방법 논문

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

DOI:

10.3791/62312

⸱

2021년 3월 28일

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, School of Basic Medical Sciences, Nanjing Medical University, 2Institute for Brain Tumors & Key Laboratory of Rare Metabolic Diseases, Nanjing Medical University; Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital; Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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신경교종 줄기 세포 (GSC)는 가장 널리 퍼진 파괴적인 1 차뇌종양인 교모세포종 (GBM)에서 종양 개시, 혈관 신생 및 약물 내성에서 필수적인 역할을하는 암세포의 작은 부분입니다. GSC의 존재는 GBM개별 표적 에이전트의 대부분에 아주 불응성, 그래서 높은 처리량 검열 방법은 잠재적인 효과적인 조합 치료제를 확인하기 위하여 요구됩니다. 프로토콜은 시너지 상호 작용을 가진 잠재적인 조합 치료를 위한 신속한 검열을 가능하게 하는 간단한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우의 일반적인 단계는 루시파아제 태그가 지정된 GSC를 확립하고, 마모젤 코팅 플레이트를 준비하고, 조합 약물 검사, 분석 및 결과 유효성을 검사하는 것으로 구성됩니다.

초록

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신경교종 줄기 세포 (GSC)는 가장 널리 퍼진 파괴적인 1 차뇌종양인 교모세포종 (GBM)에서 종양 개시, 혈관 신생 및 약물 내성에서 필수적인 역할을하는 암세포의 작은 부분입니다. GSC의 존재는 GBM개별 표적 에이전트의 대부분에 아주 불응성, 그래서 높은 처리량 검열 방법은 잠재적인 효과적인 조합 치료제를 확인하기 위하여 요구됩니다. 프로토콜은 시너지 상호 작용을 가진 잠재적인 조합 치료를 위한 신속한 검열을 가능하게 하는 간단한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우의 일반적인 단계는 루시파아제 태그가 지정된 GSC를 확립하고, 마모젤 코팅 플레이트를 준비하고, 조합 약물 검사, 분석 및 결과 유효성을 검사하는 것으로 구성됩니다.

서론

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교모세포종 (GBM)은 1 차적인 뇌종양의 가장 일반적이고 공격적인 모형입니다. 현재, 최대 치료를받은 GBM 환자의 전반적인 생존 (수술의 조합, 화학 요법, 방사선 요법) 여전히 15 개월 보다 짧습니다. 따라서 GBM에 대한 새롭고 효과적인 치료가 시급히 필요합니다.

GBM에서 신경교종 줄기 세포(GSC)의 존재는 이러한 줄기와 같은 세포가 종양 미세 환경, 약물 내성 및 종양 재발1의유지에 피벗 역할을 하기 때문에 종래의 치료에 상당한 도전을 구성한다. 따라서 GSC를 타겟팅하는 것은 GBM 치료2에대한 유망한 전략이 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 GBM의 약물 효능에 대한 주요 단점은 유전적 돌연변이, 혼합 된 아류형, 후성 유전학 조절 및 종양 미세 환경의 차이를 포함하되 이질유전학적 특성으로 치료에 매우 내화됩니다. 많은 실패한 임상 시험 후에, 과학자및 임상 연구원은 단 하나 에이전트 표적으로 한 치료가 GBM와 같은 고이질암의 진행을 완전히 통제할 수 없다는 것을 아마 실현했습니다. 반면, 엄선된 약물 조합은 서로의 효과를 시너지 효과 향상시킴으로써 그 효과를 승인하여 GBM 치료에 대한 유망한 솔루션을 제공한다.

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프로토콜

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GBM 표본은 난징의과대학 제1부속병원의 인간연구윤리위원회의 완전한 동의를 얻은 후 일상적인 수술 중 환자로부터 취득되었다.

1. 환자 유래 GSC의 격리 및 문화

  1. 멸균 PBS로 채워진 15mL 원심분리기 튜브에 신선한 외과 적 절제 된 교모세포종 조직을 놓고 추가 수술이 있을 때까지 조직을 얼음에 저장하십시오.
  2. GBM 조직을 해부 가위를 사용하여 직경 약 0.5~1mm 조각으로 다진 후 신경 기저 배지로 조직 표본을 세척하여 생물 안전 캐비닛에서 세포 이물질을 제거합니다.
  3. 조직 단편을 37°C에서 37°C에서 37°C로, 4°C에서 5분 동안 400xg의 원심분리기를 소화합니다.
  4. 상체를 제거하고 빈 신경 기저 배지로 펠릿을 중단하고 얼음에 반복적인 파이펫팅을 통해 펠릿을 기계적으로 분리합니다.
  5. GSC 배양 배지로 채워진 초저부착 6웰 배양판(레시피용 표 1 참조)에서 혼합물을 배양하여 37°C에서 5% CO2 및 90%의 습도를 신경구형성까지 배양한다.
  6. 충분한 신경구 형성시, 실온에서 5 분 동안 800 x g에서 1.5 mL 마이크로 튜브및 원심 분리기....

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결과

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XG387 세포는 극저부착 6-웰 배양플레이트 또는 비코팅 플레이트5(도 1A)에서 표 1에 기재된 배양 배지에서 신경구를 형성하였다. 먼저, XG387-Luc 세포로부터의 생체 발광 강도가 세포 수에 비례했는지 여부를 확인하기 위한 테스트를 수행하였다. 도 1B에도시된 바와 같이, 바이오 발광 강도는 세포 밀도에 비례하여 증가하고 그들 사이의 선형 보정을 초래했다(Pearson r = 0.9872; p < 0.0001; 그림 1C). 루시파라래기 태그된 세포의 생체 발광은 측정이 쉽고 빠르기 때문에 실행 가능한 GSC의 밀도를 측정하는 간단한 방법을 제공합니다. 다음으로, 테모졸로미드의 증식 방지 활성을 평가하였다. 도 1D에도시된 바와 .......

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토론

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본 연구에서는, 환자 유래 GSC를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하기 위해 적용될 수 있는 프로토콜이 설명되었다. Loewe, BLISS 또는 HSA 방법과 같은 표준 시너지/첨가도 메트릭 모델과 달리, 기존의 방법으로서 약물 쌍을 여러 농도로 결합할 필요가 없는 간단하고 빠른 워크플로우가 사용되었습니다. 이러한 워크플로우에서, 작은 분자 억제제와 함께 siRNAs의 감광 효과를 평가하는 연구에서 유래된 SI(감도 지수)는 2개의 작은 분자 억제제7의시너지 효과의 정량화하도록 도입되었다. SI 값의 범위는 -1에서 1까지이며, 양수 SI 값은 각 약물 간의 민감성 효과를 나타낸다. SI 값이 높을수록 시너지 효과가 강해졌습니다. SI 값만으로는 약물 상호 작용의 유형(시너지, 첨가제 또는 길항성)에 대한 긍정적인 답을 제공할 수 없지만, 상위권 후보자는 관심 있는 약물과 시너지 효과를 낼 확률이 높기 때문에 추가 검증의 가치가 있습니다. 이에 비해, 현재 고처리량 약.......

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공개 사항

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저자는 공개할 충돌이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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중국 국립자연과학재단(81672962), 장쑤성 혁신팀 프로그램 재단, 동남아시아대학교 공동핵심사업재단, 난징의과대학 공동지원에 감사드립니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
B-27Gibco17504-04450X
EGFGibcoPHG031320 ng/ml
FGFGibcoPHG026320 ng/ml
Gluta MaxGibco35050061100X
NeurobasalGibco211030491X
페니실린-스트렙토마이신HyCloneSV30010P: 10,000개/ml        에스:  10,000ug/ml
피루브산 나트륨Gibco2088876100mM
표 1. 그만큼  제형  GSC  완전한 문화 매체.   
ABT-737MCE선택적 및 BH3 모방  Bcl-2,  Bcl-xL  과  Bcl-w  억제제
아다보세르티브 (MK-1775)MCEWee1  억제제
AxitinibMCE다중 표적 티로신 키나아제 억제제
AZD5991MCEMcl-1  억제제
A 83-01MCETGF-&beta의 강력한 억제제; 유형 I 수용체  ALK5 키나아제
CGP57380Selleck잠재력  MNK1  억제제
Dactolisib (BEZ235)SelleckDual ATP-competitive  파이3K  과  엠토르  억제제
DasatinibMCEDual  Bcr-Abl 및 Src 계열 티로신 키나아제  억제제
ErlotinibMCEEGFR  티로신 키나아제 억제제
GefitinibMCEEGFR 티로신 키나아제  억제제
LinifanibMCE다중 표적 억제제  VEGFR  과  PDGFR  가족
MasitinibMCE억제제  c-Kit
ML141Selleck비경쟁 억제제  Cdc42 GTPase 
OSI-930MCE키트, KDR 및 CSF-1R의 다중 표적 억제제 
PalbociclibMCE선택적  CDK4  과  CDK6  억제제
SB 202190MCE선택적  p38 MAP 키나아제  억제제
Sepantronium bromide (YM-155)MCESurvivin  억제제
TCS 359SelleckPotent FLT3 억제제
UMI-77MCE선택적  MCL-1  억제제
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)Selleck선택성  에스트로겐 수용체(ER)  변조기
표 2. 테스트 화면에 사용된 20개의 대상 에이전트에 대한 정보입니다. 이들 모두는 표적 선택적 소분자 억제제입니다. 공급자, 이름 및 대상이 테이블에 제공되었습니다.
용

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  2. Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 ....

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