Method Article

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

DOI:

10.3791/62308

⸱

March 19th, 2021

 , 
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수지상 arbors를 패턴화하는 메커니즘을 발견하려면 개발 중에 수상 돌기를 시각화, 이미지 및 분석하는 방법이 필요합니다. 마우스 망막은 신경 형태 형성 및 연결성의 세포 유형 특이적 메커니즘의 조사를 위한 강력한 모델 시스템이다. 망막 아형의 조직과 구성은 잘 정의되어 있으며, 유전 도구는 개발 중에 특정 유형에 접근 할 수 있습니다. 많은 망막 세포 유형은 또한 그들의 수상 돌기 및 / 또는 축삭을 좁은 층으로 제한하여 시간 경과 이미징을 용이하게합니다. 마우스 망막 외래 배양물은 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용한 살아있는 세포 이미징에 매우 적합하지만 시간적 및 구조적 해상도로 수상 돌기 역학을 이미징하는 데 최적화 된 방법은 부족합니다. 여기에 제시된 것은 Cre-Lox 시스템에 의해 표시된 특정 망막 집단의 발달을 희박하게 라벨링하고 이미지화하는 방법입니다. 여기에서 사용되는 상업적으로 입수가능한 아데노-관련 바이러스 (AAVs)는 Cre-의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현한다. 신생아 마우스에서 AAVs의 안구 내 전달은 주사 후 4-5 일 (dpi)에 의해 표적화 된 세포 유형의 형광 표지를 생성합니다. 막 형광 신호는 공초점 이미징으로 검출 할 수 있으며 미세 분지 구조와 역학을 해결합니다. 2-4 시간에 걸친 고품질 비디오는 산소화 된 인공 뇌척수액 (aCSF)이 관류하는 망막 플랫 마운트를 이미징하여 획득합니다. 또한 디컨볼루션 및 3차원(3D) 드리프트 보정을 위한 이미지 후처리 파이프라인도 제공됩니다. 이 프로토콜은 손상되지 않은 망막에서 여러 세포 행동을 포착하고 신경돌기 형태 형성을 조절하는 새로운 요인을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 망막에서 배운 많은 발달 전략은 중추 신경계의 다른 곳에서 신경 회로의 형성을 이해하는 데 관련이 있습니다.

Introduction

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망막 뉴런의 덴드라이트는 신경 회로 내에서 기능에 영향을 미치는 복잡하지만 구체적인 패턴을 형성합니다. 척추동물 망막에서 다양한 유형의 망막 신경절 세포(RGCs)와 아마크린 세포 인터뉴런은 arbor 크기, 위치, 가지 길이 및 밀도가 다른 독특한 수지상 형태를 띠고 있습니다1. 산후 발달 동안, RGCs와 amacrine 세포는 광수용체 신호를 전달하는 양극성 세포 입력을 수신하는 내부 플렉시폼 층 (IPL)이라고 불리는 뉴로필로 풍성한 수지상 과정을 확장합니다2. 병아리 또는 제브라피쉬 유충에서 형광으로 표지된 망막 개체군의 타임랩스 영상에 의해 포착된 바와 같이, 수상 돌기 형태형성은 매우 역동적이다3,4,5. 며칠 내에 수지상 arbors는 IPL의 좁은 하위 계층으로 확장, 리모델링 및 확대되어 일부 파트너와 시냅스합니다. arbors는 개발에 걸쳐 다른 구조적 역학을 나타내며, 지점 추가, 철회 및 안정화의 상대적 비율의 변화와 함께 나타납니다. Amacrine 및 RGC 수상 돌기는 또한 유형 별 수목을 반영 할 수있는 다른 성....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 이 프로토콜은 실험일 사이의 바이러스 형질도입에 대해 최소 4-5일의 기간으로 2일에 걸쳐 있습니다(그림 1A). 동물 실험은 아픈 어린이를위한 병원 (토론토, 캐나다)의 동물 서비스 동물 사용 및 관리위원회의 실험실에서 승인 한 프로토콜에 따라 연구 및 실험실 동물 관리에서 동물 사용에 대한 캐나다 동물 관리 지침에 따라 수행됩니다.

1. 신생아 AAV 주사 및 영상 실험을위한 준비

  1. Cre 마우스 라인을 선택하여 관심 있는 망막 세포 집단에 라벨을 붙입니다. AAV 주사시의 Cre 재조합효소 발현을 Cre 트랜스제닉 리포터로 교차시키거나 Cre 항체로 면역염색을 통해 확인하였다.
  2. Cre 양성 형질전환 마우스(8-16주령)를 번식시켜 Cre 양성 신생아 동물을 생성한다.
    참고: 이 데모를 위해, ChAT-IRES-Cre 넉-인 마우스를 콜린성 스타버스트 아마크린 세포를 표적으로 삼기 위해 사용하였다.
  3. 재조합효소-의존성 형광 단백질(들)을 코딩하는 AAV 바이러스를 얻는다. 미세 공정의 최적 라벨링을 위해, 원형질막을 표적화하는 수정된 XFP를 발현하는 벡터를 선택하십시오.
    참고: 이 연구에서는 Brainbow 바이러스(....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위의 프로토콜을 사용하여 스타버스트 셀 수상 돌기를 개발하는 고해상도 3D 비디오를 획득, 디컨볼브 및 3D 드리프트에 맞게 수정했습니다. Z-평면 최대 프로젝션은 분석을 위한 2D 비디오를 만들기 위해 제작되었다(보충 비디오 1, 도 5A). 각 시점의 3D 디컨볼루션은 미세한 필로포디아 투영의 분해능을 증가시켰다(그림 5B,C). 미세한 필로포디아 돌출부는 망막 덴드라이트36을 개발하는 특징이며 이미징 중에 볼 수 있어야 합니다. AAV 형질감염은 세포 표지 밀도 및 형광 강도에서 가변성을 생성할 것이다. 따라서 표지 된 조직을 선별하여 형광 신호가 높은 세포를 선택하여 이미징하고 고품질 비디오를 제작하십시오. 희미하게 라벨이 붙은 세포를 감지하기 위해 레이저 파워를 증가시키는 것은 빠른 광표백을 유도하고 신호에 비해.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 비디오는 기존의 유전 도구를 사용하여 공초점 라이브 이미징으로 망막 뉴런을 개발하는 수상 돌기 역학을 이미지화하는 실험 파이프 라인을 보여줍니다. 또한 신생아 마우스에 막 표적화된 형광 단백질을 코딩하는 Cre 의존성 AAVs의 안구 내 주사가 입증되었다. 유전적으로 표적화된 집단의 단일 세포는 4-5 dpi만큼 일찍 밝게 표지된다. 망막 플랫-마운트는 라이브 셀 공초점 이미징을 수행하기 위해 표준 이미징 챔버를 위해 준비되었다. 이 방법은 단일 셀과 미세한 투영에 대한 고해상도 타임랩스 비디오를 생성합니다. 작은 프로젝션은 ImageJ, Vaa3D 및 ShuTu를 포함한 오픈 소스 소프트웨어와 Imaris 및 MBF Bioscience에서 제공하는 라이센스 소프트웨어를 통해 제공되는 디컨볼루션 및 후처리 알고리즘을 사용하여 해결되고 정량화됩니다. 이 파이프라인은 모듈식이므로 각 프로토콜 섹션은 연구 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 이들 모듈화 요소는 아래에서 논의되며, 1) Cre-line 선택, 2) 형광 단백질 및 바.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

매디슨 그레이가 내가 아무 것도 가지고 있지 않았을 때 나에게 손을 줘서 고맙다. 이 연구는 NSERC 디스커버리 그랜트 (RGPIN-2016-06128), 신경 과학의 슬론 펠로우십 및 캐나다 연구 위원장 Tier 2 (J.L.L.L)의 지원을 받았습니다. S. Ing-Esteves는 Vision Science Research Program과 NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Addgene 바이러스 준비 #45185-AAV9
Addgene 바이러스 준비 #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paperWhatman1001-070
Dumont #5 fine uncpsFST11252-20망막 미세 박리를 위해 두 개의 Dumont #5 집게 필요
Dumont 집게VWR82027-426
미세 가위FST14058-09
혼합 셀룰로오스 에스테르 막 (MCE) 여과지, 친수성, 0.45 &마이크로; m pore sizeMilliporeHABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mmVWR470313-352
폴리에틸렌 일회용 전송 피펫VWR470225-034
라운드 팁 페인트 브러시, 크기 3/0일반 미술 용품점레티날 플랫 마운팅 수술용 가위 FST를 위해 두 개의 크기 3/0 페인트 브러시 (또는 그 이하)가 필요합니다
.14007-14
Vannas 스프링 가위 - 2.5 mm 커팅 엣지FST15000-08
live-imaging incubation system
chamber 폴리에틸렌 튜빙, PE-160 10'WarnerInstruments64-0755
듀얼 채널 히터 컨트롤러, 모델 TC-344CWarner Instruments64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 디핑 대물Leica15506374
히터 컨트롤러 케이블Warner InstrumentsCC-28
슬라이스 지지대가 있는 대형 욕조 배양 챔버Warner InstrumentsRC-27L
MPII 미니 연동 펌프Harvard Apparatus70-2027
PM-6D 자기 가열 플랫폼(인큐베이션 챔버 히터)워너 인스트루먼트PM-6D
펌프 헤드 튜빙 피스 MPII 미니 연동 펌프용하버드 장치55-4148
샘플 앵커 (하프)워너 인스트루먼트64-0260샘플 앵커는 인큐베이션 챔버와 호환되어야 합니다
Sloflo 인라인 솔루션 히터워너 인스트루먼트SF-28
Neonatal Injections
10 &마이크로; L 마이크로리터 주사기 시리즈 700, 탈착 가능한 바늘Hamilton Company80314
30 G 피하 주사 바늘 (0.5 인치)BD PrecisionGlide305106
4 인치 얇은 유리 모세관, 필라멘트 없음 (1.0 mm 외경/0.75 mm) WPI World Precision InstrumentsTW100-4
에탄올 99.8% (이중 증류수 [ddH2O]로 70%로 희석)Sigma-AldrichV001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF펜 벡터 코어AV-9-PV2453애드진 플라스미드 #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF		Penn Vector CoreAV-9-PV2454Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in 형질전환 마우스 라인The Jackson Laboratory6410
Fast Green FCF 염료 함량 ≥ 85 %Sigma-AldrichF7252-25G
화염/갈색 마이크로피펫 풀러, 모델 P-97Sutter Instrument Co.P-97
녹색 문신 페이스트Ketchum MFG Co329A
인산염 완충 식염수, pH 7.4, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합Sigma-Aldrich806552
Pneumatic PicoPumpWPI World Precision InstrumentsPV-820
Oxygenated artifial cerebrospinal fluid (aCSF) 시약
염화칼슘 이수화물 (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)AirGasX02OX95C2003102공급업체는 지역에 따라 다를 수 있습니다
-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021
HEPES, Free AcidBio BasicHB0264
Hydrochloric acid solution, 1 NSigma-AldrichH9892
염화마그네슘 육수화물(MgCl2· 6H2O)Sigma-AldrichM2670
pH-Test strips (6.0-7.7)VWRBDH35317.604
염화칼륨(KCl)Sigma-AldrichP9541
염화나트륨(NaCl)Bio BasicDB0483
인산나트륨 일염기성(NaH2PO4)시그마-알드리치RDD007
Software
ImageJNational Institutes of Health (NIH)오픈 소스
렌즈 . . D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synapt....

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