리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

요약

리간드 분석(DRaCALA)의 차동 적개 모세관 작용은 ORFeome 라이브러리를 사용하여 유기체의 작은 리간 결합 단백질을 식별하는 데 사용될 수 있다.

초록

지난 10 년 세균성 생리학에 있는 작은 신호 분자의 이해에 있는 엄청난 진전을 보았습니다. 특히, 여러 뉴클레오티드 유래 이차 메신저(NSM)의 표적 단백질은 모델 유기체에서 체계적으로 확인되고 연구되었다. 이러한 성과는 주로 이러한 소분자의 표적 단백질을 체계적으로 식별하는 데 사용되었던 리간드 분석시(DRaCALA)의 포획 화합물 기술과 차동 적대모세 혈관 작용을 포함한 몇 가지 새로운 기술의 개발 때문입니다. 이 논문은 DRaCALA 기술의 예 및 비디오 데모로 NSM, 과노신 펜타 및 테트라포산염(p)ppGpp의 사용을 설명합니다. DRaCALA를 사용하여, 20명 중 9개 및 12개의 새로운 표적 단백질(p)ppGpp가 모델 유기체, 대장균 K-12에서 확인되었으며, 이 분석의 힘을 입증하였다. 원칙적으로, DRaCALA는 방사성 동위원소 또는 형광 염료에 의해 표시될 수 있는 작은 리간드를 공부하기 위하여 이용될 수 있었습니다. DRaCALA의 중요한 단계, 장단점 및 단점은 이 기술을 추가로 적용하기 위해 여기에서 논의됩니다.

서론

박테리아는 끊임없이 변화하는 환경에 적응하기 위해 여러 개의 작은 신호 분자를 사용^1,2. 예를 들어, 자가유도기, N-아실모케린 락톤 및 수정된 올리고펩티드, 박테리아 간의 세포간 통신을 중재하여 인구 거동, 쿼럼 센싱^2로알려진 현상을 조정한다. 작은 신호 분자의 또 다른 그룹은 널리 연구 된 순환 아데노신 모노 포스 페이트 (cAMP), 순환 디-AMP, 순환 디 구아노신 모노 인산염 (순환 디-GMP), 및 구아노신 펜타 및 테트라 인산염(ppp)을 포함하여 NSM입니다. 박테리아는 다양한 스트레스 조건에 대한 응답으로 이러한 NSM을 생산합니다. 일단 생성되면, 이 분자는 그들의 표적 단백질에 결합하고 만나는 응고에 대처하고 세균성 생존을 강화하기 위하여 몇몇 다른 생리적이고 신진 대사 통로를 조절합니다. 따라서, 표적 단백질의 식별은 이 작은 분자의 분자 기능을 해독하기 위한 피할 수 없는 전제 조건이다.

지난 10 년은 이 작은 분자의 표적 단백질을 공개한 몇몇 기술 혁신 때문에 주로 이 작은 신호 분자의 지식의 붐을 목격했습....

프로토콜

1. 전체 세포 리스의 준비

1. 대장균 K-12 ASKA ORFeome 컬렉션 균주¹⁵ 에 1.5 mL 리소제니 국물 (LB) 포함 25 μg/mL 클로람페니콜 96 잘 깊은 우물 플레이트. 160 rpm에서 흔들리면 30 °C에서 18 시간 동안 하룻밤 (O / N)으로 성장하십시오. 다음 날, O/N 배양에 이소프로필 β-d-1-티오갈라크토피라노사이드(최종 0.5mMMM)를 첨가하여 단백질 발현을 6시간 동안 30°C로 유도한다.
2. 펠릿 셀은 500 x g에서 10 분 동안. 사용 전까지 -80°C에서 펠릿을 얼리면 됩니다. 세포를 용해하려면, 용해 버퍼 L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl_2,2 mM 페닐메틸술포닐 불소 (PMSF), 40 μg /mL DNase 1, 및 0.5 mgmel을 추가하십시오.
3. 세포를 -80°C에서 30분 동안 동결한 다음 37°C에서 20분 동안 해동합니다. 이 주기를 세 번 반복하여 셀을 lyse합니다. 사용하기 전에 -80 °C에 lysates를 저장합니다.

2. 렐_세크와 GppA의 정화

결과

전술한 프로토콜에 따라 일반적으로 두 가지 유형의 결과를 산출한다(그림3).

도 3A는 대부분의 우물에서 상대적으로 낮은 배경 바인딩 신호(바인딩 분획 < 0.025)를 가진 플레이트를 나타낸다. 웰 H3의 양수 결합 신호는 다른 우물에서 관찰된 것보다 훨씬 높은 ~0.35의 결합 분획을 제공합니다. 정량화없이도, 잘 H3는 놀라운, 잘 H3에서 발현 된 대상 단백질pppGpp에 바인딩 제안, ppGpp, 또는 둘 다. 실제로, 잘 H3에서 과발현된 단백질은 (p)ppGpp^12,16을결합하는 것으로 알려진 저산소산틴 인지질 전달성 Hpt이다.

토론

DRaCALA 스크리닝을 수행하는 중요한 단계 중 하나는 좋은 전체 세포 리스를 얻는 것입니다. 첫째, 테스트된 단백질은 다량과 수용성 형태로 생산되어야 합니다. 둘째, 세포의 용해가 완료되어야하며, 용물의 점도는 최소화해야합니다. 리소지메의 포함과 동결 해동의 세 주기의 사용은 종종 완전히 세포를 lyse 충분하다. 그러나, 방출된 염색체 DNA는 용액점성 및 높은 배경 결합 신호를 생성하여 도 3B,C에도시된 바와 같이 거짓 긍정의 결과로 생성된다. 이를 완화하기 위해, S. 마르세센의 DNase 1 및/또는 엔도누리스를 사용할 수 있으며, 샘플을 DNA를 저하시키기 위해 더 오랜 시간 동안 배양될 수 있다.

음수(빈 플라스미드 벡터) 및 양성(공지된 표적 단백질) 대조군모두 대규모 스크리닝을 수행하기 전에 전체 세포 용해 제제 및 DRaCALA 결합 분석의 조건을 최적화하기 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x 핀 도구	V& P Scientific	VP 404	96 볼트 리플리케이터, 9mm 센터, 4.2mm 볼트 직경, 24mm 길이
96웰 V-하단 마이크로타이터 플레이트	Sterilin	MIC9004	Sterilin Microplate V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar no. 1
ASKA collection strain	NBRP, SHIGEN, 일본		참조: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	유전자 조작 엔도뉴클레아제 Serratia marcescens
Bradford 단백질 분석 염료	Bio-Rad	5000006	시약 농축
DMSO	SIGMA	D8418	≥ 99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
겔 여과10x300 컬럼	GE 헬스케어	28990944	방부제로 20% 에탄올을 함유
	PanReac AppliChem	122329.1214	분석용 글리세롤 87%
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazole	SIGMA	56750	puriss. p.a., &지; 99.5% (GC)
IP 스토리지 형광체 스크린	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
이소프로필 &베타;-d-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)	SIGMA	I6758	이소프로필 &베타;-D-티오갈락토시드
용해성 육수 (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Broth Base
Lysozyme	SIGMA	L4949	닭고기 달걀 흰자위에서; BioUltra, 동결건조 분말, ≥ 98%
MgCl2 (염화마그네슘)	SIGMA	208337
MilliQ 물			초순수
멀티채널 피펫	Thermo Scientific	4661110	F1 - 클립 팁; 1-10 ul, 8 x 채널
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인	Amersham Protran	10600003	Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Phosphate 완충 식염수(Dulbecco A), 정제
PEG3350(폴리에틸렌 글리콜 3350)	SIGMA	202444
페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)	SIGMA	93482	페닐메탄설포닐 플루오라이드 용액 - 에탄올 (T)의 0.1 M
형광체 이미저	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 형광체 이미저
피펫 팁, 여과된	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 μ l 비멸균
Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼	Bio-Rad	7311550	폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼
프로테아제 억제제 Mini	Pierce	A32955	정제, EDTA 무료
스크류 캡 튜브	Thermo Scientific	3488	Microcentifuge Tubes, 나사 캡 포함 2.0 ml, 비멸균
SLS 96-deep Well plates	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, 천연
스핀 컬럼	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml 원심 필터
써모믹서	Eppendorf	5382000015	써모믹서 C
TLC 플레이트(PEI-셀룰로오스 F TLC 플레이트)	Merck Millipore	105579	DC PEI-셀룰로오스 F(20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	분자생물학용 Tris 베이스
Tween 20	SIGMA	P1379	점성 비이온 세제
&베타;-메르캅토에탄올	SIGMA	M3148	99% (GC/적정)

액 는 합니다.