. DNA 펠릿을 70% 에탄올과 원심분리기의 2mL로 10분 동안 ≥15,000 x g로 세척합니다. 신중하게 상수.
    11. 공기 건조 펠릿5-10 분 동안 DNA를 PCR 급 물의 적당한 부피에 용해하여 1 μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
      참고: 전기화에 적합하지 않기 때문에 완충제에 DNA를 용해시키지 마십시오. 오래된 플라스미드 DNA 제제는 재프로그래밍된 식민지를 산출하지 않습니다.
  3. 에코리 제한 소화에 의한 플라스미드 검증
    1. 뉴클레아제없는 물 15 μL, 10 x 버퍼의 2 μL, 플라스미드 DNA 1 μg 및 EcoRI 효소 1 μL을 결합합니다. 부드럽게 섞습니다.
    2. 열 블록에서 15 분 동안 37 °C에서 혼합물을 배양합니다.
    3. 소화된 플라스미드 샘플을 6x DNA 젤 로딩 염료및 전기파로 1% 아가로즈 젤에 1x TAE 버퍼에 에티듐 브로마이드0.5 μg/mL를 혼합합니다. 표준 DNA 사다리를 포함합니다. DNA가 적절하게 해결된 후 젤을 이미지합니다. 예상 에코리 밴드 크기 pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F는 6,834 bp, 3,758 bp 및 1,108 bp; pCXLE-hUL은 10,200 bp 및 1,900 bp; pCXLE-hSK는 10,200 bp 및 2,500 bp입니다.

3. 핵흡입

  1. 셀 펠릿링
    1. T25의 분리된 태아 융악섬유아세포가 80-90%의 합류까지 완전한 배지의 5mL에서 플라스크를 배양한다.
    2. PBS로 셀을 두 번 세척하고 1.2.2.1 단계 - 1.2.2.3 단계에 설명된 대로 트립시니즈합니다.
    3. 상체를 제거하고, 펠릿을 5mL의 감소된 혈청 미디어(예: Opti-MEM)에서 재연한다. 혈류계를 가진 세포를 계산하고 핵을 위한 106 세포를 취하십시오. 원심 분리기 225 x g 5 분 동안. 상복부를 완전히 제거합니다.
  2. 시약 제제 및 핵흡입
    1. 뉴클레오시터 시약을 0.5mL의 보충제와 2.25mL의 뉴클레오용액을 혼합하여 준비한다(둘 다 키트에 제공).
    2. 1.5mL 튜브에 핵헥터 용액 100 μL을 추가합니다. 각 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL을 튜브에 1μg 추가합니다. 이 혼합물에서 106 셀 (3.1.2 단계에서)을 부드럽게 다시 중단합니다.
    3. 세포 DNA 현탁액을 큐벳으로 옮기면 시료가 기포 없이 큐벳(키트에 제공)의 바닥을 덮도록 합니다. 큐벳을 캡하고 홀더에 삽입합니다. 뉴클레오펙터 프로그램 U-23(고효율)를 선택하고 적용한다.
    4. 홀더에서 큐벳을 제거하고 완전한 미디어의 1mL을 추가합니다. 내용물의 60mm 조직 배양으로 부드럽게 전달하여 4mL의 완전한 미디어로 채워진 페트리 접시(총 5mL의 미디어)로 전달합니다. 37°C에서 가습된 CO2 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
    5. 24시간 이후에는 세포가 부착되어 있는지 확인합니다. 매체를 완전히 교체합니다.
      참고: 세포 사멸의 비율은 부착하는 몇몇 실행 가능한 세포를 떠나는 핵혈에 있는 높습니다.
    6. 10 일 동안 완전한 매체에서 세포를 유지하고 다음 20 일 동안 흉부 매체로 이동합니다.
      참고: 세포가 정기적으로 시각화하여 재프로그래밍 세포(예: 상피 형태학 및 소형 식민지 형성)에서 발생하는 형태학적 변화를 따라 실험이 작동하는지 확인합니다. 약 25 iPSC 식민지 는 pluripotency 미디어에서 문화의 20 일 후에 볼 수 있습니다.

4. iPSC 식민지의 따기 와 전파

  1. 리프로그래밍 플레이트에서 콜로니 따기
    1. 당겨진 유리 파이펫 또는 1mL 주사기 바늘을 사용하여 재프로그래밍 접시에 형성된 배아 줄기 세포와 같은 식민지를 수동으로 해부하고 pluripotency 배지를 가진 불활성화 된 마우스 배아 섬유 아세포 피더로 이전에 준비 된 접시로 옮기거나 mTESR 배지로 Matrigel 코팅 플레이트에 피더 무료 배양을 확립합니다.
      참고: 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)는 마우스 배아로부터 효소적 절연(13-14일 임신한 여성 마우스에서 해부)을 사용하여 파생되었으며 미토마이신 C 치료에 의해 미토미신 C 치료에 의해 미토티컬하게 비활성화되었다. 단일 클론 인구를 분리 접시또는 혼합 클론 인구로 다시 프로그래밍하는 접시에서 단일 식민지를 재배하여 단일 복제 플레이트에서 단일 접시로 많은 식민지를 이전하여 설정합니다.
  2. 새로운 식민지를 신선한 피더로 기계적 전송하고 안정적인 iPSC를 확립하기 위해 패딩
    1. iPSC를 2일마다 먹이로 흉내내에 전파하고 5-7일마다 1:3을 분할합니다. 9:1 비율로 녹아웃 세럼 교체및 DMSO의 동결 혼합에서 냉동 보존에 의해 주식을 준비합니다.
      참고: KnockOut 혈청 교체는 FBS의 성분으로서 FBS 대신 iPSC의 냉동 보존을 위해 장기간 보존하는 동안 다능성 세포의 분화를 유도할 수 있다.

5. iPSC의 특성화

참고: 자공성 바이오마커를 위한 PCR 및 면역스테인딩을 포함한 특성화 연구는 다섯 번째 통과 번호 후에 수행되었다. Karyotyping은 나중에 통과 번호로 수행되었습니다.

  1. 카요타이핑
    1. 37°C에서 가습된 CO2 인큐베이터에서 45분 동안 대장균과 iPSC의 60mm 페트리 접시를 치료합니다.
    2. 0.05% 트립신 치료 및 원심분리기를 수확하십시오. 셀 펠릿을 풀어 주는 매체의 남은 흔적을 상체및 피펫을 제거합니다.
    3. 저혈압 솔루션 5mL를 추가합니다. 튜브를 반전시켜 37°C에서 20분간 배양합니다. 원심 분리기 225 x g 5 분 동안.
      참고: 얻은 펠릿은 푹신푹신한 것처럼 보입니다.
    4. 펠릿을 풀기 위해 두드리는 동안 Carnoy의 고정 솔루션 2.5mL을 천천히 추가합니다.
    5. 깨끗한 유리 슬라이드에 셀 서스펜션을 떨어뜨려 카요티핑을 위한 스프레드를 준비합니다.
    6. 슬라이드를 0.15% 트립신으로 1분간 치료하고 PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 Giemsa 용액으로 4 분 동안 얼룩지고 증류 수분 세척으로 끝납니다. 적절한 소프트웨어로 획득하고 처리합니다.
  2. 유전자 없는 상태 의 데모
    1. 유전체 DNA 격리
      1. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브의 바닥으로 프로테아제의 파이펫 20 μL.
      2. PBS에서 재중단된 TSiPSC 200 μL을 마이크로센트리립후지 튜브에 추가합니다.
      3. 200 μL의 버퍼 AL을 샘플에 넣고 펄스 소용돌이로 15초 동안 섞습니다.
      4. 56 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
      5. 미세 원심 분리기 튜브를 간략하게 원심분리하여 뚜껑 안쪽에서 방울을 제거합니다.
      6. 샘플에 200 μL(96-100%)을 추가하고 펄스 소용돌이로 15초 동안 다시 섞습니다. 혼합 후 튜브를 잠시 원심분리하여 뚜껑 안쪽에서 방울을 제거합니다.
      7. 림을 적시지 않고 이전 단계의 혼합물을 미니 스핀 컬럼(2mL 수집 튜브)에 조심스럽게 적용합니다. 캡을 닫고 원심분리기를 6000 x g에서 1분 간 닫습니다. 여과가 들어 있는 튜브를 버리고 미니 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 놓습니다.
      8. 미니 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 림을 적시지 않고 버퍼 AW1의 500 μL을 추가합니다. 캡과 원심분리기를 6000 x g에서 1분 간 닫습니다. 미니 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 컬렉션 튜브에 놓고 여과가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다.
      9. 조심스럽게 미니 스핀 컬럼을 열고 림을 적시지 않고 버퍼 AW2의 500 μL을 추가합니다. 캡과 원심분리기를 최고 속도(20,000 x g)로 3분 간 닫습니다.
      10. 새로운 2mL 컬렉션 튜브에 미니 스핀 컬럼을 놓고 여과로 이전 컬렉션 튜브를 폐기하십시오. 1분 동안 최고 속도로 원심분리기로 버퍼 AW2 이월 가능성을 제거합니다.
      11. 미니 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 놓고 여과가 함유된 수집 튜브를 폐기합니다. 미니 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 200 μL 버퍼 AE 또는 증류수를 추가합니다. 실온(15-25°C)에서 5분 동안 배양한 다음 원심분리기는 6000 x g에서 1분 동안 배양합니다.
    2. 트랜스진 프리 상태 PCR(KAPA 하이파이 PCR 키트 KR0368 사용)
      1. 모든 시약이 제대로 해동되고 혼합되어 있는지 확인합니다.
      2. 표 2(얼음에 반응 설정)를 기반으로 모든 반응 성분의 적절한 부피를 포함하는 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
      3. PCR 마스터 믹스, 템플릿 및 프라이머의 적절한 볼륨을 개별 PCR 튜브로 전송합니다.
      4. 개별 반응, 혼합 및 원심분리기를 간단히 캡합니다.
      5. 표 3다음에 PCR을 수행합니다.
  3. Pluripotency 바이오 마커 식별
    1. 알칼리성 인산염 (AP) 염색
      1. 문화 영역의 10cm2에 대해 1.5mL DMEM/F-12에 500x 스톡 솔루션 3μL을 희석하여 1배 AP 라이브 스테인 작업 솔루션을 준비합니다.
      2. iPSC 문화 접시에서 배지를 제거합니다. DMEM/F-12로 한 번 세척합니다. iPSC에 1x AP 라이브 얼룩 솔루션을 추가합니다. 37°C에서 45분 동안 배양합니다.
      3. AP 얼룩을 제거하고 DMEM / F-12로 두 번 세척하십시오. 염색 30-90분 이내에 표준 FITC 필터를 사용하여 신선한 DMEM/F-12 및 형광 현미경으로 이미지를 추가합니다.
    2. 자공성 바이오마커용 면역염색
      1. 4 °C에서 하룻밤 4 % 파라 포름알데히드로 confluent iPSC 문화를 수정합니다. PBS Tween 20 (PBST)로 세 번 씻고, 각 세척은 5 분 동안 씻습니다.
      2. PBST에서 0.3% 트리톤 X-100으로 세포를 실온에서 15분 동안 과음시 처리합니다. PBST로 세 번 씻으세요.
        참고: 과다성화는 세포내 항원만 을 위해 서술되어야 합니다.
      3. PBST에서 3% 소 세럼 알부민(BSA)을 실온에서 30분 동안 차단합니다. 1 차적인 항체를 가진 세포를 얼룩 (1% BSA에서 1:1000 희석) 하룻밤. 1 차적인 항체 잠복후, PBST로 세 번 씻으세요.
      4. 이차 항체를 가진 세포를 배양 (1% BSA에서 1:1000 희석) 실온에서 5 시간. PBST로 세 번 씻으세요.
      5. 핵을 0.5 μg/mL 4',6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)으로 1분간 라벨을 부착합니다. PBST로 한 번 셀을 씻으시면 됩니다.
      6. 형광 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

6.체외 분화 에세이

  1. 배아 바디 (EB) 분화
    1. iPSC 식민지를 작은 조각으로 자르고, 배아 체형 매체에서 낮은 애착 페트리 접시에 수집하고 접시를 넣습니다. 3일마다 배지를 교체하여 세포를 15일 동안 키워보실 수 있습니다.
      참고: 15EB는 3개의 세균층 바이오마커의 검출을 위해 직접 사용될 수 있다. 대안적으로, 특정 세포 혈통은 바이오마커 검출에 선행된 성장 인자를 통해 유도될 수 있다.
  2. 엔도름(헤파토세포) 분화
    1. 단층 배양에서 iPSC를 자랄 수 있습니다.
    2. 일단 컨서블, RPMI 1640 미디어로 이동 1 x 인슐린 전송린 셀레니트와 100 ng/mL 활성 A 2 일 동안, RPMI에서 성장 하는 데 이어 1640 30 ng/mL bFGF와 20 ng/mL BMP4 9 일 동안. 2일마다 배지를 교체합니다.
    3. 10일부터 0.1 μM 덱사메타손으로 미디어를 보충합니다. 20일째에 실험을 종료합니다.
  3. 중구(심근세포) 분화
    1. 배아 체배지에서 0.5% 화장코팅플레이트에 8EBs를 플레이트. EB가 부착하고 축소되도록 허용합니다.
    2. 20 ng/mL BMP4로 미디어를 보충하고 20 일 동안 성장합니다. 매 2-3 일마다 매체를 교체하십시오. 20일째에 실험을 종료합니다.
  4. 이토더름 (신경) 분화
    1. 플레이트 일 4 EB에 2 μg/cm2 콜라겐 타입 IV 코팅 플레이트 배아 체질량. EB가 부착하고 축소되도록 허용합니다.
    2. 다음날, 2mg/mL 포도당, 1x 인슐린 전달자 셀레니트, 및 2.5μg/mL fibronectin와 DMEM F-12로 배지를 이동합니다. 15일째에 실험을 종료합니다.
  5. 대뇌 오르간노이드 의 형성
    1. 70-80 %의 컨할 때까지 MEFs에 35mm 조직 배양 접시에 TSiPSCs를 성장. 식민지를 잘라 15 mL 튜브에서 수집합니다. 5 분 동안 225 x g에서 세포를 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
    2. PBS와 원심분리기의 2mL에서 재연하여 초퍼를 제거하여 식민지 조각을 씻으시다.
    3. 0.05% 트립신1mL을 추가하고 튜브를 눌러 세포를 빼냅니다. 37°C에서 3-4분 동안 튜브를 배양하여 콜로니 조각을 단일 세포 현탁액으로 분리합니다.
    4. 10 μg/mL 로 관련 단백질 키나아제(ROCK) 억제제 Y-27632 디하이드로클로리드(ROCKi)를 함유한 단발성 매체4mL로 희석하여 트립신을 중화시켜 세포 사멸을 유발한다.
    5. 원심 분리기는 펠릿을 얻을 수 있습니다. 10 μg/mL ROCKi를 포함하는 2mL 배아 체 배지에서 수퍼네티드를 버리고 세포를 재연한다.
    6. 세포 계수에 대한 세포 현탁액 10 μL을 제거합니다. 트라이판 블루 10 μL을 추가하여 죽은 세포를 감지합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.
    7. 150 μL 당 9,000 개의 살아있는 세포를 얻기 위해 세포 현탁액에 ROCKi를 사용하여 적절한 양의 배아 신체 배지를 추가하십시오.
    8. 플레이트 150 μL은 37°C에서 가습된 CO2 인큐베이터에서 낮은 부착 96웰 플레이트의 각 우물에서 배양하고 배양한다. 24시간 후에 접시를 집계할 수 있는지 확인합니다. 2일째에 배지를 부드럽게 제거하고 ROCKi없이 신선한 배아 매체로 대체하십시오.
    9. 6일째에는 DMEM-F12로 구성된 500μL의 신경 유도 매체를 함유한 저부착24웰 플레이트의 웰플레이트로 EB를 1% N2 보충제, 2mM 글루타맥스 보충제, 1mM 비필수 아미노산 및 1 μg/mL 헤파린으로 이송한다. 매 2일마다 배지를 변경합니다.
    10. 신경 유도 배지에서 5일 후 200 μL 팁의 빈 팁 트레이 위에 2cm x 2cm 파라필름 사각형을 겹쳐서 Matrigel의 신경상피성 골재를 포함하였다. 팁 트레이의 각 구멍에 장갑을 낀 손가락으로 파라필름을 눌러 작은 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 멸균하기 위해 70% 에탄올로 파라막을 청소하십시오.
    11. 파라필름 광장을 60mm 접시로 옮킨다. 200 μL 팁을 잘라 내어 신경상피성 골재를 파라필름의 움푹 들어간 곳까지 전달합니다. 파이펫팅으로 초과 매체를 제거합니다.
    12. 신경 미온 골재에 해동된 마트리겔 30 μL을 추가하고 파이펫 팁을 사용하여 트리겔의 중앙에 골재를 배치합니다. 60mm 접시를 37°C 인큐베이터에 20-30분 동안 배치하여 교합을 한다.
    13. 1:1 DMEM-F12로 구성된 대뇌 오르가노이드 분화 배지 5mL 추가: 신경물질 배지, 0.5% N2 보충제, 인슐린 2.5 μg/mL, 2mM 글루타맥스 보충제, 0.5mMNEAA, 1% B27 보충제 및 페니실린-streptocin의 2.5mL.
    14. 멸균 집게를 사용하여 파라필름 시트를 뒤집어 서 마트리겔 임베디드 골재가 시트에서 매체로 떨어질 때까지 접시를 교반합니다. 가습 된 CO2 인큐베이터에서 4 일 동안 미디어 변경을 제공하는 내장 된 골재를 37 °C에서 성장하십시오.
    15. 정적 문화의 4 일 후 50 rpm에서 흔들리는 인큐베이터 내부에 설치된 궤도 셰이커에 60mm 접시를 배치합니다. 3 개월 동안 오르가노이드를 문화하여 3 일마다 대뇌 오르가노이드 분화 매체로 완전한 미디어 변화를 제공합니다.

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결과

45XO 카요타입을 가진 자발적으로 낙태된 태아로부터 통합없는 iPSC의 생성
우리는 터너 증후군 (TS) 특정 45XO karyotype와 FCV에서 섬유 아세포를 분리하고 뉴클레오폰은 증후군의 하류 모델링에 사용할 수있는 TSiPSCs를 생성하기 위해 episomal 재프로그래밍 플라스미드로 그들을 감염, 특히 관련 신경 적자(도 1a& b). 우리는 형질 전환 실험(도 1 c&d)에대한 비통합 형피 벡터 및 핵을 사용했다. 우리는 재프로그래밍의 성공을 모니터링하기 위해 세포의 형태학적 변화를 따랐습니다. 섬유아세포에서 상피 형태로의 전환이 관찰되었고, 그 다음에는 명분이 있는 소형 식민지 형성이 관찰되었다(도2a). TSiPSCs는 뚜렷한 가장자리를 가진 ...

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토론

세포유전학적으로 비정상적인 태아 조직의 안정적인 세포 모델의 생성은 결함이 있는 표현형을 영속시키기 위해 필요하다. iPSC 경로는 결함이 있는특성(20)의영구 보존을 위한 세포 제제의 가장 효과적인 방법입니다.

다능성 줄기 세포(PSC)는 초기 분열배아(21)를연상시키는 특수 세포로 자가 재생 및 분화의 특성을 표시한다. 따라서, PSC는 조기에 중단된 태아에 있는 초기 분자, 세포 및 발달 결함을 연구하기 위하여 우수한 모형으로 봉사할 수 있습니다.

이 문서에서우리는 개선 된 상피 벡터와 결합 된 핵을 사용하여 인간 iPSC 생성을 설명했다. 결과는 이 조합이 단일 트랜스포메이션이 성공적인 재프로그래밍에 충분했다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 통합없는 인간 iPSC 라인을 생성하는 강력한 방법을 포함한다는 것을 보여줍니다. 우리는 FCV 섬...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

위의 연구에 대한 재정 지원은 고등 교육의 매니팔 아카데미에 의해 제공되었다. 라인의 특성화는 NCBS에서 M.M. 패닉커의 실험실에서 부분적으로 수행되었다. 우리는 카요타이핑에 대한 도움을 아난드 진단 연구소에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.15% 트립신Thermo Fisher Scientific27250018G 밴딩
2-메르캅토에탄올Thermo Fisher Scientific21985023다능성 및 배아체 매체
4', 6 디아미디노-2-페닐린돌시그마 알드리치D8417면역세포화학
활성 A시그마 알드리치SRP3003분화 분석
알칼리성 인산가수분해효소 생염색Thermo Fisher ScientificA14353AP 염색
AMAXA Nucleofector II
AmnioMAX II 완전 배지Thermo Fisher Scientific, Gibco11269016배지 태아 융모막 융모 세포 배양 특이적
AmpicillinHiMediaTC021플라스미드 정제
안티 마우스 IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059면역세포화학
항토끼 IgG(H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA11034면역세포화학
, 항토끼 IgG(H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA11035면역세포화학
항생제-항진균제,Thermo Fisher Scientific, Gibco15240096오염 제어
Anti-E-CadherinBD Biosciences610181Immunocytochemistry
Anti-NanogBD Biosciences560109Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4BD Biosciences611202Immunocytochemistry
Anti-SOX17BD Biosciences561590Immunocytochemistry
Anti-SOX2BD Biosciences561469Immunocytochemistry
Anti-SSEA4BD Biosciences560073Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81MilliporeMAB4381Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]Sigma AldrichF0291Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4Sigma AldrichSRP3016Differentiation assays
Bovine 혈청 알부민Sigma AldrichA3059차단
콜라겐 Human Type IVBD Biosciences354245분화 분석
콜라겐 분해 효소 블렌드Sigma AldrichC8051태아 융모 융모
DexamethasoneSigma AldrichD4902분화 분석
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033분화 분석
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274제한 분해
FibronectinSigma AldrichF2518분화 분석
Giemsa StainHiMediaS011G Banding
빙하 아세트산HiMediaAS001핵형 분석을 위한 고정제
GlucoseSigma AldrichG7528분화 분석
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061다능성 및 배아체 매체
헤파린 나트륨시그마 알드리치H3149분화 분석
인슐린 용액 인간시그마 알드리치I9278분화 분석
인슐린 트랜스페린 셀레나이트시그마 알드리치I1884분화 분석,
KAPA HiFi PCR 키트Kapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR,
KaryoMAX, ColcemidThermo Fisher Scientific핵형 분석을 위한 15210040 유사분열 정지
KnockOut, DMEM, Thermo Fisher Scientific10829018다능성 및 배아체 매체
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028다능성 및 배아체 매체
Luria Bertani 한천HiMediaM1151F플라스미드 정제
MatrigelBD Biosciences356234분화 분석
MEM 비필수 아미노산Thermo Fisher Scientific11140035다능성 및 배아체 매체
MethanolHiMediaMB113핵형 분석
Myosin 심실 중쇄 &알파;/βMilliporeMAB1552면역세포화학
NHDF 핵세포 키트LonzaVAPD-1001핵펙션
파라포름알데히드(PFA)Sigma AldrichP6148고정 세포
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-FAddgene27077Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSKAddgene27078Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hULAddgene27080Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin  써모 피셔 사이언티픽,  15070063다능성 및 배아 본체 매체
팔로이딘-테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이시그마 알드리치P1951면역세포화학
인산염 완충 식염수시그마 알드리치P44171 X PBS 200mL의 탈이온수에 용해되고 오토클레이브로 살균된 PBS 1정
저장: 실온.
PBST- 0.05% 트윈 20 in 1X PBS.
저장: 실내 온도.
플라스미드 정제 키트- Midi prepQIAGEN12143플라스미드 정제
염화칼륨 용액HiMediaMB043핵형 분석을 위한 고도 용액
QIAamp DNA 혈액 키트Qiagen51104게놈 DNA 분리
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093분화 매체
구연산나트륨HiMediaRM255Hypotonic 솔루션
Triton X-100HiMediaMB031투과화
트립신-EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Subculture of   태아 융모막 융모 섬유아세포
Tween 20HiMediaMB067PBST
&beta의 준비; III 튜불린시그마 알드리치T8578면역세포화학
Y-27632 디하이드로클로라이드시그마 알드리치Y0503분화 분석
Lonza-Nucleofection , , , , , , , , , , , , , 트 세포 핵형 분석을 위한

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