Method Article

CCCIP14 효율적인 뿌리 형질전환 시스템을 조명하기 위한 유전자 기능 분석

DOI:

10.3791/62304

⸱

September 23rd, 2021

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1College of Forestry, Beijing Forestry University, 2Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 CcCIPK14 유전자의 기능 분석을 위한 효율적이고 안정적인 형질전환 시스템을 예로 제시하여 비모델 식물의 신진대사를 연구하기 위한 기술적 기반을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

효율적이고 안정적인 형질전환 시스템은 유전자 기능 연구와 식물의 분자 육종에 필수적입니다. 여기에서는 비둘기 완두콩에 대한 Agrobacterium rhizogenes 매개 형질 전환 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 줄기는 이진 벡터를 가진 A. rhizogenes에 감염되어 7일 후에 굳은살을 유발하고 14일 후에 외래성 뿌리를 유발합니다. 생성된 형질전환 털뿌리는 형태학적 분석과 GFP 리포터 유전자에 의해 확인되었습니다. 이 시스템의 적용 범위를 더 자세히 설명하기 위해 이 형질전환 방법을 사용하여 CcCIPK14(Calcineurin B-like protein-interacting protein kinase)를 비둘기완두콩으로 형질전환시켰습니다. 형질전환 식물은 CcCIPK14가 이러한 호르몬에 반응하는지 여부를 테스트하기 위해 각각 자스몬산(JA) 및 앱시스산(ABA)으로 처리되었습니다. 그 결과, (1) 외인성 호르몬이 특히 CcCIPK14 과발현(OE) 식물에서CcCIPK14의 발현 수준을 유의하게 상향 조절할 수 있음을 보여주었습니다. (2) CcCIPK14-OE 라인의 Genistein 함량은 대조군보다 훨씬 높았습니다. (3) 2개의 다운스트림 핵심 플라보노이드 합성효소 유전자인 CcHIDH1 및 CcHIDH2의 발현 수준은 CcCIPK14-OE 라인에서 상향 조절되었습니다. (4) 털이 많은 뿌리 형질전환 시스템은 비모델 식물에서 대사 기능 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

형질전환(transformation)은 외인성 유전자(exogenous genes)의 발현을 평가하기 위한 기본 도구이다 1,2. 자원 식물의 많은 생물학적 측면은 모든 식물에 공통적입니다. 따라서 특정 유전자에 대한 기능적 연구는 모델 식물(예: 애기장대)에서 수행할 수 있습니다3. 그러나 식물의 많은 유전자는 기능과 발현 패턴이 독특하기 때문에 특히 자원 식물의 경우 자체 또는 밀접하게 관련된 종에 대한 연구가 필요합니다 3,4. 식물 세포는 식물이 다양한 환경 스트레스 조건에 반응하여 유전자 발현, 신진 대사 및 생리학의 특정 변화를 보일 수 있도록 하는 다양한 신호를 감지할 수 있습니다 5,6,7. 플라보노이드는 환경 스트레스에 반응하는 식물의 신호 전달 과정에서 중요한 역할을 합니다 5,8,9. 또한, 원예 및 약용 식물의 플라보노이드 함량 또한 품질 평가를 위한 중요한 지표이다10. 외부 신호에 대한 반응으로 플라보노이드 합성을 조절하는 유전자를 확인하는 것은 식물에서 플라보노이드 합성의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 몇몇 학문은 외인성 호르몬의 신청이 플라보노이드 6,11의 축적을 승진시킬 수 있다는 것을 밝혔다. 안정적인 형질전환 시스템과 유전자 기능 검증 방법은 유전자의 기능을 입증하고 식물의 2차 대사를 이해하는 데 필수적입니다.

아그로박테리움 매개 형질전환은 DNA 삽입에 널리 사용됩니다 5,8,9. Agrobacterium tumefacient는 고리 유전자를 식물 세포의 염색체로 전달할 수 있으며, 외인성 식물 호르몬은 식물을 재생하여 안정한 형질전환체를 얻을 수 있는 단일 또는 소수의 숙주 세포를 유도합니다 12,13,14. Agrobacterium tumefacient-mediated transformation 방법은 in vitro 조작에 적합한 식물 종에 더 적합하지만, 대부분의 다년생 목본 식물은 재생의 어려움으로 인해 이 방법의 적용을 제한합니다 4,15. A. rhizogenes는 또한 숙주 세포의 게놈을 변형시킬 수 있습니다16. 본 연구에서는 효율적이고 안정적인 A. rhizogenes 매개 형질전환 절차를 개발했습니다. A. rhizogenes는 Ri 플라스미드 외에 비천연 유전자 T-DNA를 운반하는 두 번째 이진 플라스미드를 함유하고 있습니다. 숙주 식물이 감염되어 야생형 새싹에서 나오는 형질전환 털이 많은 뿌리를 가진 복합 식물을 얻을 수 있습니다16,17. A. rhizogenes-매개 형질전환 시스템은 빠르고 저렴하며 식물재생이 필요하지 않기 때문에 목본 식물 연구에 적용하기에 적합합니다. 160 종 이상의 식물이 성공적으로 털이 많은 뿌리를 유도했으며 대부분은 Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Convolvulaceae, Umbelliferae, Leguminosae, Caryophyllaceae 및 Polygonaceae18,19에 있습니다. A. tumefaciens와 비교했을 때, A. rhizogenes는 비둘기콩의 매개형질전환에서 더 높은 효율을 보였다17,20.

본 연구에서는 비둘기완두콩을 예로 들어 A. rhizogenes에 의해 매개되는 형질전환 과정을 소개하였다. 접종부터 발근까지 실험은 5주 동안 진행되었습니다. 형태학(morphology)과 GFP 리포터 유전자(Germaner gene)를 통해 외래뿌리의 형질전환을 확인하였으며, 형질전환 효율은 75%에 달하는 높은 수치를 보였다. 또한 복합 식물을 JA 및 ABA로 처리했으며 정량적 real-PCR 및 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 전사체 및 2차 대사 산물을 검출했습니다. CcCIPK14의 발현 수준은 JA 및 ABA에 반응할 뿐만 아니라 플라보노이드의 생합성에도 영향을 미치는 것으로 확인되었습니다. 이 시스템은 2차 대사와 관련된 기능 유전자를 연구하는 데 적합합니다. 또한 충분히 안정적인 변환 시스템이 없는 비모델 플랜트를 연구하는 새로운 접근 방식을 제공합니다 17,21,22.

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Protocol

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참고: 비둘기 완두콩은 Fabaceae과에 속하는 이배체 콩과 식물 작물입니다. 이 실험에 사용된 비둘기 완두콩 씨앗은 중국 동북 임업 대학교에서 가져온 것이며 코드는 87119입니다. 이 프로토콜의 기본 단계는 그림 1A에 설명되어 있습니다. 묘목 배양은 16 시간 광주기에서 m-2 s-1 당 50 μmol 광자의 형광등 아래에서 25 ° C의 높은 습도 환경에서 수행되었습니다. A. rhizogenes 균주 K599 (NCPPB2659)는 실험실에서 보존되었습니다. 그들은 -80 ° C에서 15 % 글리세롤과 함께 효모 만니톨 배지 (YEP)에 보관되었다. 이 연구에서 기술된 프로토콜은 Meng et al.21 프로토콜을 기반으로 합니다.

주의: 모든 유전자 변형 박테리아와 식물을 적절한 폐기물 용기에 넣으십시오. 모든 유해 화학 물질을 흄 후드에 사용하고 유해 폐기물 용기에 폐기하십시오.

1. 비둘기 완두콩 묘목의 준비

  1. 1년 미만 동안 보관된 통통하고 손상되지 않은 비둘기 완두콩 씨앗(그림 1A)을 선택하십시오.
  2. 씨앗을 증류수에 24시간 동안 담가둡니다(그림 1B). 부풀어 오른 씨앗을 씨앗 트레이에 옮겨 온실에 넣으십시오.
  3. 씨앗은 1-2일 후에 발아하기 시작합니다. epicotyl이 1.5cm에 도달하면 묘목을 흙과 모래가 들어있는 10cm (지름) x 9cm (높이) 화분에 3 : 1의 부피 비율로 이식합니다.
    참고 : 토양은 영양가가 풍부한 토양, 질석 및 펄라이트의 혼합물로 2 : 1 : 1 비율로 구성됩니다.
  4. 온실에서 묘목을 키우십시오.

2. A. rhizogenes의 활성화

참고: A. rhizogenes 형질전환에 사용된 균주는 -80°C에서 보존된 K599였습니다. 이진 벡터 pROK2(pBIN438; http://www.biovector.net/product/428388.html)는 녹색 형광 단백질(GFP)을 지표 유전자로 포함하고 카나마이신 저항성 유전자를 A. rhizogenes를 형질전환하기 위한 선택 가능한 마커로 포함합니다.

  1. 얼음 위에서 A. rhizogenes 를 해동합니다.
  2. 박테리아를 담그고 한천 분말 8g/L, 리팜피신 25mg/L, 카나마이신 25mg/L(YRK, pH 7.0)가 보충된 효모 만니톨 배지(YEP)에 균일하게 정렬합니다.
  3. 28 ° C에서 16 시간 동안 배양하십시오.
  4. 단클론 콜로니를 선택합니다. 25mg/L의 리팜피신과 25mg/L의 카나마이신(YRK, pH 7.0)이 보충된 10mL의 YEB 배지가 포함된 50mL 튜브에서 배양합니다. 회전 반경이 10cm, 28°C에서 200rpm, 16시간 동안 회전 반경이 200cm인 진탕 인큐베이터에 원심분리기 튜브를 놓습니다.

3. A. rhizogenes를 이용한 식물 형질전환

참고: 다음 주입 절차를 사용하여 A. rhizogenes를 감염시킬 건강한 식물을 선택하십시오. 이 절차는 변형된 털이 많은 뿌리를 생성합니다. CcCIPK14의 유전자 기능을 분석하기 위해서는 대조군이 필요합니다. 빈 벡터 또는 CcCIPK14-pROK2 플라스미드를 가진 A. rhizogenes 용액을 묘목에 주입하여 털이 많은 뿌리를 유도했습니다.

  1. A. rhizogenes 접종
    1. 성장 상태가 같은 비둘기 완두콩 묘목을 선택하십시오.
    2. 1mL 주사기에서 공기를 비우고 0.3mL의 박테리아 액체를 흡입합니다. 푸시로드를 천천히 밀어 주사기 바늘에 박테리아 액체21을 채웁니다.
    3. 먼저 비둘기 완두콩 묘목의 줄기를 핀셋으로 고정한 다음 주사기 바늘을 1cm 깊이의 줄기에 찔러넣습니다.
    4. 주사기를 빼낼 때는 바늘 끝을 줄기에 완전히 담그십시오. 푸시로드를 천천히 밀어 관통하는 상처에서 박테리아 액체를 펌핑합니다.
      참고: 박테리아 방울의 상처에 잔류 박테리아 액체를 부착하면 감염 및 변형 효율을 향상시킬 수 있습니다.
  2. 묘목 관리
    참고: 높은 온도와 습도는 A. rhizogenes의 감염 효율을 향상시킬 수 있습니다.
    1. A. rhizogenes를 접종 한 묘목을 1L의 물과 함께 트레이 (30cm x 60cm x 6cm)에 놓습니다. 투명 플라스틱 뚜껑(30cm x 60cm x 30cm)을 덮개로 사용하여 내부 환경의 온도와 습도를 유지하십시오.
    2. 주기적으로 낙엽과 잎 끝과 낙엽에 붙어있는 응집 균사를 제거합니다.
    3. 일주일 후, 상처에 굳은살이 나타나기 시작한다. 그런 다음 플라스틱 뚜껑을 반쯤 열어 두십시오.
    4. 4-5주 후, 대부분의 굳은살 조직은 외래 뿌리로 분화했습니다. 플라스틱 뚜껑을 제거합니다.
    5. 토양을 촉촉하게 유지하기 위해 1일에 한 번씩 트레이에 물 3L를 추가합니다.
      참고: 비둘기 완두콩은 가뭄에 강한 식물입니다. 물을 너무 많이 주면 식물의 성장을 저해할 수 있습니다.

4. 변형된 털이 많은 뿌리의 식별

참고: 변형된 털뿌리는 형태와 유전자 수준에 따라 식별할 수 있습니다. 이 절차는 주로 리포터 유전자(GFP) 식별 분석에 중점을 둡니다.

  1. 털이 많은 뿌리의 뿌리 끝을 모아 나머지 부분을 표시하십시오.
  2. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에서 녹색 형광이 있는지 평가합니다.
  3. 강한 형광 신호를 가진 털이 많은 뿌리 0.1g을 액체 질소의 미세한 분말로 삼중화합니다.
  4. 식물 게놈 DNA 키트 제조업체의 지침에 따라 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 방법23으로 비둘기 완두콩 독립 형질전환 라인의 게놈 DNA를 준비합니다.
  5. PCR을 위해 500ng의 게놈 DNA 템플릿과 프라이머를 사용합니다. 프라이머는 표 1에 나와 있습니다.
  6. 다음 증폭 주기를 수행합니다: 94°C에서 5분 동안 사전 변성, 94°C에서 30초 동안 변성, 55°C에서 30초 동안 프라이머 어닐링, 72°C에서 30초 동안 프라이머 확장. 36회 주기와 72°C에서 10분의 최종 연장을 거친 후 1% 아가로스 겔에서 증폭된 산물을 분석합니다.
  7. 핵산 염색으로 겔을 염색하고 자외선 아래에서 시각화합니다.

5. 외인성 호르몬 치료

참고: 양성 복합 식물은 대사에 대한 CcCIPK14의 효과를 연구하기 위해 외인성 호르몬으로 처리되었습니다. A. rhizogenes 에 의해 유도된 복합 식물은 JA 처리군, ABA 처리군, 대조군의 세 그룹으로 나뉘었습니다(그림 3A).

  1. 외인성 호르몬 치료 3일 전에 물을 줄이십시오.
  2. JA 및 ABA 용액을 모두 5mg/L의 농도로 준비합니다.
    참고 : JA 및 ABA 분말은 먼저 에틸 알코올에 용해 된 다음 증류수로 목표 부피까지 채워집니다.
  3. 스프레이 병을 사용하여 JA 및 ABA 용액을 식물의 잎에 균일하게 분사합니다. 대조군을 물로 처리하십시오.
    참고: 각 묘목에 평균 10mL의 용액을 분사했습니다.
  4. 스프레이 처리 직후 플라스틱 뚜껑으로 덮으십시오. 인공 기후 온실에 다시 넣으십시오.

6. 시료 채취 및 보존

참고: 외인성 호르몬 처리 3시간 후, 다른 치료 그룹의 식물 재료를 수집했습니다.

  1. 황갈색과 오염 된 털이 많은 뿌리를 제거하고 흰색으로 보이는 뿌리를 선택하십시오. 이 털이 많은 뿌리를 모아 흡수성 종이로 말리십시오.
  2. 각 묘목에서 수집 한 털이 많은 뿌리를 두 부분으로 나눕니다. 번호가 매겨진 시험관에 한 부품을 넣고 표시된 은박지를 사용하여 감쌉니다.
  3. 은박지를 액체 질소에 동결 건조한 다음 추가 조사를 위해 수확된 모든 주석 호일을 -80°C에 보관하십시오.

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Results

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A. rhizogenes - 비둘기 완두콩에 매개된 털이 많은 뿌리 변형
이 연구는 식물 분자 분야에서 중요한 의미를 지닌 A. rhizogenes에 의해 매개되는 털뿌리의 유전적 변형을 위한 단계별 프로토콜을 설명했습니다. A. rhizogenes에 감염된 비둘기 완두콩의 뿌리에서 털이 많은 뿌리를 얻는 데 약 5주가 걸렸습니다. 그림 1A는 A. rhizogenes 주입부터 털이 많은 뿌리를 가진 복합 식물을 얻기 위한 전체 변형 과정의 개요를 보여주었습니다. 증식 조직은 감염 후 약 1주일 후에 관찰되었고, 외래 뿌리에 대한 분화는 약 2주에 관찰되었으며, 35일에 많은 수의 털이 많은 뿌리가 생성되었습니다(그림 1B). 이 GFP는 형광을 통해 비유전자...

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Discussion

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유전자 기능의 신속한 특성화는 대부분의 종 연구에서 공통된 목표이며 자원 식물의 발달에 특히 중요합니다. A. rhizogenes-mediated transformation은 털이 많은 뿌리 배양에서 널리 사용되었습니다. 대사 산물 생산의 고유한 공급원인 털뿌리 배양(HRC)은 대사 공학에서 중추적인 역할을 합니다18,28. 이 기술의 응용은 주로 생체 내 유전자의 기능에 국한된다 21. 여기에서는 이전의 A. rhizogenes 매개 형질전환 시스템을 기반으로 유전자 기능을 연구하기 위한 기본 방법을 제공합니다. 이 방법은 환경 스트레스에 대한 반응 및 외인성 호르몬과 같은 다양한 유전자 기능을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. CcCIPK14-OE 라인은 ...

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Disclosures

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저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알려진 바가 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

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저자는 중국 국립자연과학재단(31800509, 31922058), 베이징 임업대학 우수 청년 인재 기금"(2019JQ03009), 중앙대학 기초연구기금(2021ZY16), 베이징시 자연과학재단(6212023), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) 및 분자 설계를 통한 나무 육종을 위한 베이징 선진혁신센터의 재정적 지원에 감사를 표합니다. 논문 작성에 도움을 주신 Zhengyang Hou 교수님과 논문 아이디어에 대한 지도를 해주신 Meng Dong 교수님께 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 mL qPCR 8-strip tube (with optical caps)KIRGEN, Shanghai, ChinaKJ2541
ABASolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8060
한천 분말Solarbio Life Science, 베이징, 중국A8190
CentrifugeOsterode am Harz, Germanyd37520
CFX Connect TW Optics ModuleBio-rad, US1855200
항온 인큐베이터Shanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, 상하이, 중국BPX-82
Diposable Petri dishCorning, US
Dry BathGingko Bioscience Company/Coyote bioscience, 중국H2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50Promega, Beijing, ChinaLS1030
전자 저울Tianjin, ChinaTD50020
Filter papeHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy PlusMettler Toledo, Shanghai, China30254105
화분 9*9China
JASolarbio Life Science, 베이징, 중국J8070
KanSolarbio Life Science, 베이징, 중국K8020
MagicSYBR MixtureCWBIO, 베이징, 중국
Mini MicrocentrifugeScilogex, Beijing, ChinaS1010E
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
NanPhotometer N50 TouchIMPLEN GMBH, GermanyT51082
Purelab untra
RifampicinSolarbio Life Science, 베이징, 중국R8010
묘목 상자 30*200중국
열  사이클러  PCRBio-rad, UST100
온도 조절 발진기베이징 동글리안 Har lnstrument 제조 유한 공사, 중국DLHE-Q200
토미 오토클레이브토미, 일본SX-500
트립톤Solarbio 생명 과학, 베이징, 중국LP0042
UEIris II RT-PCR 시스템 1 가닥 cDNA 합성 (dsDNase 포함)US Everbright INC, Jiangsu, 중국R2028
효모 추출물 분말Solarbio Life Science, 베이징, 중국LP0021
CW3008M

References

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