방법 논문

중추신경계 전이의 환자 유래 이종이식 모델의 확립 및 활용

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DOI:

10.3791/62264

⸱

2021년 5월 7일

 , 
1Department of Translational Genomics, Keck School of Medicine, University of Southern California

이 논문에서

요약

중추신경계 전이 PDX 모델은 인간 전이의 표현형 및 분자적 특성을 나타내므로 전임상 연구를 위한 우수한 모델입니다. 여기에서는 PDX 모델을 설정하는 방법과 전임상 연구에 가장 적합한 접종 경로를 설명합니다.

초록

중추신경계(CNS) 전이에 대한 새로운 치료법의 개발은 질병을 정확하게 나타내는 전임상 모델의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. CNS 전이의 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 인간 질병의 표현형 및 분자 특성을 더 잘 나타낼 뿐만 아니라 역사적인 세포주 모델과 비교하여 인간 환자 종양의 이질성 및 클론 역학을 더 잘 반영하는 것으로 나타났습니다. 전임상 시험을 설정할 때 환자 유래 조직을 이식하는 데 사용할 수 있는 여러 부위가 있으며, 각각 고유한 장점과 단점이 있으며 각각 전이성 캐스케이드의 다양한 측면을 연구하는 데 적합합니다. 여기에서 프로토콜은 PDX 모델을 설정하는 방법을 설명하고 전임상 연구에서 CNS 전이 PDX 모델을 활용하기 위한 세 가지 다른 접근 방식을 제시하고 각 응용 프로그램과 한계에 대해 논의합니다. 여기에는 측면 이식, 뇌의 동소 주사 및 심장 내 주사가 포함됩니다. 피하 측면 이식은 모니터링하기 가장 쉽기 때문에 전임상 연구에 가장 편리합니다. 또한, 측면 이식으로 인한 뇌 및 기타 조직으로의 전이가 관찰되었으며, 이는 종양이 혈관내, 혈관외 유출 및 집락화를 포함한 여러 단계의 전이를 거쳤음을 나타냅니다. 뇌에 동소 주사는 뇌종양 미세 환경을 요약하는 가장 좋은 옵션이며 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통과하지만 전이성 캐스케이드의 대부분의 단계를 우회하는 생물학적 제제의 효능을 결정하는 데 유용합니다. 심장 내 주사는 뇌로의 전이를 촉진하고 장기 향성 연구에도 유용합니다. 이 방법은 전이성 캐스케이드의 초기 단계를 생략하지만, 이러한 세포는 여전히 순환, 유출 및 식민지화에서 살아남아야 합니다. 따라서 PDX 모델의 유용성은 종양 접종 경로에 영향을 받으며 어떤 모델을 활용할지는 과학적 질문과 실험의 전반적인 목표에 따라 결정되어야 합니다.

서론

중추 신경계 (CNS)로의 전이 발생률은 최근 몇 년 동안 증가했습니다 1,2,3. 종양 절제술, 전뇌 방사선 요법, 정위 방사선 수술과 같은 중추신경계 전이에 대한 전통적인 치료법은 대체로 완화적이고 완치가 거의 없으며 인지 기능 저하와 같은 쇠약해지는 부작용을 유발할 수 있다1. 최근, CNS 전이 치료를 위해 많은 새로운 표적 및 면역학적 치료법이 개발되고 있는데, 이는 부작용이 적으면서도 보다 효과적인 치료법이 될 가능성을 보여준다4.

전임상 결과를 의미 있는 임상 종점으로 변환하려면 종종 효과적이고 예측 가능한 모델링 전략이 필요합니다. 역사적으로 세포주 이종이식 모델은 CNS 전이 연구에서 전임상 연구의 표준이었습니다. 그러나, 이들 세포주 모델은 숙주 종양의 진정한 종양 거동을 반영하지 않거나, 질환의 조직학적 또는 분자적 이질성을 나타내지 않는다. 또한, 세포주 모델은 시험관내 성장 조건에 적응할 수 있으므로 숙주 종양의 원래 특성을 잃을 수 있습니다. 환자의 종양을 면역결핍 또는 인간화 마우스에 이식하는 환자 유래 이종이식(PDX)은 중개 암 연구에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 연구자들은 PDX 모델이 일반적으로 종양 성장, 조직학적 특성을 충실하게 요약하고 종양 이질성, 전이 가능성 및 분자유전학적 특징을 유지할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, PDX 모델은 PDX 종양 잠복기가 환자의 전체 생존율과 상관관계가 있는 예후이며, 환자 시험에서 치료 반응을 정확하게 예측하는 것으로 나타났다 5,6.

CNS 전이 PDX의 출현이 있었습니다. 대부분 비소세포폐암(NSCLC)7, 유방암8,9 및 흑색종 10,11과 같은 단일 기원에서 유래한 종양을 나타내는 것으로 개발되었습니다. 보다 최근에는, PDX 모델의 크고 다양한 컬렉션이 개발되고 특성화되었으며, 이는 8개의 상이한 조직학적 아형을 나타낸다 12. CNS 전이에 대한 PDX 모델은 조직학적으로나 분자적으로 원래 환자 종양과 매우 유사하며 조직학적 고유한 차이점과 유사성을 입증했습니다10,12. 또한, 대부분의 CNS 전이 PDX 모델은 인간 종양의 클론 이질성을 유지하지만, 일부는 클론 계승의 증거를 나타내어12 치료 후 클론 변화를 모니터링하여 치료에 대한 내성을 연구하는 데에도 이상적이다.

여기에 설명된 프로토콜은 PDX 확립 방법과 CNS 전이의 전임상 연구에 사용되는 다양한 접종 경로를 간략하게 설명합니다(그림 1). 이러한 이식 방법은 성장과 전이를 모방하는 능력이 다릅니다. 여기에서 프로토콜은 각 이식 경로에 대한 응용 프로그램을 강조하고 CNS 전이 연구에 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

다음은 피하 측면 이식에 의한 PDX 모델 설정과 생물학적 변화 및 전이성 캐스케이드의 다양한 단계를 평가하는 데 도움이 될 수 있는 치료 테스트를 가능하게 하는 전임상 연구를 설정하는 데 사용되는 일련의 단계별 프로토콜입니다. 모든 연구와 모델은 3-8주령의 암컷 NOG 마우스를 사용하였다. 모든 조직 샘플은 IRB(Institutional Review Board)에서 승인한 프로토콜에 따라 정보에 입각한 동의하에 수집되었습니다. 모든 동물 실험은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 측면 이식에 의한 PDX 모델의 구축 및 전파

  1. PDX 모델 구축
    1. 수술실에서 환자의 종양을 외과적으로 절제한 후 신선한 종양 조직을 적절한 용액(예: DMEM)에 보관하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 과량의 보관 용액(>10mL)을 사용하여 조직이 완전히 잠기도록 합니다.
    2. 조직을 조직 배양 접시에 옮기고 5mL DPBS로 헹굽니다.
      알림: 이 단계는 무균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 가능한 인간 감염원으로부터 보호하기 위해 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하여 예방 조치를 취해야 합니다.
    3. 종양에서 괴사 부위를 제거하십시오.
      참고: 이것은 조직 중앙을 향한 흰색 흐물흐물한 영역으로 인식될 수 있습니다.
    4. 나머지 조직을 약 2 x 2 x 2mm 조각으로 자릅니다.
    5. 성장 인자 감소 기저막 매트릭스를 함유하는 미세 원심분리 튜브로 조직을 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 각 조직 조각을 완전히 담그기 위해 충분한 기저막 매트릭스(>200μL)를 사용했는지 확인합니다.
    6. 단계 1.3에 기술된 프로토콜에 따라 이식되지 않을 나머지 조직을 냉동 보존한다.
    7. 2-5 % 이소 플루 란과 산소로 유도 챔버에서 동물을 마취하십시오. 마취되면 동물을 코 콘으로 옮겨 지속적인 산소 공급으로 1.5-2.5 % 이소 플루 란에서 마취를 유지합니다. 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 수술 중 안구 건조를 예방하기 위해 수의학 안과 연고를 바르십시오. 동물이 회복 될 때까지 절차 전반에 걸쳐 동물에게 열 지원을 제공하십시오.
    8. 마우스의 이식 부위를 식별합니다.
      참고: 이것은 마우스의 오른쪽 또는 왼쪽 측면에 있어야 하며 일반적으로 흉곽 꼬리의 복부 측면에 측면으로 랜드마크가 있어야 합니다.
    9. 수술 부위를 준비하려면 모피를 면도하고 포비돈 요오드와 70 % 에탄올을 세 번 번갈아 가며 소독하십시오.
    10. 집게를 사용하여 마우스의 피부를 들어 올리고 피부에 0.5-1cm 절개를하십시오.
    11. 절개 부위의 피부 아래에 수술 용 가위를 천천히 삽입하여 피하 공간에 주머니 (깊이 0.5-1cm)를 만듭니다.
    12. 종양 조각 하나를 주머니에 조심스럽게 넣고 밀어 넣고 주머니 바닥으로 밀어 넣어 종양이 빠져 나가는 것을 방지합니다.
    13. 4-0 나일론 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
      참고: 비흡수성 또는 흡수성 봉합사 및 상처 클립과 같은 다른 상처 봉합 방법도 사용할 수 있습니다.
    14. 마우스를 새장으로 다시 옮기고 보행이 될 때까지 마취에서 동물의 회복을 모니터링하십시오.
      참고: 진통제는 필요하지 않지만 생쥐에서 통증이 관찰되면 투여할 수 있습니다.
    15. 매주 종양 성장을 모니터링하십시오. 마우스당 하나의 종양이 예상됩니다.
      참고: 이식 시 종양의 부피는 처음에는 감소하는 것처럼 보이지만 이는 걱정할 필요가 없습니다. 종양은 만져지고 대수 성장 단계에 들어가면 복용한 것으로 간주됩니다. 이 첫 번째 구절은 F0 세대를 나타냅니다.
    16. 종양이 자라기 시작하면 일주일에 세 번 종양을 측정합니다. 캘리퍼스로 종양의 길이와 너비를 측정하십시오. 종양의 부피를 계산하려면 길이 x 너비 x 너비 / 2 공식을 사용하십시오.
    17. 종양의 직경이 15mm를 초과하는 경우 PDX 종양이 이식된 마우스를 종양의 가장 긴 면을 사용하여 안락사시킨다. CO2 유도실에서CO2 흡입에 의한 안락사를 수행한 후 2차 방법으로 자궁경부 탈구를 수행합니다.
    18. 절개를하여 동물의 옆구리에서 종양을 절제하십시오. 뭉툭한 가위와 집게로 절제된 종양을 부드럽게 해부합니다. 이렇게하려면 먼저 종양 상단의 피부를 잘라낸 다음 종양 아래의 근육층에서 종양을 잘라냅니다.
    19. 종양 조직을 >10mL의 적절한 저장 용액(예: DMEM)으로 옮깁니다. 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오. 이 종양은 동결보존되거나 다른 마우스 세트로 계대될 수 있습니다. 이 구절을 F1으로 생각하십시오.
      참고: 다시 계대하면 종양 통로가 F2 등으로 렌더링됩니다.
  2. PDX 모델의 전파
    1. 1.1.19 단계에서 저장 용액에 보관된 절제된 종양으로 시작합니다.
    2. 조직을 조직 배양 접시에 옮기고 5mL DPBS로 헹굽니다.
    3. 종양에서 괴사 부위를 제거하십시오.
    4. 조직을 약 2 x 2 x 2mm 조각으로 자릅니다.
    5. 성장 인자 감소 기저막 매트릭스(>200μL)가 포함된 미세원심분리기 튜브로 조직을 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
    6. 증식에 사용되지 않는 나머지 조직을 단계 1.3에 기재된 프로토콜에 따라 냉동 보존한다.
    7. 2-5 % 이소 플루 란과 산소로 유도 챔버에서 동물을 마취하십시오. 마취되면 동물을 코 콘으로 옮겨 지속적인 산소 공급으로 1.5-2.5 % 이소 플루 란에서 마취를 유지합니다. 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 수술 중 안구 건조를 예방하기 위해 수의학 안과 연고를 바르십시오. 동물이 회복 될 때까지 절차 전반에 걸쳐 동물에게 열 지원을 제공하십시오.
    8. 마우스의 이식 부위를 식별합니다.
      참고: 이것은 마우스의 오른쪽 또는 왼쪽 측면, 일반적으로 복부 부위, 흉곽 꼬리에 있어야 합니다.
    9. 수술 부위를 준비하려면 모피를 면도하고 포비돈 요오드와 70 % 에탄올을 세 번 번갈아 가며 소독하십시오.
    10. 마우스의 한쪽 측면을 0.5-1cm 절개하십시오.
    11. 절개 부위의 피부 아래에 수술 용 가위를 천천히 삽입하여 피하 공간에 주머니 (깊이 0.5-1cm)를 만듭니다.
    12. 종양 조각 하나를 주머니에 조심스럽게 넣고 주머니 바닥으로 밀어 넣어 종양이 빠져 나가는 것을 방지합니다.
    13. 4-0 나일론 수술 봉합사 또는 기타 상처 봉합 방법을 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
    14. 마우스를 케이지로 다시 옮기고 보행이 가능할 때까지 마취 회복을 모니터링합니다.
      참고: 진통제는 필요하지 않지만 생쥐에서 통증이 관찰되면 투여할 수 있습니다.
    15. 잠복기(비성장 단계) 동안 매주 종양 성장을 모니터링합니다. 마우스당 하나의 종양이 예상됩니다.
      참고: 이식 시 종양의 부피는 처음에는 감소하는 것처럼 보이지만 이는 걱정할 필요가 없습니다. 종양은 만져지고 지속적으로 성장하기 시작하면 복용하는 것으로 간주됩니다.
    16. 종양이 자라기 시작하면 일주일에 세 번 종양을 측정합니다. 캘리퍼스로 종양의 길이와 너비를 측정하십시오. 길이 x 너비 x 너비 / 2 공식을 사용하여 종양의 부피를 계산하십시오.
    17. 종양의 직경이 15mm를 초과하는 경우 PDX 종양이 이식된 마우스를 종양의 가장 긴 면을 사용하여 안락사시킨다. CO2 유도실에서 CO2 흡입에 의한 안락사를 수행한 후 2차 방법으로 자궁경부 탈구를 수행합니다.
    18. 절개를하고 뭉툭한 가위와 집게로 종양을 부드럽게 해부하여 동물의 옆구리에서 종양을 절개하십시오.
    19. 종양 조직을 >10mL의 적절한 저장 용액(예: DMEM)으로 옮긴 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.
  3. PDX 종양의 냉동 보존
    1. 종양의 직경이 15mm를 초과하는 경우 PDX 종양이 이식된 마우스를 종양의 가장 긴 면을 사용하여 안락사시킨다. CO2 유도 챔버에서CO2 흡입에 의한 안락사를 수행한 후 2차 방법으로 자궁경부 탈구를 수행합니다.
    2. 절개를하고 뭉툭한 가위와 집게로 종양을 부드럽게 해부하여 동물의 옆구리에서 종양을 절개하십시오.
    3. 종양 조직을 >10mL의 적절한 저장 용액(예: DMEM)으로 옮긴 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.
    4. 조직을 조직 배양 접시에 옮기고 5mL DPBS로 헹굽니다.
    5. 종양에서 괴사 부위를 제거하십시오.
    6. 조직을 약 2 x 2 x 2mm 조각으로 자릅니다.
    7. 조직을 20% DMEM, 70% FBS 및 10% DMSO가 포함된 cryotube로 옮깁니다.
    8. cryotube를 냉동 보존 용기로 옮기고 -80 °C 냉동고에 넣습니다.
    9. 극저온 튜브가 -80 °C로 냉각되면 액체 질소 저장소로 옮깁니다.

2. 전임상 연구를 위한 접종 경로

  1. 피하 측면 이식.
    참고: 피하 측면 이식은 쉽게 사용할 수 있으며 전이성 캐스케이드의 모든 단계를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    1. 초기 측면 이식을 위해 성장하는 PDX 종양 또는 냉동 보존된 PDX 종양을 사용합니다.
    2. 성장하는 PDX 종양의 경우, 종양의 길이가 15mm를 초과할 때 IACUC 승인 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다. 종양을 절제하고 종양 조직을 적절한 저장 용액(예: DMEM)으로 옮기고 즉시 얼음 위에 놓습니다.
    3. 냉동보존된 PDX 종양의 경우, 냉동보존된 PDX 조직을 37°C 수조에 침지하여 신속하게 해동시킨다.
    4. 1.2.2-1.2.19단계를 따릅니다.
  2. 뇌에 두개내 주사에 의한 동소 이식.
    참고: 이 모델은 BBB를 통과하는 약물의 효능을 테스트하고 종양 집락화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 섹션은 주로 종양 해리 키트의 사용을 참조합니다( 재료 표). 다른 조직 유형에는 다른 해리 프로토콜이 필요합니다. 사용자는 해리 효율을 극대화하기 위해 프로토콜을 테스트하고 최적화하는 것이 좋습니다.
    1. 종양의 길이가 15mm를 초과하는 경우 IACUC 승인 방법을 사용하여 PDX 종양이 이식된 마우스를 안락사시킵니다.
    2. 생물 안전 캐비닛의 무균 조건에서 PDX 종양을 외과적으로 절제하고 얼음 위의 DMEM에 보관합니다.
    3. 제조업체의 프로토콜에 표시된 대로 효소 혼합물을 DMEM에 추가하여 적절한 튜브에 해리 용액을 준비합니다.
    4. 조직 배양 접시에서 5mL DPBS로 종양을 세척합니다.
    5. 종양에서 괴사 부위를 제거하십시오.
    6. 종양을 길이 2-4mm의 작은 조각으로 자릅니다.
    7. 종양 조각을 효소 혼합물이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.
    8. 튜브를 조직 해리기에 부착하고 조직 유형에 적합한 프로그램을 실행합니다. 실행할 적절한 프로그램과 필요한 해리 시간에 대해서는 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오.
    9. 프로그램 완료 후 70μm 세포 스트레이너를 통해 세포를 변형시킵니다.
    10. 세포 여과기를 20mL의 DMEM으로 세척합니다.
    11. 해리된 세포를 300 x g 에서 7분 동안 원심분리합니다.
    12. 상청액을 흡인하고 DPBS에서 세포를 재현탁합니다.
    13. 세포를 세고 필요한 농도로 희석하십시오.
    14. 제조업체의 지침에 따라 입체 프레임을 설정하고 마우스 용 가열 패드를 준비하십시오. 70 % 에탄올로 모든 지역을 소독하십시오.
    15. 2-5 % 이소 플루 란과 산소로 유도 챔버에서 동물을 마취하십시오. 마취되면 동물을 코 콘으로 옮겨 지속적인 산소 공급으로 1.5-2.5 % 이소 플루 란에서 마취를 유지합니다. 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 수술 중 안구 건조를 예방하기 위해 수의학 안과 연고를 바르십시오. 동물이 회복 될 때까지 절차 전반에 걸쳐 동물에게 열 지원을 제공하십시오.
    16. 두피가 노출되도록 마우스 머리의 털을 면도하여 수술 부위를 준비합니다.
    17. 마우스에 피하 주사로 투여되는 1mg/kg 부프레노르핀 서방형(SR) 1회 용량과 같은 적절한 진통제를 제공합니다.
    18. 마우스를 입체 프레임으로 옮깁니다. 마우스가 바이트 블록을 물고 있는지 확인하십시오. 이어바를 사용하여 마우스 헤드를 단단히 고정합니다.
      알림: 집게로 살짝 밀었을 때 머리가 움직이지 않으면 마우스가 제대로 고정된 것입니다.
    19. 면도 부위를 포비돈 요오드와 70 % 에탄올을 번갈아 가며 세 번 문질러 소독하십시오.
    20. 두피에 5-7mm 세로 절개를 하여 두개골을 노출시키고 두피를 수축시킵니다.
    21. 집게와 같은 뭉툭한 수술 도구로 골막을 긁어냅니다.
    22. 두개골에서 브레그마를 찾습니다.
    23. 브레그마 위에 정위 프레임의 바늘을 놓고 좌표를 0으로 재설정하거나 팔의 좌표를 기록해 둡니다.
    24. 팔을 정중선의 오른쪽으로 1mm 뒤쪽(꼬리)과 1mm 옆으로 움직입니다.
    25. 이 위치를 영구 마커로 표시하십시오. 암에 주사기 슬롯이 있는 경우 주사기 슬롯에 마커를 부착하여 위치를 표시합니다.
    26. 이 위치에서 두개골에 작은 버 구멍을 뚫습니다. 뇌에 구멍을 뚫는 것을 막기 위해 너무 많은 압력을 가하지 마십시오.
    27. 5 μL, 26 G Hamilton 주사기에 5-10 x 104 cell을 1-2 μL 부피로 로드하고 정위 암에 부착합니다.
    28. 해밀턴 주사기 바늘을 뇌에 2mm 천천히 삽입합니다.
    29. 원하는 속도(보통 0.2-0.5 μL/min)로 세포 주입을 시작합니다.
    30. 주사가 끝나면 천천히 뇌에서 바늘을 집어 넣습니다.
    31. 버 구멍을 뼈 왁스로 채 웁니다.
    32. 수술 봉합사 또는 수술 용 접착제로 절개 부위를 봉합하십시오.
    33. 마우스를 케이지로 다시 옮기고 마취 회복을 모니터링하십시오.
    34. 동물의 상태를 정기적으로 모니터링하고 승인된 프로토콜에서 인도적 종점 기준에 도달하면 안락사시킵니다.
      참고: 뇌의 성공적인 종양 성장은 동물의 상태를 악화시키며, 이는 종종 머리 기울임, 거친 털, 구부러진 몸, 가늘게 뜬 눈, 활동 감소 및 낮은 신체 상태 점수로 나타납니다(BCS < 2).
    35. 안락사 된 동물에 대한 부검을 수행 한 다음 조직 학적 분석을 수행하여 뇌에 종양이 있는지 확인합니다. 이식에서 안락사까지 걸리는 시간을 기록하십시오.
  3. 심장내 주사에 의한 PDX 모델 이식
    참고: 이 모델은 종양 세포가 순환하면 장기 친화성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 섹션은 또한 종양 해리 키트를 사용하며 조직 유형별 최적화가 필요합니다.
    1. 2.2.1-2.2.13 단계를 따르십시오.
    2. 2-5 % 이소 플루 란과 산소로 유도 챔버에서 동물을 마취하십시오. 마취되면 동물을 코 콘으로 옮겨 지속적인 산소 공급으로 1.5-2.5 % 이소 플루 란에서 마취를 유지합니다. 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 수술 중 안구 건조를 예방하기 위해 수의학 안과 연고를 바르십시오. 동물이 회복 될 때까지 절차 전반에 걸쳐 동물에게 열 지원을 제공하십시오.
    3. 그런 다음 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다.
    4. 가슴의 수술 부위를 준비하려면 모피를 면도하고 포비돈 요오드와 70 % 에탄올을 번갈아 가며 세 번 문질러 소독하십시오.
    5. 0.5-10 x 105 세포를 28G 바늘의 주사기에 최대 100μL의 부피로 그립니다.
      참고: 필요한 셀 수는 모델의 공격성에 따라 달라지며 각 모델에 대해 최적의 셀 수를 경험적으로 결정해야 합니다.
    6. 주사 부위를 찾습니다(마우스 흉골의 약간 왼쪽, 흉골 노치와 자이포진 돌기 사이의 중간).
    7. 주사 부위의 마우스에 바늘을 수직으로 삽입합니다.
    8. 주사기로 들어가는 혈액의 역류를 통해 좌심실로 성공적으로 들어가는 것을 관찰하십시오. 바늘을 움직이지 않고 세포를 좌심실로 천천히 분배하십시오.
    9. 마우스에서 바늘을 수직으로 천천히 당겨 빼냅니다.
    10. 주사 부위에 멸균 거즈를 바르고 출혈이 멈출 때까지 약 1분 동안 압력을 가하면서 호흡을 위해 가슴을 움직일 수 있도록 합니다.
    11. 마우스를 마취에서 제거하고 가열 된 패드에서 회복되도록하십시오.
      참고: 성공적인 종양 성장은 동물의 상태를 악화시키며, 이는 종종 주름진 털, 구부러진 몸, 가늘게 뜬 눈, 활동 감소 및 낮은 신체 상태 점수로 나타납니다(BCS < 2).
    12. 동물의 상태를 정기적으로 모니터링하고 승인된 프로토콜에서 인도적 종점 기준에 도달하면 안락사시킵니다.
    13. 안락사된 동물의 전이를 확인하기 위해 부검을 수행한 후 조직학적 분석을 수행하여 표적 장기에 종양이 있는지 확인합니다. 심장 주사에서 안락사까지 걸리는 시간을 기록합니다.

결과

측면 전파 PDX 종양은 이식, 모니터링 및 절제가 가장 쉬우며 일반적으로 PDX 종양의 초기 확립 및 증식에 권장됩니다(그림 1). PDX 종양을 형성하거나 전파할 때 종양 흡수 속도가 다를 수 있고 모든 종양 조각이 항상 마우스를 이식하는 것은 아니므로 여러 동물에 종양을 이식하는 것이 현명합니다. 중추신경계 전이 PDX를 뇌에서 직접 확립하고 전파하기 위한 방법이 개발되었다13. 그러나 이러한 방법은 더 낮은 복용률로 인해 여전히 더 어렵고 종양은 측면 이식보다 전파 및 모니터링이 훨씬 더 어렵습니다.

환자 종양이 용이하게 입수할 수 없는 경우, CNS 전이 PDX 종양은 또한 학술 실험실 또는 상업 회사의 저장소를 포함하는 다양한 출처로부터 얻을 수 있다. 종양을 획득한 후 최우선 순위는 가능한 한 많은 물질을 전파하고 냉동 보존하여 많은 수의 저통과 종양이 보존되도록 하는 것입니다. 이를 통해 PDX 모델을 사용한 후속 연구를 무한히 수행할 수 있는 충분한 자료를 확보할 수 있다. 불멸화된 세포주와 매우 유사하게, PDX 종양은 냉동보존되어야 하며, 유전적 표류가 시간 경과에 따라 PDX의 표현형 및 유전자형에 변화를 초래하기 때문에 낮은 계대수로 사용해야 한다12,14,15. PDX 종양의 출처에 관계없이, 인간에 대한 HIV 및 간염 및 마우스에 대한 코리네박테리움 보비스와 같은 인간 및 마우스 병원체 모두에 대해 PDX 및 마우스 콜로니의 빈번한 스크리닝을 수행하는 것이 중요하다. 이것은 PDX에서 원치 않는 병원체가 PDX를 취급하는 개인과 연구 및 동물 사육장에서 다른 마우스 모두에게 퍼지는 것을 제한할 것입니다.

여기에 설명된 이식 방법은 종양 생물학을 연구하고, 전이성 캐스케이드의 여러 측면을 평가하고, 전임상 연구에 사용할 수 있습니다. 측면 이식의 가장 큰 장점은 종양이 보이기 때문에 시간이 지남에 따라 종양 모니터링이 용이하고 캘리퍼스를 사용하여 성장을 쉽게 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 약물 표적의 타당성을 확립하기 위한 좋은 출발점이 될 수 있습니다. 뇌 미세 환경의 존재가 중요하고 종양의 성장 또는 분자 프로필을 변경할 수 있는 경우 두개내 이식이 선호됩니다. 또한 두개내 이식은 종양을 혈액 뇌 장벽(BBB) 뒤에 배치하므로 BBB를 통과하는 데 필요한 약물의 효능을 조사하는 전임상 연구에 필수적입니다. 그러나, PDX 종양의 성장을 모니터링하는 것은 어렵고, 세포가 표지된 경우 방사선학적 이미징 또는 생체발광 이미징이 필요하다. 약물 치료를 전임상적으로 시작할 시기를 알기 위해서는 성장을 모니터링하기 위한 영상 데이터 또는 특정 PDX 종양을 보유한 마우스의 평균 생존에 대한 지식이 필요합니다. 또한 두개내 이식은 전이성 캐스케이드의 모든 필수 단계를 우회하여 뇌 내 약물 효능 및 종양 미세 환경을 연구하는 데만 적합합니다. 종양 미세환경의 차이에도 불구하고, PDX 종양의 형태는 소세포 폐암 원발성 종양에서 유래한 뇌 전이로부터 유래된 PDX 종양(CM04)에서 볼 수 있듯이 이식 부위에 관계없이 유사하다(도 2). 작은 핵과 부족한 세포질을 가진 종양 세포의 소세포 폐암 형태는 심장 내 주사로 인한 옆구리 종양, 두개내 종양 및 복부 전이에서 관찰할 수 있습니다. 또한, 옆구리에 이식된 종양의 자발적인 전이가 이전에 관찰된 바 있으며12, 이는 혈관내 혈관내, 혈관외 유출 및 집락화와 같은 전이 과정이 뇌의 동소 종양에서는 불가능한 옆구리 종양에서 요약되고 연구될 수 있음을 시사한다. 일반적으로 측면 이식은 CNS 전이 생물학을 연구하고 전임상 연구를 수행하는 데 적합한 방법인 것으로 관찰됩니다.

심장 내 주사는 장기 친화성과 종양의 전이 가능성을 연구하는 데 가장 자주 사용됩니다. 주입된 종양 세포는 생존 순환, 혈관외 유출 및 전이 부위의 집락화를 포함하여 전이성 캐스케이드의 여러 단계를 거쳐야 합니다. 뇌에 동소 주사하는 것과 마찬가지로 방사선 영상이나 세포 표지 없이는 종양 전이의 진행 상황을 추적하기 어려울 수 있습니다. 그러나 동소 이식과 마찬가지로 성공적인 접종은 종양이 퍼짐에 따라 시간이 지남에 따라 동물의 상태를 악화시킵니다. 도 3A 는 흑색종으로부터 유래한 중추신경계 전이 PDX 모델, M2에서 심장내 주사 후 뇌로의 전이를 나타낸다. PDX 종양(CM04)의 심장내 주사는 복강 및 간으로의 전이를 초래하였다(도 3B). 폐, 신장 및 난소와 같은 평가 된 다른 장기에는 눈에 띄는 전이가 없었습니다.

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그림 1: 전임상 연구를 위한 PDX의 설정, 전파 및 사용의 일반적인 워크플로우를 보여주는 흐름도. 각 접종 방법에 대해 관련된 전이성 캐스케이드의 단계가 각 방법 아래에 나열되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 다양한 접종 방법에 따른 PDX 종양의 조직학. 세 가지 방법으로 면역저하된 마우스에 이식된 소세포폐암(CM04)에서 유래한 CNS 전이 PDX 종양의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 소핵과 세포질이 부족한 소세포폐암과 유사한 종양 병리학적 및 형태학적 특징을 가지고 있습니다. 심장 내 주사 패널은 복부 전이를 보여줍니다. 작은 크기의 세포의 둥지와 높은 핵 대 세포질 비율은 세 이미지 모두에서 분명합니다. 이미지를 슬라이드 스캐너로 촬영하여 10배로 확대했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 심장 주사 후 관찰된 전이. (A) M2 및 (B) CM04의 심장내 주사 후 부검에 의한 평가 동안 가시적 전이가 있는 조직의 H&E 염색. 이미지는 (A) 슬라이드 스캐너에서 촬영하고 10배 배율로 일반 현미경에서 1배(왼쪽) 또는 20배(오른쪽) 또는 (B)로 확대했습니다. 이 수치는 이전 간행물12에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

현재 원고에는 PDX 구축 및 전파 방법이 자세히 설명되어 있습니다. CNS 전이를 평가할 때 전임상 연구를 설정하는 데 사용할 수 있는 세 가지 다른 접종 방법도 입증되었습니다. 선택 방법은 실험의 목표에 따라 달라집니다. 어떤 경우에는 하나 이상의 접종 경로를 사용하는 것이 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 피하 측면 이식은 종양 성장에 대한 약물의 효과를 연구하고 표적에서 약물을 평가하는 간단한 접근 방식을 제공하며 쉽게 모니터링하고 측정할 수 있는 종양 크기에 대한 시각 자료도 제공합니다. 그러나 일단 표적 타당성과 항종양 성장 특성이 확립되면 BBB를 교차하는 생물학적 제제의 효능을 평가하고 뇌종양 미세 환경 내에서 그 효과를 연구하기 위한 동종 연구를 설정할 수 있습니다. 또한 생존율은 동소 및 심장 내 주사 연구에서 더 잘 평가됩니다.

뇌 전이 PDX 모델의 두개내 주사는 종종 뇌 미세환경 및 BBB의 존재로 인해 선택되는 전임상 모델입니다. 그러나 연구에 따르면 뇌 전이는 종양에 대한 분자의 투과성에 영향을 미치는 BBB를 변형시키는 능력이 있습니다16. BBB의 이러한 변화는 두개내 이식된 종양에 의해 반영되지 않을 것이며, 이 때문에 전임상 약물 연구는 환자 종양의 반응을 완전히 반영하지 못할 수 있습니다. 이러한 경고에도 불구하고 두개내 주사는 전임상 모델에서 BBB를 통과하는 약물의 투과성과 효능을 테스트하는 가장 좋은 방법으로 남아 있습니다. 두개내 모델의 또 다른 과제는 종양 성장을 모니터링하기 어렵고 이미징 기술을 사용해야 한다는 것입니다. 형광 또는 생체발광 마커를 사용한 PDX의 바이러스 형질도입은 전통적으로 사용되어 왔지만 수행하기 어려울 수 있습니다. 그러나 마커의 도입이 필요하지 않은 마우스에서 사용하기 위해 여러 이미징 기술이 개발되고 있으며, 이는 전임상 연구를 위해 이러한 동소 뇌종양 모니터링의 용이성을 향상시킬 수 있습니다. 여기에는 자기 공명 영상(MRI) 및 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(마이크로 CT)과 같은 영상 기술이 포함됩니다. 마지막으로, 두개내 주사는 연수막 전이와 같이 뇌 외부의 CNS 전이의 미세 환경을 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 이 경우, 연수막 전이를 보다 정확하게 나타내기 위해 수조 마그나로의 주입을 시행할 수 있다17.

PDX 모델의 표현형 및 분자 특징의 특성화는 전임상 연구에 가장 적합한 모델을 선택하는 데 중요합니다. 종양 잠복기는 7-140일 범위일 수 있으며 복용률 또한 매우 가변적일 수 있다12. 이식할 최적의 동물 수와 치료 시작 시기는 각 PDX 모델의 특성을 기반으로 해야 하며 경험적으로 결정해야 합니다. 또한, PDX 종양의 분자 프로파일은 전임상 연구를 위한 가장 대표적인 PDX 모델의 선택에도 중요하다. 모델이 분자적으로 기증자 조직을 나타내는 것이 가까울수록 임상 반응을 더 잘 예측할 수 있습니다. 또한, 인간 데이터에서 선택된 표적이 연구를 위해 선택되는 PDX에 존재하고 클론 계승이 기존 우성 클론의 다른 게놈 프로파일과 관련이 있음을 보여주는 것처럼 몇 세대에 걸쳐 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 이에 비추어 볼 때, 중추신경계 전이 PDX 종양의 표현형 및 분자 프로파일은 여러 세대에 걸쳐 광범위하게 특성화되었다12.

CNS 전이 PDX 모델을 사용하는 많은 장점에도 불구하고 사용과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 대체 종양 미세 환경, 특히 면역 체계의 부족은 PDX 모델18의 잘 문서화된 한계입니다. 인간 종양을 마우스로 이종이식하는 것은 각각의 후속 계대마다 인간 간질을 생쥐 간질로 대체하는 결과를 가져오며, 인간 간질은 일반적으로 여러 계대 후에 완전히 대체된다19. 그러나, 종양 미세 환경의 차이는 원래 환자 종양과 비교하여 측면 이식 PDX종양의 분자 프로파일에 큰 차이를 초래하지 않으며, 이는 측면 모델이 여전히 CNS 전이를 연구하기에 좋은 실험 모델을 나타낸다는 것을 시사한다. 둘째, 면역저하 동물의 사용은 종양 내 면역 세포 침윤의 부족과 숙주에 의한 일반적인 면역 반응을 초래하여 숙주가 암 성장과 싸우려고 시도하는 근본적인 방법을 제한한다12. 인간 면역 세포가 이식된 인간화 마우스는 특정 면역 세포와 종양의 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있지만, 이러한 결과의 접근 방식, 방법 및 해석에 대해서는 여전히 많은 질문과 논란이 있다20.

대부분의 PDX가 유전적으로 안정한 것으로 나타났지만, 우리와 다른 사람들은 드물게 치료나 다른 외부 선택 압력이 없는 경우에도 마이너 클론 인수와 같은 종양 클론에 변화가 있을 수 있음을 보여주었습니다12,14,15. 이것은 분자 프로파일의 극적인 변화를 초래할 수 있으며, 이는 궁극적으로 종양이 환자 종양12에서 우성 클론을 반영하지 않게 만들 것이다. 클론 계승을 나타내는 PDX는 전임상 연구에서 사용할 수 있지만 표적화(예: Her2)를 위한 많은 유전자가 클론 계승으로 손실될 수 있습니다. 그러므로, PDX 모델들이 원하는 클론의 분자 프로파일을 여전히 유지하는지 여부를 결정하기 위해 PDX 모델을 자주 스크리닝하는 것이 권장된다.

요약하면, PDX 모델은 CNS 전이뿐만 아니라 다른 종양 유형의 연구를 위한 우수한 모델 시스템을 나타냅니다. 이러한 모델을 개발하면 인간 CNS 전이의 표현형, 분자 프로필 및 이질성을 크게 반영한다는 것이 밝혀졌습니다 8,9,10,12. 그들은 CNS 전이 생물학을 연구하기 위한 효과적인 모델 역할을 하고 또한 생리학적으로 관련된 전임상 모델로도 사용되어 역사적으로 CNS 전이의 생체 내 연구에 사용된 남용된 세포주 모델을 대체합니다. 의심할 여지 없이, PDX와 공여자 환자 종양 사이에는 차이가 존재한다12,18. 이러한 차이점이 무엇인지 아는 것은 전임상 연구의 적절한 계획과 실행에 중요합니다. 마지막으로, 여러 접종 경로 중에서 선택함으로써 PDX 모델은 질병의 여러 측면을 연구할 수 있는 다용도로 사용할 수 있습니다. PDX 모델은 의심할 여지 없이 CNS 전이에 대한 이해와 새로운 치료법 개발에 중요한 역할을 할 것입니다.

공개 사항

저자는 공개하지 않습니다.

감사의 글

그림 3A는 이전 간행물12 에서 발췌한 것으로 Mayo Clinic에 있는 Jann Sarkaria 박사의 연구실에서 생성되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
25G 바늘VWRBD305122
70 &마이크로; m 세포 여과기VWR21008-952
70% 에탄올 와이프VWR470106-486
뼈 왁스MedVetW31G-RL
CIEA NOG 마우스TaconicNOG-F
DMEMThermoFisher11965092
Ethiqa XR(부프레노르핀 SR)MWI072117
FBSThermoFisher
gentleMACS C TubeMiltenyi130-093-237
gentleMACS OctoDissociator Miltenyi130-095-937
Hamilton syringeSigma20919
Matrigel 성장 인자 감소 (GFR)Corning354230
안과 연고MedVetPH-PURALUBE-VET
PBS / DPBSThermoFisher14040133
Povidone 요오드 면봉VWR15648-906
입체 구조스톨팅 51730
외과 드릴스톨 팅58610
수술 접착제MedVetVG3
수술 봉합MedVetMMV-661-V
주사기VWR53548-001
종양 해리 키트Miltenyi130-095-929
16000044사

참고문헌

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