방법 논문

애기장대 및 기타 식물의 흰가루병 감염 표현형을 정확하게 평가하기 위한 쉽고 유연한 접종 방법

DOI:

10.3791/62287

⸱

2021년 3월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland, 2Department of Nutrition and Food Science, University of Maryland College Park, 3Department of Plant Sciences and Landscape Architecture, University of Maryland College Park

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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우리는 ~ 50 μm 메쉬가있는 접종 상자와 투명한 플라스틱 챔버로 구성된 간단한 포자 분배 시스템을 구성하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 식물에 흰가루병 포자를 고르게 접종하는 데 사용할 수 있으므로 연구 중인 식물의 질병 표현형을 정확하고 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

초록

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곰팡이 질병으로 인한 작물 손실을 줄이려면 식물 면역 및 곰팡이 발병 기전을 관리하는 메커니즘에 대한 이해가 향상되어야하며, 이는 특정 곰팡이 병원균에 감염되었을 때 식물의 질병 표현형을 정확하게 결정해야합니다. 그러나 흰가루병과 같은 배양 불가능한 생물 영양 곰팡이 병원체를 사용한 정확한 질병 표현형은 달성하기 쉽지 않으며 연구 프로젝트의 속도 제한 단계가 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 Arabidopsis-흰가루병 상호 작용을 예로 사용하여 안전하고 효율적이며 작동하기 쉬운 질병 표현형 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 주로 세 가지 구성 요소로 구성됩니다 : (i) 곰팡이 포자가있는 식물의 평평한 부분을 접종하기위한 ~ 50 μm 기공의 스테인레스 스틸 또는 나일론 메쉬가 장착 된 탈착식 뚜껑이 장착 된 목재 접종 상자, (ii) 내부에 접종을 수행하는 동안 포자 탈출을 최소화하기위한 작은 전면 개구부가있는 투명한 플라스틱 챔버, 및 (iii) 균일하고 효과적인 접종을 위한 포자 제거 및 분배 방법. 여기에 설명된 프로토콜에는 접종 상자와 플라스틱 챔버를 저렴한 비용으로 만들기 위한 단계 및 매개변수, 그리고 시스템을 사용하여 흰가루병 포자를 균일하게 접종하여 질병 표현형의 정확성과 재현성을 개선하는 방법에 대한 비디오 데모가 포함됩니다.

서론

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흰가루병은 수많은 식량 작물과 관상용 식물1의 가장 흔하고 중요한 질병 중 하나입니다. 흰가루병에 대한 연구는 Web of Science(2020년 11월 기준)에서 "흰가루병"을 키워드로 한 검색 결과로 10,500개 이상의 출판물에서 알 수 있듯이 매우 인기가 있습니다. 실제로, 흰가루병 (Blumeria graminis로 대표)은 분자 식물 병리학저널 2에 의해 상위 10 개 곰팡이 병원체 중 하나로 간주됩니다. 질병 감수성의 정량화는 질병 저항성 또는 감수성에 기여하는 식물 유전자의 특성화 또는 흰가루병에서 후보 효과기 유전자의 기능적 식별에 필요한 단계입니다. 그러나 신뢰할 수 있는 질병 표현형은 대부분의 다른 곰팡이 병원균에 비해 흰가루병에서 훨씬 더 까다로운데, 부분적으로는 후자의 포자와 달리 흰가루병 종의 포자(예: 실험실 경험을 기반으로 한 Golovinomyces cichoracearum UCSC1)는 물 현탁 과정을 거친 후 생존력이 감소한 것으로 나타남 3,4 . 특정 흰가루병 병원체가 있는 시험 식물의 부적절하거나 고르지 않은 접종은....

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프로토콜

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1. 메쉬가 장착 된 탈착식 상단 뚜껑이있는 표준 접종 상자 만들기

  1. 매장에서 50μm 나일론 멤브레인 메쉬 또는 48μm 스테인리스 스틸 메쉬(권장) 롤을 구입하십시오. 마모된 메쉬를 교체하기 위해 14인치 x 26인치의 여러 조각으로 절단할 수 있을 만큼 충분히 주문하십시오.
  2. 1/4인치 x 2피트 x 4피트 중밀도 섬유판 또는 합판 1개를 구입하고 접종 상자를 만들기 위해 24-1/2인치 x 10인치 x 10개 2개, 12인치 x 10인치 2개를 자릅니다. 4면을 지지하기 위해 8개의 모서리 클램프를 사용하십시오.
    노트: 인클로저의 넓은 면을 향하는 경우 왼쪽 12인치 x 10인치 측면은 영구적으로 부착되고 오른쪽 12인치 x 10인치 측면은 4개의 마그네틱 캐치로 제자리에 고정된 탈착식 도어입니다(그림 1A,B).
  3. 4 개의 2 인치 모서리 버팀대를 왼쪽의 각 안쪽 모서리에 2 개씩 놓고 상단에서 1 인치, 하단에서 1 인치를 놓고 구멍을 표시하고 뚫습니다. 나사를 사용하여 왼쪽의 짧은 면을 두 개의 긴 면(앞면과 뒷면)에 영구적으로 부착합니다. 두 개의 긴 변 사이의 내부 거리는 11-1/2인치가 아니라 12인치여야 합니다.
  4. 코너....

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결과

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여기에서는 준비, 작동 및 조정이 쉬운 새로운 흰가루병 포자 접종 방법을 제시합니다. 그림 1 은 50μm 멤브레인 메쉬로 장착된 탈착식 뚜껑의 제조사에 중점을 둔 표준 접종 상자의 조립을 보여줍니다. 도 2 는 접종실의 조립체를 나타낸다. 그림 3 은 이 시스템을 사용한 접종 과정의 주요 단계를 보여줍니다. 도 4 는 MS-한천 배지 상에 전체 평탄하거나 더 적은 식물, 또는 분리된 잎을 접종하는데 사용될 수 있는 다른 접종 상자를 나타낸다. 마지막으로, 그림 5 는 포자 분포 또는 식물 감염 표현형에 의해 반영된 접종 균등성을 입증하는 데이터를 제공합니다.

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토론

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당사의 메쉬 박스 기반 접종 방법은 다른 접종 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 그림 5에서 볼 수 있듯이 적절하게 작동하면 포자의 균일한 분포를 달성할 수 있습니다. 둘째, ~ 50 μm 메쉬를 사용하고 감염된 잎을 부드럽게 흔들어 포자를 제거하면 원천 식물에 존재하는 총채벌레 또는 기타 식물 감염 곤충에 의한 식물 감염을 줄일 수 있습니다. 셋째, 플라스틱 챔버 내부의 식물 또는 분리 된 잎을 접종하기 위해 다양한 크기의 접종 상자 (둘 다 75 % 에탄올을 분사하여 쉽게 청소할 수 있음)를 사용하면 접종 물을보다 효과적으로 사용하고 교차 오염을 줄일 수 있습니다. 우리는 전체 접종 과정에서 접종실에서 곰팡이 포자가 전혀 또는 거의 빠져 나가지 않는다는 것을 발견했습니다.

양질의 접종 상자는 균일한 접종을 보장하는 열쇠입니다. 우리는 표준 접종 상자가 Arabidopsis의 젊고 성숙한 식물 (

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 국립 과학 재단 (IOS-1901566)이 S. Xiao에게 지원했습니다. 저자는 식물 성장 시설의 유지 보수에 대해 F. Coker와 C. Hooks, 접종 상자 및 챔버 제작과 관련된 기술적 도움을 준 호르헤 사모라에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
  48 &마이크로; m 스테인레스 스틸 그리드 메쉬 스크린; 크기: 24" x 48" 아마존NA접종 상자 뚜껑 만들기
용#6-32 x ¾ " 기계 나사, 평 와셔 및 너트 Home DepotNA접종실 제작용
#6-32 아연 도금 나일론 잠금 너트 (4팩)Home DepotNA접종실 제작용
#6-32x3/8" 필립스 플랫 헤드 기계 나사, 플랫 와셔 및 너트 Home DepotNA자석 도어 캐치 플레이트
#8-32x1/2" 기계 나사, 평 와셔 및 너트Home DepotNA모서리 버팀대와 도어 힌지 고정용
0.250 두께의 투명 압출 아크릴 필름 마스킹 시트;   크기: 17 ½ "X 20"Professional PlasticsSACR.250CEF접종 챔버
0.250 두께의 투명 압출 아크릴 필름 마스킹 시트를 만들기 위해; 크기: 18" x 20"   전문 플라스틱  SACR.250CEF접종 챔버
0.250 두께의 투명 압출 아크릴 필름 마스킹 시트를 만들기 위해; 크기: 18" x 30" Professional PlasticsSACR.250CEF접종 챔버
0.250 두께의 투명 압출 아크릴 필름 마스킹 시트를 만들기 위해; 크기: 20" x 29 ½ "Professional PlasticsSACR.250CEF접종실 제작
1-5/8" 캐비닛 도어 마그네틱 캐치 화이트Home Depot모델 #P110-W접종 챔버 제작
2" 스틸 아연 도금 코너 브레이스 (8팩) 홈 디포  모델 #13611 접종 상자 & 챔버 제작을 위해
3" 코너 클램프하버 화물 도구SKU 63653, 1852, 60589접종 챔버
3/4"를 만들기 위해  스틸 아연 도금 코너 브레이스 (4팩)Home Depot모델 #13542접종 상자 및 챔버
4-7/8" 아연 도금 경량 도어 풀 핸들Home Depot모델 #15184접종 상자 제작용
고급 팬 블렌더 브러쉬마이클스 스토어M10472846 접종에 대해서
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" 나무 사각형 다월 Home DepotNA접종 상자의 뚜껑을 만들기 위해
중간 밀도 섬유판 (1/4 "x 2'x 4');  Home Depot모델# 1508104접종 상자를 만들기 위해
500 &마이크로로 둥근 유리 커버슬립; m 그리드ibidi 미국 Inc.10816자 밀도 측정 
포

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
  2. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology.

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