알츠하이머병의 신경병리학에서 가장 중요한 특징 중 하나는 아밀로이드β의 침착입니다. 이 프로토콜에서는 플라크에서 아밀로이드β 축적을 검출하기 위해 5×FAD 형질전환 마우스에서 면역형광성 염색 방법을 설명합니다. 관류, 동결 절편, 염색 및 정량화 과정이 자세히 설명됩니다.
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방법 논문
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알츠하이머병의 신경병리학에서 가장 중요한 특징 중 하나는 아밀로이드β의 침착입니다. 이 프로토콜에서는 플라크에서 아밀로이드β 축적을 검출하기 위해 5×FAD 형질전환 마우스에서 면역형광성 염색 방법을 설명합니다. 관류, 동결 절편, 염색 및 정량화 과정이 자세히 설명됩니다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 전 세계 치매의 60-70%를 차지하는 신경퇴행성 질환입니다. 알츠하이머병의 특징 중 하나는 의심할 여지 없이 뇌에 아밀로이드β(Aβ)이 축적되는 것입니다. Aβ는 β-세크레타제와 γ-세크레타제에 의한 베타-아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 단백질 분해 절단에서 생성됩니다. 병리학적 상황에서 APP의 β 분열 증가는 Aβ의 과잉 생산으로 이어지며, 이는 Aβ 플라크로 응집됩니다. Aβ 플라크는 AD 병리학의 특징이기 때문에 Aβ의 양을 검출하는 것은 AD 연구에서 매우 중요합니다. 이 프로토콜에서는 Aβ 침착을 시각화하기 위해 면역형광 염색 방법을 소개합니다. 실험에 사용된 마우스 모델은 5×FAD로, 인간 가족성 알츠하이머병에서 발견되는 5개의 돌연변이를 가지고 있습니다. 5xFAD 마우스의 신경병리학적 및 행동적 결함은 잘 문서화되어 있어 Aβ 병리학을 연구하기에 좋은 동물 모델입니다. 5×FAD 마우스에서 Aβ 축적을 검출하기 위한 경심 관류, 동결 절편, 면역형광 염색 및 정량화를 포함한 절차를 소개합니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 AD 마우스 모델에서 Aβ 병리학을 조사할 수 있습니다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 전 세계적으로 60%-70%의 치매를 유발하는 신경퇴행성 질환으로, 많은 사회적 자원이 소모됩니다1. 아밀로이드β(Aβ)의 축적이 알츠하이머병의 병리학적 특징이라는 것은 잘 알려진 사실입니다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 많은 조직에 존재하는 일체형 막 단백질입니다. 36-42개의 아미노산2로 구성된 Aβ 펩타이드는 APP 3,4에서 β--및 γ-세크레타제의 후속 절단에 의해 생성됩니다. APP 분열의 변화와 APP 유전자의 돌연변이는 Aβ의 과잉 생산으로 이어집니다. Aβ 분자는 응집하여 올리고머 또는 피브릴을 형성할 수 있으며, 이는 신경독성이 있는 것으로 여겨집니다 5,6. 이전 연구에서 Aβ의 축적은 AD 7,8,9
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모든 실험 절차는 쉬저우 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 중국 정부 규정의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 마우스의 관류
참고: 관류 절차에 대한 자세한 내용은 Wiliam Shain의 실험실 11의 비디오를 참조하십시오.
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우리는 위에서 설명한 면역형광 염색 절차를 사용하여 다른 연령의 5×FAD 마우스에서 Aβ 축적의 침착을 조사했습니다. 그림 3 은 프로토콜을 사용한 일반적인 결과와 최적이 아닌 결과를 나타냅니다. 5개월 및 8개월 이형접합 5×FAD 형질전환 마우스와 4개월 6개월 야생형 대조군의 뇌 절편을 6E10 항체로 염색하고 형광 현미경으로 검출했습니다. 그림 3A 는 쥐 뇌의 시상절(sagittal section)에 있는 플라크(plaque)에 Aβ가 축적된 것을 보여줍니다. 이들은 주로 피질과 해마에 축적되며, 해마의 하부에서 밀도가 가장 높으며, 이는 이전 연구10과 일치한다. 이미지에서 볼 수 있듯이 Aβ 축적은 5×FAD 마우스의 항체에 의해 명확하게 감지되었습니다. 적분 밀도(적분 밀도 = 면적 × 평균. 통합 밀도: 이 영역의 형광 강도의 합; 평균: 특정 영역의 평균 형광 .......
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6E10 항체를 이용한 면역형광 염색은 뇌의 Aβ 축적을 특이적으로 검출할 수 있으며, 이는 Image J로 쉽게 정량화할 수 있습니다. 주목할 가치가 있는 것은 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 결과에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다.
그림 3C에 표시된 슬라이스가 벗겨지거나 파손되는 것을 방지하려면 몇 가지 핵심 사항에 유의해야 합니다. 횡격막을 절개한 후 관류는 저산소증으로 인한 돌이킬 수 없는 병태생리학적 영향 때문에 빠르게 진행되어야 합니다. 이러한 효과는 결과에 지대한 영향을 미칠 수 있다11. 뇌 조직은 냉동 절편 전에 적절하게 고정되고 탈수되어야 합니다. 저온 유지 장치(챔버 -21 °C, 시편 헤드 -19 °C)의 온도를 적절하게 설정하고 절단 날과 안티 롤 플레이트의 상황을 확인해야 합니다. 절단 날이나.......
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이 연구는 중국 자연과학재단의 일반 프로젝트(보조금 번호: 81974157), 장쑤성 교육부의 장쑤성 특별 임명 교수직(C.L.), 장쑤성 혁신 및 기업가 팀 프로그램(H.Z., A. L., W.W., C.L. 및 Y.S.), 우수한 인재 시작 보조금(D2019025) 및 혁신 및 기업가 정신 교육 프로그램(201910313038Z to Z.S., Y.X., M.Z. 및 J.D.) 쉬저우 의과대학에서. 이 연구는 또한 National Demonstration Center for Experimental Basic Medical Science Education(Xuzhou Medical University)의 지원을 받았습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anesthetia | |||
| Injection syringe | KLMEDICAL | 1 | |
| mL 펜토바르비투알 나트륨 | Sigma-Aldrich | P3761 | 1% in saline for i.p. injection |
| Thoracotomy: | |||
| IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm) | RWD | S12010-11 | |
| 날카로운 곡선 수술 용 가위 (11.5cm) | RWD | S14016-11 | |
| 직선 절개 겸자 (~ 10.5cm) | RWD | F12010-10 | |
| < 강> 관류 < / 강> | |||
| 원심 튜브 (5mL) | Biosharp | ||
| 주사기 | KLMEDICAL | 20mL | |
| 파라포름알데히드 | Vicmed | VIH100 | |
| PBS 0.01M (PH7.2-7.4) 분말 | Vicmed | VC2001P | 탈이온수를 추가하여 용액 |
| <강한>고정, 탈수 및 동결절편 | |||
| 접착 현미경 슬라이드 | CITOTEST | 188105 | 76.2 mm × 25.4 mm |
| 마이크로톰 크라이오스타트 | LEICA | CM1950 | |
| 최적 절단 온도 화합물(OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Sucrose | VETEC | V900116 | |
| Immunofluorescence staining | |||
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | IX-81 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | 200X |
| Image-Pro Plus 7.0C | 미디어 사이버네틱스 | 과학 그래프 작성 및 데이터 분석 소프트웨어 | |
| 면역조직화학 습식 상자 (검정) | Sinylab | 맞춤형 | 300 mm × 100 mm × 38 mm, 그루브 깊이 27 mm, 10개의 표준 슬라이드를 포함할 수 있습니다 |
| Pipet | Thermo Scientific | ||
| 피펫 팁 | 잘 제공 | ||
| 플라스틱 염색 상자 | Sinylab | 맞춤형 | 30mL, 5 개의 표준 슬라이드를 포함 할 수 있습니다 |
| 항체 희석 완충액 | 우리 실험실 | 1 % BSA 1g, 0.3 % Triton X-100 300ul, 0.01 % 아지드 나트륨 10mg PBS | |
| 정제 안티 베타 아밀로이드, 1-16 항체 (6E10) | Biolegend | SIG-39320 | 500X |
| 빠른 항원 회수 솔루션 냉동 섹션 | KeyGEN BioTECH | KGIHC005 | 5X |
| Quantification | |||
| Graphpad Prism 8.0.1 | Graphpad | Medical 매핑 소프트웨어 | |
| Image J Fiji 2.0.0 | National Institute of Health | Scientific 그래프 및 데이터 분석 소프트웨어 |
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