Method Article

유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 견갑골 갈색 지방 조직에서 갈색 지방 세포 분리

DOI:

10.3791/62332

⸱

March 12th, 2021

 ,  , 
1Masonic Medical Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 갈색 지방 세포를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

갈색 지방 조직 (BAT)은 포유류에서 떨리지 않는 열 발생을 담당하며 갈색 지방 세포 (BA)는 BAT의 기능 단위입니다. BA는 다안 지질 방울과 풍부한 미토콘드리아를 모두 포함하며 결합 해제 단백질 1 (UCP1)을 발현합니다. BA는 기원에 따라 배아 유래 고전 BA(cBA)와 백색 지방 세포 유래 BA의 두 가지 하위 유형으로 분류됩니다. 상대적으로 밀도가 낮기 때문에 BA는 전통적인 원심분리 방법으로 BAT에서 분리할 수 없습니다. 이 연구에서는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 마우스에서 BA를 분리하는 새로운 방법이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서, 성인 마우스로부터의 interscapular BAT를 Collagenase 및 Dispase 용액으로 분해하고, 해리 된 BA를 6 % 요오 딕산 올 용액으로 풍부하게했다. 그런 다음 분리된 BA를 트리졸 시약으로 용해시켜 RNA, DNA 및 단백질을 동시에 분리했습니다. RNA 분리 후, 용해물의 유기상을 단백질 추출에 사용하였다. 우리의 데이터는 6% 요오드 딕산올 용액이 후속 유전자 및 단백질 발현 연구를 방해하지 않으면서 BA를 효율적으로 농축한다는 것을 보여주었습니다. 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)는 중간 엽 세포의 성장과 증식을 조절하는 성장 인자입니다. 갈색 지방 조직과 비교하여 분리 된 BA는 Pdgfa의 발현이 상당히 높았습니다. 요약하면,이 새로운 방법은 단일 세포 유형 수준에서 갈색 지방 세포의 생물학을 연구하기위한 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생쥐와 인간 모두 백색 지방 조직(WAT)과 갈색 지방 조직(BAT)의 두 가지 유형의 지방 조직을 가지고 있습니다.1. WAT는 백색 지방 세포에 트리글리세리드 형태로 에너지를 저장하고 BAT의 갈색 지방 세포 (BA)는 화학 에너지를 열2로 발산합니다. 발달 기원에 따라 BA는 배아 발달 중에 형성된 고전 BA(cBA)와 백색 지방세포 유래 BA(베이지/브라이트 세포, 스트레스 조건에서 백색 지방세포에서 전환)3로 더 분류됩니다. BA는 다안선이며 열 발생 단백질 결합 해제 단백질 1 (UCP1)4을 발현합니다. 견갑간 BAT (iBAT) 저장소는 작은 포유류5의 1 차 cBA 저장소 중 하나 인 반면, 베이지 색 세포는 WAT6 내에 분산되어 있습니다.

BA는 에너지를 발산하는 특성으로 인해 비만을 줄이기 위한 치료 표적으로 많은 주목을 받고 있습니다7. 비만 치료 목적으로 BA를 이용하려면 BA 기능, 생존 및 모집을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다. BAT 및 WAT를 포함한 지방 조직은 이질적입니다. 지방 세포를 제외하고, 지방 조직은 내피 세포, 중간엽 줄기 세포 및 대식세포와 같은 많은 다른 세포 유형을 함유한다8. UCP1::Cre line9와 같이 마우스 BA에서 후보 유전자를 특이적으로 고갈시키는 유전 도구를 사용할 수 있지만 BAT 또는 WAT에서 BA를 정제하는 기술은 제한적이어서 단일 세포 유형 수준에서 BA를 연구하기가 어렵습니다. 또한 순수 BA를 취득하지 않으면 BA와 비 BA 간의 관계가 명확하게 설명되지 않습니다. 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRα)는 미분화 중간 엽 세포의 마커로 사용되어 왔으며 BAT의 내피 및 간질 세포에서 발현됩니다. 저온 스트레스 BAT에서, PDGFRα 양성 전구 세포는 새로운 BAs10을 생성한다. PDGFRα는 그의 리간드 PDGF에 의해 활성화되고, 중간엽 세포의 성장 및 증식을 조절하는 성장 인자11; 그러나, BA가 PDGF를 분비함으로써 PDGFRα 양성 전구 세포의 행동에 영향을 미치는지는 불분명하다.

최근에는 형광 활성화 세포 분류(FACS)12를 기반으로 하는 BA 분리 프로토콜이 발표되었습니다. 이 프로토콜에서, 3% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 사용하여 BA를 비-BA로부터 분리하고, 농축된 BA를 FACS에 의해 추가로 정제하였다. 이 프로토콜의 적용은 장비 및 FACS 운영 경험에 모두 의존하는 FACS 프로세스의 요구 사항에 의해 제한됩니다. 이 연구에서는 BAT에서 BA를 분리하기 위한 새로운 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 BA는 유전자 및 단백질 발현 연구에 직접 사용할 수 있습니다. 또한이 연구의 데이터는 BA가 주요 PDGF 자원임을 시사합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 마우스는 병원체가없는 상태로 유지되었으며 모든 절차는 프리메이슨 의학 연구 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. UCP1::Cre9 및 Rosa 26td토마토 마우스 라인13 이 이전에 보고되었다. 모든 마우스는 12 시간의 명암 주기로 실온에서 유지되었다.

1. 용액 및 갈색 지방 조직 (BAT) 준비

  1. 15mL 원심분리 튜브에 분해 용액과 분리 용액을 준비합니다.
  2. 10mL의 BAT 분해 용액: 10mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 3.5mg/mL 디스파아제 II, 1mg/mL 콜라게나제 II 및 10mMCaCl2 을 추가하여 BAT 분해 용액을 만듭니다.
  3. 10 mL의 12 % 요오드 딕산 올 용액 (분리 용액) : 10x PBS 1mL, 60 % 요오드 사놀 2mL, 1M MgCl2 0.01mL, 1M KCl 0.025mL, 0.2M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 0.1mL 및 ddH2O6.865mL를 혼합하여12 % 요오드 사놀을 얻습니다.
  4. 성인 마우스 1 마리를 CO2 과다 복용으로 안락사시킵니다. 간략하게, 마우스 케이지를 분당 10-30% 케이지 부피의 변위 속도로 100%CO2 로 채운다. 5분 후, 눈에 띄게 호흡이 없는지 확인하여 사망을 확인한다.
  5. 동물을 해부하고 견갑골 BAT를 수집하십시오. 실체 현미경으로 와트와 근육층을 제거하십시오.
  6. 충분한 소화를 위해 각 BAT 로브를 ~ 3mm3 부분으로 자르고 금속 교반 막대와 5mL 분해 용액이 있는 깨끗한 50mL 플라스크에 넣습니다. 소화를 시작하기 전에 BAT와 소화 완충액이 들어있는 플라스크를 얼음 위에 1 시간 동안 두십시오.
    참고: 다음 단계에서는 갈색 지방세포 분리에 약 80mg BAT를 사용했습니다.

2. BA 격리 절차

  1. 플라스크를 인큐베이터에 밀폐 된 자기 교반기에 놓습니다. 교반 속도를 60 rpm으로, 배양기의 온도를 각각 35°C로 설정한다. 소화는 약 30분 동안 지속됩니다. 소화 중에 BAT 슬라이스가 교반기 바 주위에 덩어리를 형성하는 경우 1mL 피펫 팁을 사용하여 응집된 조직을 파괴합니다.
  2. 깨끗한 50mL 원심분리 튜브 위에 70μm 여과기 필터를 놓습니다. 여과기를 통해 약 4mL의 세포 현탁액을 피펫팅합니다. 4mL의 12% 요오드 요오드산올 용액으로 여과기를 세척합니다. 피펫을 위아래로 움직여 세포와 요오드 산올 용액을 혼합합니다. 세포 혼합물을 두 개의 투명한 5mL 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다.
    알림: 소화가 끝나면 소화 용액이 흐려져 충분한 소화를 나타냅니다. 매번 신선한 소화 용액을 사용하십시오. 일단 준비되면 소화 용액을 2 시간 이내에 사용해야합니다.
  3. 소화가 충분하지 않으면 2.2 단계와 2.3 단계를 한 번 더 반복하십시오.
  4. 분리 용액과 BA가 들어있는 투명한 폴리스티렌 튜브를 얼음 위에 1 시간 동안 그대로 두십시오. BA는 상단에 레이어를 형성합니다.
  5. 현미경 검사를 위해 분리된 BA 20μL를 꺼냅니다.

3. BA에서 RNA 및 단백질 분리

  1. RNA 및 단백질 분리를 위해 BA 층을 2개의 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. BA 층을 방해하지 않고 과도한 요오드 잔올 용액을 조심스럽게 제거하십시오.
  2. 1mL Trizol을 추가하여 RNA, DNA 및 단백질을 세포 용액에 동시에 분리합니다. 세포를 용해시키기 위해 충분히 혼합하십시오.
  3. 200 μL의 클로로포름을 추가하여 상을 분리합니다.
  4. 튜브를 4°C에서 10분 동안 9,981 x g 동안 원심분리합니다.
  5. 원심분리 후, RNA 분리를 위해 수성 상을 사용한다. 본 연구에서는 역전사를 위해 총 RNA를 사용하였고, Real-Time PCR로 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 재료 표에 나열되어 있습니다.
  6. 300μL의 유기상을 2mL 미세 원심분리 튜브에 옮깁니다.
  7. 유기상에 2.5 부피의 100 % 에탄올과 10 초 동안 와류를 첨가하십시오.
  8. 200 μL의 1-브로모-3-클로로프로판을 넣고 10초 동안 와동시킨다.
  9. 600μL의 이중 증류수와 10초 동안 와류를 추가합니다.
  10. 혼합 용액을 실온에서 10분 동안 그대로 두십시오.
  11. 9,981 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 단계에서는 단계가 분리됩니다. 단백질 단계는 중간층에 국한되어 있습니다.
  12. 상단 수용액을 제거하십시오. 나머지 용액에 1mL 100% 에탄올을 추가합니다.
  13. 10분 동안 원심분리기, 9,981 x g, 4 °C. 원심분리 후, 단백질 펠릿이 형성될 것이다. 상청액을 폐기하십시오.
  14. 펠릿을 1mL 100% 에탄올로 세척합니다.
  15. 10 분 동안 원심 분리기, 9981 x g, 4 ° C. 펠릿을 저장하고 상청액을 폐기하십시오.
  16. 펠릿을 실온에서 10분 동안 자연 건조시킵니다.
  17. 젖은 펠릿의 무게를 측정하십시오. 20 μL/mg 펠릿의 비율로 1% SDS 용액을 추가합니다.
  18. 튜브를 가열 된 셰이커에 넣어 펠릿을 녹입니다. 온도를 55 ° C로 설정하고 속도를 11 x g로 설정하십시오. 단백질 펠릿을 완전히 용해시키는 데 보통 5-10 분이 걸립니다.
    참고: 용해된 단백질의 농도는 BCA 분석14로 측정할 수 있습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

갈색 지방세포 분리를 위한 개간골 BAT의 제조
갈색 지방세포(BA) 분리 과정은 도 1A에 도시되어 있다. BAT 및 분해/분리 용액 준비에서 분리 BA 획득에 이르기까지 전체 프로세스는 약 4시간이 소요됩니다.

성인 마우스에서는 견갑골 간 영역에 풍부한 BAT가 존재합니다. 이 견갑간 BAT(iBAT)는 근육층과 WAT로 덮여 있습니다(그림 1B). 소화 절차를 시작하기 전에 근육층과 WAT를 제거하여 깨끗한 iBAT를 생성해야 합니다(그림 1C). 공개된 BA 격리 프로토콜에서, 다진 BAT는 BA 격리12에 사용되었다. 이 연구에서 3mm3 크기 BAT의 분해 (그림 1D

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 BA를 분리하는 새로운 방법이 개발되었습니다.

공개된 BA 격리 프로토콜에서, 3% BSA 용액은 BAs12를 풍부하게 하기 위해 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 이 공개된 프로토콜에 의해 달성된 농축 BA는 단백질 발현 분석에 직접 사용될 수 없었다. 이는 BAs 용액에 존재하는 농축된 BSA가 후속 단백질 추출을 방해하기 때문입니다. 3 % BSA 용액에 농축 된 BA를 Trizol 시약으로 처리하면 끈적 끈적한 단백질 응집체가 형성되며 대부분은 GTPC 단백질 추출 공정에 용해되지 않았습니다. 추가적으로, GTPC 단백질 추출 산물에서, 대부분의 단백질은 BSA였다(도 3B). 이 새로운 프로토콜에서는 BA를 정제하기 위해 3% BSA 분리 용액을 6% 요오드산올로 대체했습니다. 6% 요오드 잔산 용액은 BA와 비 BA를 효율적으...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z. Lin은 National Institutes of Health HL138454-01 및 Masonic Medical Research Institute 기금의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
AntigenCompanyCatalog
PPARγLSBioLs-C368478
PDGFRa산타 크루즈sc-398206
UCP1R & D 시스템IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type IIThermo Fisher Scientific17101015
1-Bromo-3-chloropropaneSigma-AldrichB62404
소 혈청 알부민 (BSA) GoldbioA-421-10
염화칼슘바이오 베이직CT1330
클로로포름IBI 과학IB05040
Dispase II, 프로테아제Sigma-AldrichD5693
EDTA바이오 베이직EB0107
에탄올IBI 과학IB15724
LiQuant Universal Green qPCR 마스터 믹스LifeSctLS01131905Y
염화마그네슘 헥사하이드레이트Boston BioProductsP-855
OneScrip Plus cDNA 합성 SuperMixABMG454
OptiPrep (요오딕산올)Cosmo Bio USAAXS-1114542
PBS (10x)Caisson LabsPBL07
PBS (1x)Caisson LabsPBL06
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23227
염화칼Boston BioProductsP-1435
SimplyBlue 안전 염색InvitrogenLC6060
도데실황산나트륨(SDS)Sigma-Aldrich75746
트리졸 시약생명 기술15596018
Primers
유전자명(종) 정방향역방향
pdgfra (마우스)CTCAGCTGTCTCCTCACAgGCAACGCATCTCAGAGAAAAGG
pdgfa (마우스)TGTGCCCATTCGCAGGAAGAGTTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(마우스)TGCTGAACATCTCCCCCTTCTCTCTCCACAGACAATGCCAGGAC
ucp1ACTGCCACACCTCCAGTCATTCTTTGCCTCACTCAGGATTGG
strong>Equipment
NameCompanyApplication
Keyence BZ-X700KeyenceImaging brown adipocytes
Magnetic stirrerVWRDissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System적용 BiosystemQuantitative PCR
The Odyssey Fc 이미징 시스템LI-COR웨스턴 블롯 이미징
륨 <

References

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