Method Article

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

DOI:

10.3791/62298

⸱

April 21st, 2021

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막 세포 이식은 망막 구조를 복원하고 퇴화 된 망막의 시각 능력을 안정화 시키거나 향상시킬 수있는 유망한 치료 접근법입니다. 그럼에도 불구하고 세포 대체 요법의 발전은 현재 고품질의 표준화 된 인간 망막의 기성품 공급원을 요구하는 문제에 직면 해 있습니다. 따라서 실험을 위해서는 쉽고 안정적인 프로토콜이 필요합니다. 여기에서 우리는 외인성 분자와 시약 A를 사용하는 자가 조직화 방법과 3차원 인간 망막 오가노이드(RO)를 생성하기 위한 수동 절제를 기반으로 최적화된 프로토콜을 개발합니다. 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 유래 RO는 광 수용체에 대한 특정 마커를 발현합니다. 다기능 길항제 인 COCO를 첨가하면 광 수용체 전구체 및 원뿔의 분화 효율이 크게 증가합니다. 세포주와 일차 세포의 이점이 있고 후자와 관련된 소싱 문제 없이 이 시스템을 효율적으로 사용하면 합류성 망막 세포, 특히 광수용체를 생성할 수 있습니다. 따라서, RO로의 PSC의 분화는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 이식을 위한 최적의 생체관련성 플랫폼을 제공한다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

만능 줄기 세포 (PSC)는자가 재생과 모든 종류의 체세포로 분화하는 능력이 특징입니다. 따라서 PSC에서 파생된 오가노이드는 재생 의학 연구에서 중요한 자원이 되었습니다. 망막 변성은 광 수용체 (막대 및 원뿔)와 망막 색소 상피의 손실을 특징으로합니다. 망막 세포 대체는이 질병에 대한 고무적인 치료법이 될 수 있습니다. 그러나 질병 연구 및 치료를 위해 인간 망막을 얻는 것은 불가능합니다. 따라서 다층 천연 망막 세포를 효과적이고 성공적으로 재현하는 PSC에서 파생된 망막 오가노이드(RO)는 기초 및 중개 연구에 유익합니다1,2,3. 우리의 연구는 망막 변성4를 연구하기에 충분하고 양질의 세포를 제공하기 위해 RO 분화에 중점을 둡니다.

RO를 차별화하는 방법은 2012 년 Sasai 실험실에서 개척 한 3 차원 (3D) 서스펜션 차별화와 함께 지속적으로 등장하고 있습니다5. 광수용체 전구체 세포를 특이적으로 추적하기 위해 인간 배아 줄기세포(hESC)에 CRX-tdTomato 태그를 도입....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 수도 의과 대학 베이징 퉁렌 병원의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. H9 hESC는 WiCell 연구소에서 얻었으며 td토마토 태그가 부착된 세포주로 유전자 조작되었습니다.

1. 인간 RO의 생성

  1. 피더가 없는 조건에서 hESC를 배양합니다.
    1. 6웰 플레이트의 한 웰을 1mL의 0.1mg/mL 시약 A(재료 표)로 37°C에서 제조업체의 지침에 따라 최소 30분 동안 코팅합니다. 1x106 hESC의 분취량을 해동합니다.
      참고: 예열된 시약 B 3mL(재료 표)를 준비하고 냉동 보존 세포(1mL)를 3mL의 새 배지로 옮깁니다. hESC를 단일 세포에 피펫팅하지 마십시오.
    2. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다.
    3. 시약 B 2mL가 포함된 시약 A 코팅 플레이트에 세포를 시둡고 매일 시약 B 2mL를 교체합니다. 패시지 세포는 대략 80 % 컨플루언시 (보통 약 4 일)에 도달합니다.
  2. 0 일째
    1. 배지 I을 사용하여 hESC를 단일 세포 현탁액에 해리시킵니다(표 1....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

개략도는 COCO로 전구체 세포를 개선하기 위한 분화 프로토콜을 보여줍니다(그림 1). PSC에서 RO에 이르기까지 수많은 세부 사항으로 인해 결과 변동이 발생할 수 있습니다. 전체 절차를 추적하기 위해 모든 단계와 모든 매체의 카탈로그 번호 및 로트 번호를 기록하는 것이 좋습니다.

여기에서는 6일, 12일, 18일 및 45일에 대한 명시야 이미지를 제공합니다(그림 2). 6일째에 오가노이드는 일반적으로 96웰 플레이트에서 직경이 약 600μm이며 내부에 조밀한 연결과 밝은 테두리가 있습니다(그림 2A). 12일째에, 시신경 소포-유사 구조가 초기에 생성된다(도 2B). 12 일부터 18 일까지 시신경 소포 구조의 존재는 분명하며 18 일 이후에도 계속 성장했습니다. .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막 오가노이드 분화는 충분한 기능성 망막 세포의 생성을 위한 바람직한 방법이다. RO는 신경절 세포, 양극성 세포 및 광 수용체와 같은 다양한 망막 세포의 복합체로, 신경 망막 4,5,8,9쪽으로 다 능성 줄기 세포에 의해 생성됩니다. 합류 RO를 수확할 수 있지만 시간이 많이 걸리므로 긴 배양 기간(최대 180일)이 필요할 수 있습니다. 그러나, 광수용체 이식, 또는 콘-로드 또는 로드-콘 이영양증을 연구하기 위해, 3D 배양 시스템(10)에서 비교적 높은 비율의 광수용체를 수득하는 것이 유리하다.

또한 정상적인 발달 과정을 방해하지 않고 오가노이드의 발달을 모니터링하는 것도 어렵습니다. 따라서 우리는 주로.......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원고에 대한 기술 지원과 유용한 의견을 주신 502 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014)과 National Key R & D Program of China (2017YFA0105300)의 지원을 부분적으로 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-메르캅토에탄올생명 기술21985-023
코코R& D Systems3047-CC-050DAN BMP 길항제의 도메인 제품군
DMEM/F-12Gibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), 인간 배아 줄기 세포생물학 산업04-002-1A
GMEMGibco11710-035
녹아웃 혈청 교체-다종GibcoA3181502
MEM 비필수 아미노산 용액(100X)sigmaM7145
펜 연쇄상구균Gibco15140-122
Primesurface 96 V-plateSbioMS9096SZ1.2.7
Pyruvate의 세포 응집SigmaS8636
시약 ABD356231Matrigel in 1.1.1
Reagent BStemCell5990mTeSR- E8 , PSC 기초 배지 in 1.1.2
시약 CGibco12563-011TrypLE Express in 1.2
Reagent DRoche11284932001DNase I , in 1.2
retinoicSigmaR2625-100MG
SAGEnzo Life ScienceALX-270-426-M001
Supplement 1Life Technologies17502-048N-2 Supplement (100X), 액체, 메덤 III의 서플레멧
TaurineSigmaT-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드Gibco 25200056오가노이드 해리 2.1.3
Wnt 길항제 I, IWR-1-엔도 - Calbiochem시그마681669Wnt 억제제
Y-27632 2HClSelleckS1049
자격 acid

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
  2. Lu, Y. F., et al.

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Retinal OrganoidsPluripotent Stem CellsRetinal Cell TransplantationPhotoreceptor PrecursorsOrganoid DifferentiationOptic VesicleCell AggregationDisease ModellingDrug ScreeningCRX Expression

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