우리는 ~ 50 μm 메쉬가있는 접종 상자와 투명한 플라스틱 챔버로 구성된 간단한 포자 분배 시스템을 구성하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 식물에 흰가루병 포자를 고르게 접종하는 데 사용할 수 있으므로 연구 중인 식물의 질병 표현형을 정확하고 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.
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방법 논문
애기장대 및 기타 식물의 흰가루병 감염 표현형을 정확하게 평가하기 위한 쉽고 유연한 접종 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
곰팡이 질병으로 인한 작물 손실을 줄이려면 식물 면역 및 곰팡이 발병 기전을 관리하는 메커니즘에 대한 이해가 향상되어야하며, 이는 특정 곰팡이 병원균에 감염되었을 때 식물의 질병 표현형을 정확하게 결정해야합니다. 그러나 흰가루병과 같은 배양 불가능한 생물 영양 곰팡이 병원체를 사용한 정확한 질병 표현형은 달성하기 쉽지 않으며 연구 프로젝트의 속도 제한 단계가 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 Arabidopsis-흰가루병 상호 작용을 예로 사용하여 안전하고 효율적이며 작동하기 쉬운 질병 표현형 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 주로 세 가지 구성 요소로 구성됩니다 : (i) 곰팡이 포자가있는 식물의 평평한 부분을 접종하기위한 ~ 50 μm 기공의 스테인레스 스틸 또는 나일론 메쉬가 장착 된 탈착식 뚜껑이 장착 된 목재 접종 상자, (ii) 내부에 접종을 수행하는 동안 포자 탈출을 최소화하기위한 작은 전면 개구부가있는 투명한 플라스틱 챔버, 및 (iii) 균일하고 효과적인 접종을 위한 포자 제거 및 분배 방법. 여기에 설명된 프로토콜에는 접종 상자와 플라스틱 챔버를 저렴한 비용으로 만들기 위한 단계 및 매개변수, 그리고 시스템을 사용하여 흰가루병 포자를 균일하게 접종하여 질병 표현형의 정확성과 재현성을 개선하는 방법에 대한 비디오 데모가 포함됩니다.
서론
흰가루병은 수많은 식량 작물과 관상용 식물1의 가장 흔하고 중요한 질병 중 하나입니다. 흰가루병에 대한 연구는 Web of Science(2020년 11월 기준)에서 "흰가루병"을 키워드로 한 검색 결과로 10,500개 이상의 출판물에서 알 수 있듯이 매우 인기가 있습니다. 실제로, 흰가루병 (Blumeria graminis로 대표)은 분자 식물 병리학저널 2에 의해 상위 10 개 곰팡이 병원체 중 하나로 간주됩니다. 질병 감수성의 정량화는 질병 저항성 또는 감수성에 기여하는 식물 유전자의 특성화 또는 흰가루병에서 후보 효과기 유전자의 기능적 식별에 필요한 단계입니다. 그러나 신뢰할 수 있는 질병 표현형은 대부분의 다른 곰팡이 병원균에 비해 흰가루병에서 훨씬 더 까다로운데, 부분적으로는 후자의 포자와 달리 흰가루병 종의 포자(예: 실험실 경험을 기반으로 한 Golovinomyces cichoracearum UCSC1)는 물 현탁 과정을 거친 후 생존력이 감소한 것으로 나타남 3,4 . 특정 흰가루병 병원체가 있는 시험 식물의 부적절하거나 고르지 않은 접종은 부정확한 표현형 결과를 초래할 수 있습니다.
흰가루병 연구에 대해 여러 접종 방법이 보고되었습니다. 여기에는 (i) 감염된 잎에서 시험 식물로 직접 포자를 솔질하는 것(5), (ii) 포자 현탁액을 시험 식물6에 분무하는것, (iii) 진공 작동식 침전탑을 사용하여 포자를 타워바닥에 있는 식물에 불어넣기(7) 및 (iv) 나일론 메쉬 멤브레인과소리 기반 진동8을 조합하여 포자 전달 . 포자 브러싱 (또는 먼지 제거) 방법은 수행하기 쉽지만 본질적으로 고르지 않으므로 정량적 평가에는 정확하지 않을 수 있습니다. 포자 살포는 편리하고 균일하지만 위에서 언급했듯이 포자 발아가 불량할 수 있습니다4. 후자의 두 가지 (즉, iii-iv)는 균일 한 접종을 달성 할 수있는 훨씬 개선 된 방법입니다. 그러나 둘 다 단일 이벤트에서 접종할 식물의 수 측면에서 접종 용량을 조정하는 데 유연하지 않아 두 장치 중 하나가 사소한 것이 아니며 진공 및/또는 전원이 있는 실험실 영역으로 작동이 제한됩니다.
우리 실험실은 20 년 넘게 식물-분말 곰팡이 상호 작용을 연구 해 왔습니다 9,10. 지난 10 년 동안 우리는 여러 접종 방법을 테스트했으며 최근에는 간단하면서도 효과적인 흰가루병 접종 방법을 개발했습니다. 이 메쉬 기반 포자 브러싱 방법은 균일한 접종을 보장할 수 있으며 간단하고 확장 가능하므로 흰가루병을 다루는 모든 실험실에서 쉽게 채택해야 합니다.
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프로토콜
1. 메쉬가 장착 된 탈착식 상단 뚜껑이있는 표준 접종 상자 만들기
- 매장에서 50μm 나일론 멤브레인 메쉬 또는 48μm 스테인리스 스틸 메쉬(권장) 롤을 구입하십시오. 마모된 메쉬를 교체하기 위해 14인치 x 26인치의 여러 조각으로 절단할 수 있을 만큼 충분히 주문하십시오.
- 1/4인치 x 2피트 x 4피트 중밀도 섬유판 또는 합판 1개를 구입하고 접종 상자를 만들기 위해 24-1/2인치 x 10인치 x 10개 2개, 12인치 x 10인치 2개를 자릅니다. 4면을 지지하기 위해 8개의 모서리 클램프를 사용하십시오.
노트: 인클로저의 넓은 면을 향하는 경우 왼쪽 12인치 x 10인치 측면은 영구적으로 부착되고 오른쪽 12인치 x 10인치 측면은 4개의 마그네틱 캐치로 제자리에 고정된 탈착식 도어입니다(그림 1A,B). - 4 개의 2 인치 모서리 버팀대를 왼쪽의 각 안쪽 모서리에 2 개씩 놓고 상단에서 1 인치, 하단에서 1 인치를 놓고 구멍을 표시하고 뚫습니다. 나사를 사용하여 왼쪽의 짧은 면을 두 개의 긴 면(앞면과 뒷면)에 영구적으로 부착합니다. 두 개의 긴 변 사이의 내부 거리는 11-1/2인치가 아니라 12인치여야 합니다.
- 코너 cl이 제자리에 있는 상태에서 clamps 오른쪽 도어의 적절한 정렬, 오른쪽 분리 가능한 도어를 제자리에 고정하기 위해 4개의 마그네틱 캐치의 위치를 표시하고 드릴링합니다. 문에 버튼 손잡이를 설치하십시오. 도어 상단이 상단 뚜껑 아래에 끼어 있습니다(그림 1A,B).
- 메쉬로 탈착식 상단 뚜껑을 만들려면 긴 나무 사각형 은못을 26인치 및 12-3/4인치의 2세트로 자릅니다. 상자 주위에 맞도록 네 조각을 붙이고 못을 박으십시오 - 스크린 메쉬가이 프레임에 부착되므로 프레임의 내부 치수가 상자의 외부 치수보다 약간 큽니다.
- 스크린 메쉬를 14인치 x 26인치 미만으로 자릅니다. 날카로운 모서리를 방지하기 위해 화면이 프레임을 지나 튀어나오지 않도록 하십시오. 프레임에서 화면을 늘리는 데 도움이 필요합니다. 클램프로 프레임이 있는 메쉬를 잡고 (그림 1C) 오른쪽 스테이플이 있는 스테이플러 건을 사용하여 스크린을 프레임에 고정합니다.
- 두 세트의 더 짧은 나무 사각 은못(21인치 및 9인치)을 자르고 나사를 사용하여 4개의 짧은 나무 사각 은못 조각을 사용하여 프레임을 따라 메쉬를 단단히 끼웁니다(그림 1C, D).
2. 접종실 만들기
- 적절한 상점에서 투명 아크릴 시트와 하드웨어 품목을 구입하십시오. 그림 2C와 같이 상자의 앞면 아크릴 시트에 7인치 x 20인치 개구부 창을 자릅니다.
- 그림 8A와 같이 왼쪽 및 오른쪽, 전면 (창 포함) 및 후면 아크릴 시트를 상자에 조립하십시오. 챔버의 내부 치수가 상단 시트의 치수와 동일한지 확인하십시오.
알림: 오른쪽은 지지용이며 전면 또는 후면 시트에 부착되지 않습니다. 의도적으로 다른 시트보다 1/2 짧습니다. 이 오른쪽은 그림 2C, D와 같이 하단의 직각 힌지와 상단의 두 개의 마그네틱 캐치로 제자리에 고정되는 "드로 다운" "플랩" 도어가 됩니다. - 모서리 버팀대를 사용하여 패널을 함께 고정합니다(그림 2B, C). 버팀대를 제자리에 잡고 샤피 마커로 표시하고 펀치를 중앙에 넣은 다음 구멍을 뚫습니다.
알림: 드릴링 아크릴은 다른 드릴링과 다르므로 무리하지 않거나 드릴 반대쪽 구멍의 측면에 균열이 생길 수 있습니다. 리벳이나 나사를 사용하십시오. 나사를 과도하게 조이지 마십시오. - 인클로저를 후면으로 돌리고 4개의 모서리 cl을 제거합니다.amp 상단 시트를 제자리에 배치합니다. 표시하고 드릴하십시오.
- 3/4인치 앵글 브레이스로 만든 직각 힌지를 설치합니다. 나일론 고정 잠금 너트를 힌지로드로 사용하십시오. 조이지 말고 문이이 경첩에서 회전 할 수 있도록 간격을 두십시오.
- #6-32x3/4" 팬 헤드 나사로 두 개의 마그네틱 도어 자석을 표시, 중앙 펀치, 드릴 및 부착합니다. 그런 다음 #6-32x3/8" 납작머리 나사로 캐치 플레이트를 부착합니다( 그림 2C, D 참조).
3. 평지에 식물 접종
- 신선한 흰가루병 포자를 접종 물로 준비하십시오 (예 : 애기장대 흰가루병 Golovinomyces cichoracearum UCSC1). 깨끗한 애기장대 면역 손상 pad4-1 돌연변이 식물 11을 성장 챔버 (22 ° C, 6-8 주 동안 65 % 상대 습도)에서 재배하고 pad4-1 식물의 하나 또는 절반 평면을 접종하여 충분한 신선한 흰가루병 포자를 축적 합니다 (그림 3A).
- 표준 11 인치 x 21 인치 x 2.5 인치 아파트에서 감염 표현형을 결정하기 위해 식물을 재배하십시오.
참고: 6-8주 동안 단기간(8시간 빛, 16시간 어둠, 22°C)에서 자란 애기장대 식물은 흰가루병 감염 테스트에 좋습니다. - 접종 후 8-10일(dpi)에 감염된 식물의 신선한 흰가루병 포자를 사용할 수 있는 경우 감염 테스트를 위해 평평한 식물을 접종실 내부의 접종 상자로 옮깁니다(그림 1B,2C).
- 심하게 감염된 애기장대 잎 15-20 개 (또는 잎 / 로제트 크기 및 접종 수준에 따라 4-6 개의 감염된 로제트)를 자르고 응축수가 있으면 잎을 말리십시오.
- 한 손으로 한 쌍의 긴 집게로 1-2 개의 잎이나 로제트를 잡고 잎을 거꾸로 향하게하십시오. 그런 다음 양손을 챔버의 입구에 넣고 가위로 집게의 팔을 부드럽게 치면서 접종 상자에 장착 된 메쉬 위로 잎 / 로제트를 천천히 움직입니다 (그림 3B). 모든 잎이나 장미가 사용될 때까지 이것을 반복하십시오.
알림: 성숙한 포자는 감염된 잎의 분생 포자에서 쉽게 제거됩니다. 가능한 한 고르게 메쉬의 포자를 제거하십시오. - 하나 또는 두 개의 미세한 팬 블렌더 브러시를 사용하여 메쉬를 통해 포자를 부드럽게 닦습니다(그림 3C). 접종 상자 바닥의 식물에 포자의 균일한 분포를 최대화하기 위해 메쉬의 전체 표면을 다른 방향으로 4회 이상 솔질해야 합니다(그림 3D). 브러시로 메쉬를 몇 번 가볍게 두드려 메쉬에 붙어있는 포자를 털어냅니다.
- 포자가 30 분 동안 진정되도록하십시오. 그런 다음 접종 상자에서 접종 된 식물이 들어있는 평평한 곳으로 옮깁니다. 플라스틱 돔으로 플랫을 덮고 성장 챔버 (22 ° C, 65 % 상대 습도)에 놓습니다. 질환 표현형은 5, 또는 8 내지 12 dpi( 12)에서 수행될 수 있다.
4. 더 작은 접종 상자로 식물을 접종하십시오.
알림: 접종할 식물 수가 적은 경우에도 표준 접종 상자를 사용할 수 있습니다. 식물을 상자 중앙에 놓으십시오. 식물을 덮는 메쉬 영역에서 포자를 제거하고 솔질하여 접종물을 저장하면서 모든 식물이 접종되도록 합니다. 대안적으로, 그리고 바람직하게는, 더 작은 접종 박스가 사용될 수 있다(하기에 설명되는 바와 같이).
- 골판지 상자를 접종 상자로 변환합니다. 상자의 상단과 하단을 제거하고 필요한 경우 모서리를 테이프로 고정한 다음 접착 또는 스테이플링하여 상단에 적절한 크기의 50μm 메쉬를 장착하기만 하면 됩니다(그림 4A, B).
- 접종실 내부에 식물이 들어 있는 플랫을 옮기고 더 작은 접종 상자를 플랫 위에 놓아 식물을 덮습니다.
- 위에서 설명한대로 포자를 제거하고 솔질하십시오.
5. 페트리 접시에 분리 된 잎을 접종하십시오.
참고: (i) 신선한 흰가루병 포자가 매우 제한적이거나 (ii) 감염된 세포의 질병 표현형 및/또는 단백질 세포내 국소화를 평가해야 하는 동안 식물을 깨끗하게 유지해야 하는 경우 분리된 잎을 MS-한천 플레이트의 감염에 사용할 수 있습니다.
- 페트리 접시보다 약간 큰 미니 접종 상자를 만드십시오.
- 1/2 강도의 무라시게 및 스쿠그(MS) 중간 한천(1.5%) 플레이트를 준비합니다. 필요한 경우 곰팡이 오염을 줄이기 위해 티아벤다졸(40mg/L)을 추가합니다. 접시를 사용할 때까지 냉장고에 4 ° C에서 보관하십시오.
- 테스트 할 각 개별 식물에 대해 잎자루 바닥에서 하나 또는 두 개의 완전히 확장 된 잎을 자릅니다. 분리 된 잎의 잎자루를 ~ 30 ° 각도로 한천 배지에 삽입합니다.
알림: 각 플레이트에는 잎의 크기와 사용 된 플레이트에 따라 20-40 개의 잎이 포함될 수 있습니다 (그림 4C). - 상기와 같이 접종실 내부의 잎을 접종한다. 뚜껑이있는 판을 성장 챔버로 옮깁니다.
- 잎의 작은 부분을 자르고 특정 시점에서 단백질의 세포 내 국소화를 확인하십시오.
- 감염 표현형을 평가하기 위해 잎을 4 또는 5dpi의 신선한 무균 MS-한천 플레이트로 옮깁니다. 잎을 신선한 한천 배지에 넣기 전에 잎자루의 바닥을 자릅니다. 8 또는 9dpi에서 질병 표현형을 평가합니다.
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결과
여기에서는 준비, 작동 및 조정이 쉬운 새로운 흰가루병 포자 접종 방법을 제시합니다. 그림 1 은 50μm 멤브레인 메쉬로 장착된 탈착식 뚜껑의 제조사에 중점을 둔 표준 접종 상자의 조립을 보여줍니다. 도 2 는 접종실의 조립체를 나타낸다. 그림 3 은 이 시스템을 사용한 접종 과정의 주요 단계를 보여줍니다. 도 4 는 MS-한천 배지 상에 전체 평탄하거나 더 적은 식물, 또는 분리된 잎을 접종하는데 사용될 수 있는 다른 접종 상자를 나타낸다. 마지막으로, 그림 5 는 포자 분포 또는 식물 감염 표현형에 의해 반영된 접종 균등성을 입증하는 데이터를 제공합니다.
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토론
당사의 메쉬 박스 기반 접종 방법은 다른 접종 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 그림 5에서 볼 수 있듯이 적절하게 작동하면 포자의 균일한 분포를 달성할 수 있습니다. 둘째, ~ 50 μm 메쉬를 사용하고 감염된 잎을 부드럽게 흔들어 포자를 제거하면 원천 식물에 존재하는 총채벌레 또는 기타 식물 감염 곤충에 의한 식물 감염을 줄일 수 있습니다. 셋째, 플라스틱 챔버 내부의 식물 또는 분리 된 잎을 접종하기 위해 다양한 크기의 접종 상자 (둘 다 75 % 에탄올을 분사하여 쉽게 청소할 수 있음)를 사용하면 접종 물을보다 효과적으로 사용하고 교차 오염을 줄일 수 있습니다. 우리는 전체 접종 과정에서 접종실에서 곰팡이 포자가 전혀 또는 거의 빠져 나가지 않는다는 것을 발견했습니다.
양질의 접종 상자는 균일한 접종을 보장하는 열쇠입니다. 우리는 표준 접종 상자가 Arabidopsis의 젊고 성숙한 식물 (
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 과학 재단 (IOS-1901566)이 S. Xiao에게 지원했습니다. 저자는 식물 성장 시설의 유지 보수에 대해 F. Coker와 C. Hooks, 접종 상자 및 챔버 제작과 관련된 기술적 도움을 준 호르헤 사모라에게 감사드립니다.
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재료
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