유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

Summary

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

Abstract

수지상 arbors를 패턴화하는 메커니즘을 발견하려면 개발 중에 수상 돌기를 시각화, 이미지 및 분석하는 방법이 필요합니다. 마우스 망막은 신경 형태 형성 및 연결성의 세포 유형 특이적 메커니즘의 조사를 위한 강력한 모델 시스템이다. 망막 아형의 조직과 구성은 잘 정의되어 있으며, 유전 도구는 개발 중에 특정 유형에 접근 할 수 있습니다. 많은 망막 세포 유형은 또한 그들의 수상 돌기 및 / 또는 축삭을 좁은 층으로 제한하여 시간 경과 이미징을 용이하게합니다. 마우스 망막 외래 배양물은 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용한 살아있는 세포 이미징에 매우 적합하지만 시간적 및 구조적 해상도로 수상 돌기 역학을 이미징하는 데 최적화 된 방법은 부족합니다. 여기에 제시된 것은 Cre-Lox 시스템에 의해 표시된 특정 망막 집단의 발달을 희박하게 라벨링하고 이미지화하는 방법입니다. 여기에서 사용되는 상업적으로 입수가능한 아데노-관련 바이러스 (AAVs)는 Cre-의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현한다. 신생아 마우스에서 AAVs의 안구 내 전달은 주사 후 4-5 일 (dpi)에 의해 표적화 된 세포 유형의 형광 표지를 생성합니다. 막 형광 신호는 공초점 이미징으로 검출 할 수 있으며 미세 분지 구조와 역학을 해결합니다. 2-4 시간에 걸친 고품질 비디오는 산소화 된 인공 뇌척수액 (aCSF)이 관류하는 망막 플랫 마운트를 이미징하여 획득합니다. 또한 디컨볼루션 및 3차원(3D) 드리프트 보정을 위한 이미지 후처리 파이프라인도 제공됩니다. 이 프로토콜은 손상되지 않은 망막에서 여러 세포 행동을 포착하고 신경돌기 형태 형성을 조절하는 새로운 요인을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 망막에서 배운 많은 발달 전략은 중추 신경계의 다른 곳에서 신경 회로의 형성을 이해하는 데 관련이 있습니다.

Introduction

망막 뉴런의 덴드라이트는 신경 회로 내에서 기능에 영향을 미치는 복잡하지만 구체적인 패턴을 형성합니다. 척추동물 망막에서 다양한 유형의 망막 신경절 세포(RGCs)와 아마크린 세포 인터뉴런은 arbor 크기, 위치, 가지 길이 및 밀도가 다른 독특한 수지상 형태를 띠고 있습니다¹. 산후 발달 동안, RGCs와 amacrine 세포는 광수용체 신호를 전달하는 양극성 세포 입력을 수신하는 내부 플렉시폼 층 (IPL)이라고 불리는 뉴로필로 풍성한 수지상 과정을 확장합니다². 병아리 또는 제브라피쉬 유충에서 형광으로 표지된 망막 개체군의 타임랩스 영상에 의해 포착된 바와 같이, 수상 돌기 형태형성은 매우 역동적이다^3,4,5. 며칠 내에 수지상 arbors는 IPL의 좁은 하위 계층으로 확장, 리모델링 및 확대되어 일부 파트너와 시냅스합니다. arbors는 개발에 걸쳐 다른 구조적 역학을 나타내며, 지점 추가, 철회 및 안정화의 상대적 비율의 변화와 함께 나타납니다. Amacrine 및 RGC 수상 돌기는 또한 유형 별 수목을 반영 할 수있는 다른 성장 및 리모델링 동작을 나타냅니다. 그러나 이러한 연구는 광범위한 amacrine 또는 RGC 개체군을 추적하고 형태학의 한 측면 인 층류 타겟팅에 중점을 두었습니다.

망막 아형에서 관찰되는 광대한 형태학적 다양성을 생성하는 메커니즘은 잘 이해되지 않는다. 이 그룹의 목적은 수지상 역학을 포착하고 마우스에서 정의 된 망막 아형의 아형을 리모델링하는 방법을 개발하는 것이 었습니다. 수상 돌기 패터닝의 세포 유형 별 메커니즘을 식별하려면 관심있는 세포의 수상 돌기 행동을 시각화하고 측정하는 방법이 필요합니다. 마우스 망막의 유기형 배양은 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용하는 살아있는 세포 이미징 연구에 매우 적합합니다. 개발 중인 망막은 해부되어 평평한 외래편에 장착되며, 이 외식재는 기록 챔버에서 몇 시간 동안 영상화되거나 회로에 제한된 영향을 미치는 며칠 동안 배양될 수 있습니다^6,7. 살아있는 망막 뉴런은 전극에 의한 염료 충전, 전기천공, 형광 단백질을 코딩하는 친유성 염료 또는 플라스미드로 코팅된 입자의 생체목록 전달(예를 들어, 진건) 및 유전적으로 코딩된 세포 표지^7,8,9,10을 포함하는 다양한 기술에 의해 표지될 수 있다. . 그러나, 이러한 접근법은 특정 망막 아류형의 수상 돌기 역학을 이미징하는 데 비효율적이다. 예를 들어, 염료 충전 방법은 처리량이 낮으며 관심있는 세포를 안정적으로 타겟팅하기 위해 전기 생리학 장치 및 추가 유전자 표지가 필요합니다. 더욱이, 소마의 강한 형광 신호는 근처의 덴드라이트를 흐리게 할 수 있다.

생체 목록 유전자 전달 방법은 동시에 수십 개의 세포를 표지 할 수 있지만 고압 입자 전달 및 분리 된 망막의 하룻밤 배양과 관련된 단계는 세포 생리학 및 수지상 증식을 손상시킬 수 있습니다. 이 논문은 최근의 유전 도구를 사용하여 다음과 같은 실험 기준을 고려할 때 세포 유형 및 구조적 분해능으로 초기 수상 돌기 역학을 포착 할 수 있다고 제안합니다. 첫째, 발달하는 arbors를 지배하는 미세한 가지와 filopodia를 해결하기 위해이 방법은 전체 arbor의 과정을 채우는 밝고 형광 단백질로 뉴런을 표지해야합니다. 형광 표지는 이미징 기간 동안 광표백으로 인해 퇴색해서는 안됩니다. 다양한 형광 단백질 변이체가 생성되고 밝기 및 광안정성에 기초한 생체내/생체외 영상^화11에 대한 적합성에 대해 비교되었다. 둘째, 형광 단백질 (XFPs)은 수상 돌기 형태 형성의 초기 단계에 의해 충분히 높은 수준으로 발현되어야하므로 좁은 발달 창을 놓치지 않아야합니다. 마우스 망막의 정적 시간대 분석에서 수상 돌기 발달은 출생 후 첫 주 동안 발생하며 성장, 리모델링 및 안정화 단계를 포함합니다10,12,13,14,15. 셋째, 상기 방법은 선택적 표지 또는 관심있는 뉴런 하위집단의 표지 가능성 증가로 이어져야 한다. 넷째, 표적 하위집단의 표지는 전체 뉴런 아버가 확인되고 추적될 수 있도록 충분히 희박해야 한다. RGC 및 amacrine 아류형은 성숙한 형태학적 특성 및 IPL 계층화 패턴16,17,18,19,20에 의해 구별될 수 있지만^, 과제는 미성숙 구조를 기반으로 개발 중에 아형을 식별하는 것이다. 이 작업은 개발 중에 특정 망막 세포 유형을 표지하는 트랜스제닉 도구의 확장에 의해 촉진됩니다.

형광 단백질 또는 Cre의 세포 및 시간적 발현이 유전자 조절 요소에 의해 결정되는 형질전환 및 녹-인 마우스 라인은 망막 세포 유형^13,21,22,23을 연구하는데 널리 사용된다. 수상 돌기 발달의 아형 특이적 패턴에 대한 주요 관찰은 정적 시점 ^10,14,24,25에서 트랜스제닉 마우스 망막에 대한 연구에서 나왔다. 특히 Cre-Lox 시스템은 다양한 재조합효소 의존성 리포터, 센서 및 광유전학적 활성화제를 사용하여 아형의 절묘한 유전자 조작 및 모니터링을 가능하게 한다. 이러한 도구는 망막 회로 어셈블리의 기초가되는 아형 특정 분자 프로그램 및 기능적 특성의 발견으로 이어졌습니다.26,27,28,29,30. 그러나, 그들은 아직 마우스 망막에서 아형 특이적 수상 돌기 역학을 연구하는 데 활용되지 않았습니다. 저밀도 표지는 Cre 마우스 라인을 전기천공 또는 재조합 AAVs에 의해 도입된 전이유전자와 조합함으로써 달성될 수 있다. 이용 가능한 경우, 타목시펜-유도성 Cre 라인 또는 교차 유전자 전략이 또한 사용될 수 있다. 마지막으로, 세포는 최소 침습적 방식으로 표지되어야 하고, 조직을 손상시키거나 수상 돌기 형태형성에 필요한 세포 기능을 방해하지 않도록 획득 파라미터를 사용하여 영상화되어야 한다.

여기에 제시된 방법은 살아있는 마우스 망막 외식편에서 수상 돌기 역학을 조사하기 위해 트랜스제닉 도구 및 공초점 현미경을 적용하는 방법이다. Cre 트랜스제닉 마우스 라인은 Cre 재조합시 형광 단백질을 발현하는 AAV 벡터와 결합되었으며, 이는 관심있는 망막 세포의 희소 표지를 허용한다. 상업적으로 이용가능한 AAVs는 유리체내 주사에 의해 신생아 망막으로 전달된다. 이 논문은 AAV가 4dpi만큼 상당히 높고 세포 유형 별 형광 발현을 생성하여 출생 후 시점에 액세스 할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 접근법을 예시하기 위해, 콜린성 "스타버스트" 아마크린 인터뉴런은 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT)-내부 리보솜 진입 부위 (IRES)-Cre 전이유전자를 발현하는 신생아 마우스에 Brainbow AAV를 전달함으로써 표지되었으며, 이는 산후 망막^31,32에서 활성화된다. 스타버스트 아마크린 세포는 군집된 프로토카데린^33,34에 의해 매개되는 수상 돌기 자기 회피에 의해 형성되는 고정관념 및 방사형 아버 형태를 개발한다. 이 논문은 Brainbow ^AAVs31에 사용되는 파네 실화를 겪는 CAAX 모티프를 추가하여 XFPs에 의해 원형질막에 스타 버스트 수상 돌기 및 필로 포디아의 해상도가 크게 향상되었음을 보여줍니다. 마지막으로, 타임랩스 이미징 및 후처리 프로토콜은 수상 돌기 재구성 및 형태 정량화에 적합한 고품질 이미지를 생성하는 것으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 수상 돌기 형태 형성을 조절하는 요인을 확인하고 손상되지 않은 망막에서 여러 세포 행동을 포착하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜은 실험일 사이의 바이러스 형질도입에 대해 최소 4-5일의 기간으로 2일에 걸쳐 있습니다(그림 1A). 동물 실험은 아픈 어린이를위한 병원 (토론토, 캐나다)의 동물 서비스 동물 사용 및 관리위원회의 실험실에서 승인 한 프로토콜에 따라 연구 및 실험실 동물 관리에서 동물 사용에 대한 캐나다 동물 관리 지침에 따라 수행됩니다.

1. 신생아 AAV 주사 및 영상 실험을위한 준비

1. Cre 마우스 라인을 선택하여 관심 있는 망막 세포 집단에 라벨을 붙입니다. AAV 주사시의 Cre 재조합효소 발현을 Cre 트랜스제닉 리포터로 교차시키거나 Cre 항체로 면역염색을 통해 확인하였다.
2. Cre 양성 형질전환 마우스(8-16주령)를 번식시켜 Cre 양성 신생아 동물을 생성한다.
   참고: 이 데모를 위해, ChAT-IRES-Cre 넉-인 마우스를 콜린성 스타버스트 아마크린 세포를 표적으로 삼기 위해 사용하였다.
3. 재조합효소-의존성 형광 단백질(들)을 코딩하는 AAV 바이러스를 얻는다. 미세 공정의 최적 라벨링을 위해, 원형질막을 표적화하는 수정된 XFP를 발현하는 벡터를 선택하십시오.
   참고: 이 연구에서는 Brainbow 바이러스(BBV), AAV-EF1a-BbTagBY 및 AAV9-EF1a-BbChT(자료표 참조)를 사용하여 다색 라벨링 옵션을 제공했습니다(그림 1B). 파네실화 강화된 황색 형광 단백질(eYFP) 및 단량체성 체리(mCherry) 발현은 라이브 이미징을 위한 가장 강력한 형광 신호를 생성하였다. 단일 BBV를 사용하여 개별 arbors를 이미징 할 수 있으며, BBV의 공동 주입을 사용하여 더 많은 세포 또는 이웃 arbors를 뚜렷한 형광단으로 표지 할 수 있습니다. 여러 형광 단백질을 사용하는 경우 최소 방출 스펙트럼 중첩을 보장하십시오(그림 1C). 현미경 수집 파라미터는 별개의 XFP 신호를 캡처하도록 조정되어야 합니다.
4. 동결 / 해동 사이클을 피하기 위해 일회용 스톡을 위해 개별 저결합 튜브에 AAV의 ∼3-5 μL 분취량을 준비하십시오. -80°C에서 보관한다.
5. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 매우 미세한 팁이있는 붕규산 유리 마이크로 피펫을 준비하십시오.
   참고: 풀러 설정은 사용 중인 필라멘트와 풀러에 따라 다릅니다. 최종 팁 크기 및 모양에 대해서는 그림 2A 를 참조하십시오. 전형적인 액적 직경은 600 μm이다.
6. 미세주입 시스템 및 관련 튜브를 얻는다. 미세 인젝터를 가압 공기 포트에 연결합니다.

그림 1: 실험 개요 . (A) 이 프로토콜은 실험 일 사이에 최소 4-5일의 감염 기간을 갖는 실험 2일에 걸쳐 있다. 안구 내 주사는 산후 3 일째보다 오래되지 않은 신생아 마우스에서 수행됩니다. 그런 다음 망막을 해부하고, 평평하게 장착하고, 원하는 발달 창을 캡처하기 위해 라이브 이미지를 촬영합니다. 라벨링된 세포는 수지상 형태학에 대한 장기간의 AAV 발현의 명백한 효과가 없기 때문에 바이러스 발현에 필요한 4-5일 후에 언제든지 영상화될 수 있다. (b) Cre-의존성 Brainbow AAV 벡터 (BBV)를 ^Cre31을 발현하는 동물에 주사한다. 이 연구에서, ChAT-Cre 넉-인 마우스는 스타버스트 아마크린 세포에서 Cre 재조합을 유도하기 위해 사용되었다. 두 BBV는 수정된 eYFP 또는 tagBFP 또는 mCherry 및 mTFP를 인코딩하며, 이는 막 국소화를 위해 순차적으로 파네실화되는 CAAX 모티프에서 종료됩니다. Lox 사이트는 삼각형으로 표시됩니다. 벡터는 Cre 재조합에 의존하는 확률적 및 조합적 방식으로 파네실화된 XFP를 발현한다. EF1α 프로모터는 신장인자 1α 유전자로부터의 조절 요소를 포함한다. W는 우드척형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소로부터의 요소를 나타내고, pA는 폴리아데닐화 서열을 나타낸다. (c) mCherry 및 eYFP의 여기 및 방출 스펙트럼, BBV 형광단이 본 연구에서 이미지화되었다. 다중 형광 단백질을 생중계할 때, 검출 파라미터는 방출 스펙트럼을 별개의 채널로 적절히 분리하도록 배열되어야 한다. 약어: AAV = 아데노-관련 바이러스; BBV = 브레인보우 AAV; ChAT = 콜린 아세틸트랜스퍼라제; iRES = 내부 리보솜 입력 사이트; eYFP = 강화된 황색 형광 단백질; iTR = 거꾸로 된 단말 반복; tagBP = 태그-블루 형광 단백질; mCherry = 단량체 체리; mTFP = 청록색 형광 단백질; XFP = 임의의 형광 단백질; EF1α= 신장률 1 알파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 신생아 마우스에서 AAVs의 유리체내 주사

1. 얼음 위에서 AAV 분취량을 해동하십시오. 멸균 식염수 또는 인산염 완충 식염수를 사용하여 ∼1:4 AAV 희석액을 준비한다. 마이크로 피펫이 파손되고 새로운 피펫을 채워야 할 경우를 대비하여 동물 당 ~ 0.5 μL (눈 당 ~ 0.25 μL)의 AAV 희석액을 준비하십시오. 나머지 희석되지 않은 AAV를 4°C에서 보관하고, 2주 이내에 사용한다.
   참고: 이 실험에서 공급업체 AAV 농도는 1013 게놈 함량(GC)/mL× ~^1-2 였으며 최종 농도 4 × ¹⁰¹² GC/mL로 희석하였다. 원하는 라벨링 밀도를 얻기 위해 바이러스 농도를 최적화한다.
2. 주사제를 시각화하려면 AAV 희석액 15μL마다 약 1μL의 0.02% Fast Green FCF 염료 용액을 첨가하여 용액을 파란색으로 채색합니다.
3. 댐과 신생아 깔짚이있는 마우스 케이지 (출생 후 일 (P) 0.5-3)를 미세 주입 장비가있는 수술실로 옮깁니다. 모성 스트레스와 강아지의 거부를 최소화하기 위해 둥지와 침구가있는 같은 새장에 동물을 보관하십시오.
4. 70 % 에탄올로 주사 부위를 살균하고 벤치 표면에 멸균 기저귀 패드를 놓습니다. 저체온증으로 인한 마취로부터의 회복을 위해 따뜻한 플랫폼 (예를 들어, 가열 패드)을 준비하십시오.
5. 마이크로사이린지를 사용하여 AAV 희석액으로 마이크로피펫을 백필한다. 입체 현미경으로 마이크로 피펫 팁을 30G 바늘로 부수어 팁을 밀봉 해제하십시오.
   참고: 그림 2A는 밀봉된 팁(상단)과 밀봉되지 않은(중간) 백필 팁을 모두 보여줍니다.
6. 얼음 위에 1-2 마리의 동물을 배치하여 저체온증에 의한 신생아 생쥐를 마취하십시오. 동물을 라텍스 장갑에 올려 놓고 얼음과 직접 접촉하지 않도록 피부를 보호하십시오. 동물이 발 꼬집음 (~ 2 분)에 반응하여 더 이상 움직이지 않으면 동물을 입체 현미경으로 놓습니다. 원하는 경우, 문신 잉크와 30G 바늘이있는 문신 발 패드를 사용하고 DNA 분리를위한 꼬리 클리핑을 수집하여 유전자형으로 동물을 식별합니다.
   참고 : 마취 깊이의 적절한 모니터링은 절차 전반에 걸쳐 이루어져야합니다.
7. 70 % 에탄올로 눈 위에 놓인 피부를 면도합니다. 30G 바늘을 사용하여 융합된 눈꺼풀을 엽니다(그림 2B). 손가락으로 가벼운 압력을 가하여 눈을 뜨고 각막-공막 접합부에서 각막을 통해 작은 구멍을 뚫습니다(그림 2C).
8. 유리 마이크로 피펫을 구멍에 넣고 마이크로 인젝터 풋 페달을 2-4 번 눌러 AAV를 유리체내 공간에 주입하십시오. 마이크로피펫을 천천히 제거하고, 동공을 통해 청색 염료를 시각화하여 AAV 주입을 확인하였다(도 2D).
   참고: 토출 압력이 6-8psi이고 펄스 시간이 600-800ms인 경우 직경 600μm의 액적이 배출됩니다(그림 2A, 하단). 대략 0.23-0.45 μL의 AAV 용액이 눈 당 주입된다. 눈 밖의 파란 용액은 AAV가 눈에 주입되지 않았음을 나타낸다. 주입 부위로부터 누출된 청색 용액은 AAV가 유출되었을 수 있음을 나타내며, 트랜스펙션 효율을 감소시킨다.
9. 눈꺼풀을 부드럽게 눌러 다시 밀봉하고 강아지를 가열 된 패드에 놓습니다. 동물들이 분홍빛을 띤 색을 회복하고 반응하면 부드럽게 다시 하우징 케이지로 옮깁니다.
   참고 : 강아지의 너무 빠른 재온난화를 피하기 위해 적절한 예방 조치를 취하십시오.
10. 깔짚에 남아있는 동물에 대해 주사 절차를 반복하십시오. 망막을 영상화하기 전에 바이러스 형질도입을 위해 최소 4-5일을 허용하십시오.

그림 2: 신생아 안구 내 주사 . (A) 백필 마이크로피펫은 밀봉되었을 때(상단) 피펫 팁과 팁이 밀봉되지 않은 후(하단, 왼쪽)의 모양을 보여줍니다. 6-8 psi의 피코 주입 압력 및 600-800 ms의 펄스 시간은 600 μm 직경의 액적(하단, 오른쪽)을 생성한다. 스케일 바 = 1mm.(B) 16x 배율로 마취된 P0 강아지. 융합된 눈꺼풀 접합부(흰색)는 날카로운 30G 바늘을 사용하여 슬릿 개방됩니다. 스케일 바 = 2 mm. (C) 눈에 가해지는 가벼운 압력이 각막을 노출시킨다; 스케일 바 = 2mm. 확대 섹션(적색)은 30 G 바늘로 생성된 각막-공막 접합부(노란색)에서의 작은 구멍을 나타내고; 스케일 바 = 0.5 mm. (D) 주입 후 피펫 팁의 철수 (왼쪽). AAV 용액 중의 빠른 녹색 염료는 주사 전의 밝은 동공 색과 비교하여 동공 (중간)을 통해 청색 회색으로 나타납니다 (오른쪽). 스케일 바 = 1 mm. (E) 4 일 후, 눈꺼풀이 치유되고 융합되어 닫혔습니다 (왼쪽); 스케일 바 = 2mm. enucleation시, 치유 된 주사 부위가 보입니다 (노란색); 스케일 바 = 1mm. 각막과 공막 사이의 경계에있는 주사 부위의 위치를 주목하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 영상화 실험을 위한 망막 박리

1. 망막 aCSF (119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2·6H2O, 2.5 mM _CaCl2·_2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM 글루코스, 및 20 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES 유리산)³⁵를 준비한다. 원하는 경우 10x 용액을 준비하고 동결하십시오. 해동하고 필요에 따라 1x로 희석하십시오.
2. 최소 15분 동안 카르보겐(95% O2, 5% _CO2)으로 버블링하여 망막 aCSF를 산소화합니다. pH를 7.4로 조정한다. aCSF가 산소화된 상태로 유지되도록 사용할 때까지 밀봉된 용기에 보관하십시오.
   참고: 망막은 고농도의 _O2가 필요합니다. 실험 전반에 걸쳐 aCSF를 산소화시키는 것이 중요하다.
3. 직경 60mm 페트리 접시를 얼음 쟁반에 넣고(실험실 플라스틱, 예를 들어 피펫 상자 뚜껑과 같은 얼음 트레이를 만들어 내고) 입체 현미경 아래에 놓습니다. 페트리 접시에 산소가 공급된 망막 aCSF를 채우십시오.
4. P9 이하의 마우스를 감금으로 안락사시킨다. P10 이상의 마우스를 이소플루란 유도, 또는 동물 프로토콜에 따라 승인된 대체 방법으로 안락사시키고, 이어서 감금시킨다.
5. 눈꺼풀이 밀폐 된 경우 눈꺼풀 플랩을 잘라 눈을 노출시킵니다. 포셉을 사용하여 눈을 감싸고 3.3 단계에서 차가운 망막 aCSF로 옮깁니다.
6. 망막 컵을 해부하기 위해 입체 현미경 (배율 25x)으로 Dumont # 5 포셉을 사용하여 시신경을 움켜 쥐어 눈을 안정시킵니다 (그림 3A).
7. 30G 바늘로 각막 중앙에 구멍을 뚫은 다음 미세 가위의 한쪽 끝을 구멍에 삽입하여 구멍에서 각막 끝까지 절개하십시오. 반복하여 기본 방향으로 4개의 슬라이스를 만들고 4개의 "플랩"을 만듭니다(그림 3A).
8. 두 개의 Dumont # 5 포셉으로 인접한 두 개의 플랩을 잡고 당겨 망막에서 공막을 부드럽게 벗겨냅니다. 나머지 각막 플랩을 반복하고 망막에서 공막을 제거합니다 (그림 3B).
9. 포셉을 사용하여 망막 컵에서 렌즈를 제거하십시오. 미세가위를 사용하여 망막 가장자리에서 시신경쪽으로 4개의 방사상 절개를 만들어 4개의 동일한 꽃잎을 만듭니다(그림 3B). 두 번째 눈에 대해 3.4-3.7단계를 반복합니다.

4. 망막 플랫 마운트 준비

1. 그레이 혼합 셀룰로오스 에스테르(MCE) 멤브레인 필터 디스크를 장착할 준비를 합니다. 직경이 큰 MCE 멤브레인 필터를 사용하는 경우 디스크를 사분면(가로 약 1cm)으로 자릅니다. MCE 디스크를 더 큰 흰색 필터 용지의 중앙에 놓습니다(그림 3D).
   참고: MCE 필터는 직경 1cm 디스크로도 제공됩니다. MCE 필터 디스크는 1-2개의 망막에 맞을 만큼 충분히 커야 하지만 이미징 챔버에 들어갈 수 있을 만큼 충분히 작아야 합니다. MCE 멤브레인은 정적 전하를 유지하므로 MCE 멤브레인의 접촉 및 취급을 최소화합니다.
2. 두 개의 크기 3/0 페인트 브러시를 사용하여 망막을 다루고, 망막 신경절 세포 측면을 아래로 향하게하여 하나의 망막 컵을 페인트 브러시에 뒤집습니다. aCSF에서 망막을 부드럽게 들어올려 물의 장력이 망막을 찢지 않도록 합니다(그림 3C).
3. 망막이 있는 페인트브러시를 계속 잡고 있는 상태에서 전사 피펫을 사용하여 MCE 필터 용지의 중앙에 aCSF 방울을 놓습니다(그림 3C, 오른쪽). 망막을 표면 장력에 의해 생성 된 aCSF의 물방울로 띄우십시오. 페인트 브러시를 사용하여 망막 RGC 측면을 물방울 안에 올려 놓고 네 개의 꽃잎을 펼칩니다.
4. 일단 위치하면, 물방울의 표면 장력을 깨기 위해 페인트 브러시와 흰색 여과지 사이에 물 다리를 만듭니다.
   참고: aCSF가 사악해지면 망막이 MCE 여과지에 부착됩니다(그림 3D,E). 플랫 장착형 망막은 집게로 MCE 디스크를 잡아서 처리할 수 있습니다. aCSF 액적이 워터 브릿지를 형성하기 전에 빠르게 윅 오프되는 경우, 이는 MCE 멤브레인이 충전되지 않았음을 나타낼 수 있다. 신선한 MCE 멤브레인을 사용하고, 망막을 이미징 챔버로 이동시키기 직전에 망막을 해부하고 평평하게 장착하여 응상과 이미징 사이의 시간을 최소화하십시오.

그림 3: 망막 박리 및 혼합 셀룰로오스에스테르 필터 멤브레인 상에 평평하게 장착. (A) 왼쪽, 두몬트 #5 포셉으로 시신경을 움켜쥐면 둘러싸인 눈이 안정화됩니다(왼쪽). 30G 바늘 (중앙)을 사용하여 각막의 중앙에 작은 구멍이 생깁니다. 마이크로 해부 가위는 각막을 4 개의 동일한 플랩으로 자르는 데 사용됩니다 (오른쪽). 스케일 바 = 1mm. (B) 두 개의 Dumont #5 포셉(왼쪽)을 사용하여 공막이 벗겨지고 렌즈를 제거한 상태로 망막을 해부했습니다(가운데). 망막에 4 개의 동일한 절단이있는 망막 (오른쪽). 스케일 바 = 1mm. (C) 두 개의 미세한 페인트 브러시로 망막 처리 (크기 3/0, 왼쪽). 망막은 망막 신경절 세포를 페인트 브러시 (중앙)로 옆으로 뒤집어 aCSF에서 들어 올려 물 긴장이 망막을 찢지 않도록했습니다 (오른쪽). 스케일 바 = 2mm. (D) 회색 MCE 멤브레인 디스크를 흰색 여과지 위에 놓습니다(왼쪽). MCE 디스크의 aCSF 방울(오른쪽). 스케일 바 = 1cm. (E) 망막을 액적 내로 부유시키고 위치시킨 후, aCSF를 윅하기 위해 흰색 여과지로 물 다리를 만들고, 대전된 MCE 종이 위로 망막을 당기는 단계(왼쪽); 스케일 바 = 1cm. MCE 막의 확대/축소된 이미지(적색)는 망막 신경절 세포가 측면 위쪽(오른쪽)으로 장착된 2개의 망막을 보여준다; 스케일 바 = 2mm. 하나의 망막은 흰색으로 윤곽선이 그려져 있습니다. 약어: MCE = 혼합 셀룰로스 에스테르; aCSF = 인공 뇌척수액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 살아있는 전체 마운트 망막 제제의 타임랩스 공초점 영상

1. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 직립 공초점 현미경을 위한 라이브 이미징 인큐베이션 챔버를 조립한다.
   주: 거꾸로 된 공초점 시스템의 경우, 플랫 마운트는 RGC 측면을 인큐베이션 챔버의 유리 바닥 커버슬립에 직접 배치합니다. 망막이 커버 슬립과 접촉하면 움직일 수 없습니다.
2. 챔버를 산소화 된 aCSF로 채우고 펌프 및 온도 컨트롤러 (온도 32-34 °C, 유량 1 mL / 분)를 켭니다. 온도가 34°C 이상으로 상승하지 않도록 하십시오.
3. 망막 플랫 마운트를 관류 챔버로 옮기려면 펌프를 정지시키고 챔버 내에 있는 aCSF를 제거합니다. 망막 플랫 마운트가 있는 MCE 디스크를 (비어있는) 인큐베이션 챔버 내로 놓으십시오.
4. 샘플 중량을 플랫 마운트 상에 놓는 단계; 표면 장력을 깨기 위해 무게를 미리 적시십시오. 따뜻하게 된 aCSF로 챔버를 채우고 ~ 1 mL / min에서 aCSF를 순환시킵니다.
5. 25x 물 담그기 목표물(숫자 조리개 0.95)이 있는 노즈피스를 이미징 챔버에 놓습니다. 에피형광광을 사용하여 관심있는 표지된 세포를 스크린한다(도 4C).
6. 이미징 볼륨을 조정하여 관심 있는 수지상 특징을 캡처합니다.
   참고: 이 연구는 프레임당 1024 x 1024 픽셀, z-스텝 1 μm 및 각 z-스택 사이의 프레임 속도 2분으로 전체 수지상 아버를 캡처했습니다. 최종 이미지 크기는 ~100μm x 100μm x 20μm입니다.
7. 레이저 파워를 최적의 설정으로 조정하려면 과포화 픽셀과 과포화 픽셀을 모두 식별하는 룩업 테이블을 사용하십시오. 스캔하는 동안 픽셀이 과포화되지 않도록 레이저 파워를 조정하십시오 (즉, 255 이상의 강도에서). 필요한 한, 또는 형광 신호의 현저하고 검출 가능한 감소가 있고 잡음이 증가할 때까지(전형적으로 2-4 h) 이미징을 계속한다.
   참고: 픽셀이 전체 동적 범위에 분산될 때 디컨볼루션 알고리즘이 최적으로 작동하므로 레이저 전력 감소를 권장합니다. 픽셀 강도는 254를 초과해서는 안됩니다. 신경돌기의 경험적 분석은 170 미만의 픽셀 값이 디컨볼루션에 이상적이라는 것을 밝혀냈다. 라인 평균화(2-3)를 갖는 빠른 스캔 속도(400-600Hz)는 동일한 총 픽셀 체류 시간의 느린 단일 스캔보다 바람직하다. 장기간의 이미징 영역은 종종 광표백제이지만 다른 explant 섹션은 실행 가능한 상태로 남아 있습니다. 플랫 마운트의 여러 영역을 각각 2-4시간 동안 이미지화할 수 있으며, 총 인큐베이션 시간은 6시간입니다. 6 시간 이상의 이미징 세션은 체계적으로 테스트되지 않았습니다. 신경돌기 분해와 출혈은 외래 생존력이 감소하고 있다는 신호입니다.
8. 이미징 후, 망막 플랫 마운트 및 멤브레인 필터를 차가운 4% 파라포름알데히드로 4°C에서 1-2시간 동안 고정시킨다. 추가 분석을 위해 면역조직화학에 의해 고정된 망막의 형광 표지를 증폭시킨다.
   참고: 반전된 공초점 사용 시에는 이미징 후 고정이 불가능합니다. 망막은 조직을 파괴하지 않고 제거 할 수 없습니다.

그림 4: 라이브 셀 이미징 인큐베이션 챔버 설정. (A) 가열, 용액 및 이미징 성분을 보여주는 라이브 이미징 인큐베이션 장치. 이중 히터에는 가열 된 인큐베이션 챔버 플랫폼 (파란색 커넥터 전극이있는 백 서클) 및 인라인 솔루션 히터가 포함됩니다. (B) 4A의 개략도. MCE 멤브레인 상의 망막 플랫-마운트(적색)(회색)는 인큐베이션 챔버 내에 배치된다. 인라인 솔루션 히터는 솔루션 펌프에 연결됩니다 (4A에 그림이 없음). 이미징 챔버 치수는 담그기 목표 코에 대한 좋은 작업 영역을 허용합니다. (c) AAV 희석액의 ¹⁰¹² GC/mL의 4 × 0.23-0.45 μL를 주사한 망막 외식편을 25x 뷰; 스케일 바 = 100 μm. 세포의 조밀 한 표지는 종종 시신경 머리 (파선, 오른쪽 하단)를 둘러 쌉니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: MCE = 혼합 셀룰로스 에스테르; GC = 게놈 카피; mCherry = 단량체 체리; eYFP = 강화된 황색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. ImageJ의 이미지 디컨볼루션 및 후처리

1. 이미지 시리즈를 가져오고, 시리즈를 시간별로 분할하고, 다중 색상 이미지인 경우 색상을 지정합니다. 한 색상에 대한 모든 시점이 동일한 폴더에 포함되어 있는지 확인합니다.
   참고: ImageJ를 사용하는 경우 바이오 포맷을 가져옵니다(바이오 포맷은 FIJI에 자동으로 포함됨).
2. ImageJ 플러그인인 회절 PSF 3D를 사용하여 이론적인 PSF(포인트 확산 함수)를 생성합니다.
   참고: 형광 단백질 방출 파장이 PSF에 영향을 미치기 때문에 각 이미징 채널에는 자체 PSF가 필요합니다.
3. 플러그인 사용 | 매크로 | 제공된 매크로(보충 파일 1)를 사용하여 모든 시간대에 대해 배치 병렬 반복 디컨볼루션을 수행하도록 실행합니다.
   참고: 이 매크로는 Wiener 필터 사전 조건화된 Landweber(WPL) 반복 알고리즘의 25회 반복을 실행합니다. 각 색상 채널은 별도로 디컨볼루브해야 합니다.
4. 색상 채널을 병합하고 모든 시점을 하이퍼스택으로 컴파일합니다(이미지 | 하이퍼스택 | 하이퍼스택에 스택). 플러그인 |를 사용하여 3D 드리프트를 수정하십시오 . 등록 | 3D 드리프트를 수정합니다.
5. 이미지를 일반 스택으로 반환합니다 (이미지 | 하이퍼스택 | 하이퍼스택을 스택으로 전환하고 시점을 분할합니다(이미지 | 스택 | 도구 | 스택 분배기). 배치 처리를 사용하여 모든 시점에 대한 최대 투영 생성(프로세스 | 배치 | 매크로 | run("Z 프로젝트...", "투영=[최대 강도]");
6. 타임랩스 이미지 시퀀스 가져오기(파일 | 가져오기 | 이미지 시퀀스). 기존 ImageJ 도구를 사용하여 디컨볼브 및 후처리 2차원(2D) 비디오를 원하는 방식으로 분석할 수 있습니다.
   참고: 4차원(3D + 시간) 디컨볼브 및 드리프트 보정 비디오는 하이퍼스택으로 볼 수 있습니다. 3D 시점을 유지하기 위해 이전 단계를 생략합니다.

Results

위의 프로토콜을 사용하여 스타버스트 셀 수상 돌기를 개발하는 고해상도 3D 비디오를 획득, 디컨볼브 및 3D 드리프트에 맞게 수정했습니다. Z-평면 최대 프로젝션은 분석을 위한 2D 비디오를 만들기 위해 제작되었다(보충 비디오 1, 도 5A). 각 시점의 3D 디컨볼루션은 미세한 필로포디아 투영의 분해능을 증가시켰다(그림 5B,C). 미세한 필로포디아 돌출부는 망막 덴드라이트^36을 개발하는 특징이며 이미징 중에 볼 수 있어야 합니다. AAV 형질감염은 세포 표지 밀도 및 형광 강도에서 가변성을 생성할 것이다. 따라서 표지 된 조직을 선별하여 형광 신호가 높은 세포를 선택하여 이미징하고 고품질 비디오를 제작하십시오. 희미하게 라벨이 붙은 세포를 감지하기 위해 레이저 파워를 증가시키는 것은 빠른 광표백을 유도하고 신호에 비해...

Discussion

이 비디오는 기존의 유전 도구를 사용하여 공초점 라이브 이미징으로 망막 뉴런을 개발하는 수상 돌기 역학을 이미지화하는 실험 파이프 라인을 보여줍니다. 또한 신생아 마우스에 막 표적화된 형광 단백질을 코딩하는 Cre 의존성 AAVs의 안구 내 주사가 입증되었다. 유전적으로 표적화된 집단의 단일 세포는 4-5 dpi만큼 일찍 밝게 표지된다. 망막 플랫-마운트는 라이브 셀 공초점 이미징을 수행하기 위해 표준 이미징 챔버를 위해 준비되었다. 이 방법은 단일 셀과 미세한 투영에 대한 고해상도 타임랩스 비디오를 생성합니다. 작은 프로젝션은 ImageJ, Vaa3D 및 ShuTu를 포함한 오픈 소스 소프트웨어와 Imaris 및 MBF Bioscience에서 제공하는 라이센스 소프트웨어를 통해 제공되는 디컨볼루션 및 후처리 알고리즘을 사용하여 해결되고 정량화됩니다. 이 파이프라인은 모듈식이므로 각 프로토콜 섹션은 연구 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 이들 모듈화 요소는 아래에서 논의되며, 1) Cre-line 선택, 2) 형광 단백질 및 바...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Addgene 바이러스 준비 #45185-AAV9
Addgene 바이러스 준비 #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper	Whatman	1001-070
Dumont #5 fine uncps	FST	11252-20	망막 미세 박리를 위해 두 개의 Dumont #5 집게 필요
Dumont 집게	VWR	82027-426
미세 가위	FST	14058-09
혼합 셀룰로오스 에스테르 막 (MCE) 여과지, 친수성, 0.45 &마이크로; m pore size	Millipore	HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm	VWR	470313-352
폴리에틸렌 일회용 전송 피펫	VWR	470225-034
라운드 팁 페인트 브러시, 크기 3/0	일반 미술 용품점		레티날 플랫 마운팅 수술용 가위 FST를 위해 두 개의 크기 3/0 페인트 브러시 (또는 그 이하)가 필요합니다
.		14007-14
Vannas 스프링 가위 - 2.5 mm 커팅 엣지	FST	15000-08
live-imaging incubation system
chamber 폴리에틸렌 튜빙, PE-160 10'Warner	Instruments	64-0755
듀얼 채널 히터 컨트롤러, 모델 TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 디핑 대물	Leica	15506374
히터 컨트롤러 케이블	Warner Instruments	CC-28
슬라이스 지지대가 있는 대형 욕조 배양 챔버	Warner Instruments	RC-27L
MPII 미니 연동 펌프	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D 자기 가열 플랫폼(인큐베이션 챔버 히터)	워너 인스트루먼트	PM-6D
펌프 헤드 튜빙 피스 MPII 미니 연동 펌프용	하버드 장치	55-4148
샘플 앵커 (하프)	워너 인스트루먼트	64-0260	샘플 앵커는 인큐베이션 챔버와 호환되어야 합니다
Sloflo 인라인 솔루션 히터	워너 인스트루먼트	SF-28
Neonatal Injections
10 &마이크로; L 마이크로리터 주사기 시리즈 700, 탈착 가능한 바늘	Hamilton Company	80314
30 G 피하 주사 바늘 (0.5 인치)	BD PrecisionGlide	305106
4 인치 얇은 유리 모세관, 필라멘트 없음 (1.0 mm 외경/0.75 mm)	WPI World Precision Instruments	TW100-4
에탄올 99.8% (이중 증류수 [ddH2O]로 70%로 희석)	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	펜 벡터 코어	AV-9-PV2453	애드진 플라스미드 #45185
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vector Core	AV-9-PV2454	Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in 형질전환 마우스 라인	The Jackson Laboratory	6410
Fast Green FCF 염료 함량 ≥ 85 %	Sigma-Aldrich	F7252-25G
화염/갈색 마이크로피펫 풀러, 모델 P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
녹색 문신 페이스트	Ketchum MFG Co	329A
인산염 완충 식염수, pH 7.4, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합	Sigma-Aldrich	806552
Pneumatic PicoPump	WPI World Precision Instruments	PV-820
Oxygenated artifial cerebrospinal fluid (aCSF) 시약
염화칼슘 이수화물 (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)	AirGas	X02OX95C2003102공급	업체는 지역에 따라 다를 수 있습니다
-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES, Free Acid	Bio Basic	HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
염화마그네슘 육수화물(MgCl2· 6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670
pH-Test strips (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
염화칼륨(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
염화나트륨(NaCl)	Bio Basic	DB0483
인산나트륨 일염기성(NaH2PO4)	시그마-알드리치	RDD007
Software
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	오픈 소스