여기에서 이 연구는 생체 내에서 제브라피쉬의 췌장 β세포의 칼슘 이미징 및 포도당 자극을 위한 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
췌장 β세포는 혈당 수치에 따라 인슐린을 생산하고 분비하여 전신 포도당 항상성을 유지합니다. β세포 기능의 결함은 당뇨병으로 이어질 수 있는 고혈당증과 관련이 있습니다. 인슐린이 분비되는 과정에서 β세포는 Ca2+의 유입을 경험합니다. 따라서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 사용하여 포도당 자극 Ca2+ 유입을 이미징하면 β세포 기능을 연구할 수 있습니다. 이전에 연구에 따르면 GCaMP6를 발현하는 고립된 제브라피시 섬은 정의된 포도당 농도로 자극할 때 상당한 Ca2+ 활성을 나타냅니다. 그러나 β세포가 포도당에 어떻게 반응하는지 연구하는 것이 가장 중요하며, 포도당은 단독으로 반응하는 것이 아니라 전신적으로 연결되고, 혈관화되고, 조밀하게 신경분포되어 있는 본래 환경에서 포도당에 반응합니다. 이를 위해 이 연구는 발달 초기 단계에서 제브라피시 유충의 광학적 투명도를 활용하여 생체 내에서 β세포 활동을 조명했습니다. 여기에서는 in vivo에서 β세포 기능을 조사하기 위한 Ca2+ 이미징 및 포도당 자극에 대한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 분해능으로 β-세포에서 조정된 Ca2+ 역학을 모니터링할 수 있습니다. 게다가, 이 방법은 작은 분자 펩티드와 같은 어떤 주사 가능한 해결책든지 사용하기 위하여 적용될 수 있습니다. 전체적으로 이 프로토콜은 생체 내에서 섬 조정을 조사하고 환경 및 유전적 요소가 β세포 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 특성화할 수 있는 제브라피시 모델의 잠재력을 보여줍니다.
서론
췌장 β세포는 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 독특한 능력을 나타냅니다. 탄수화물이 풍부한 식사를 한 후에는 혈당이 증가하여 β세포로 들어가 빠르게 대사되어 ATP를 생성합니다. ATP/ADP의 세포 내 비율의 증가는 ATP 의존성 K+ 채널의 폐쇄로 이어지며, 세포막을 탈분극시키고 전압 의존성 Ca2+ 채널을 활성화합니다. 세포 내 Ca2+ 의 급격한 증가는 β세포의 인슐린 과립 분비를 자극합니다.
생쥐의 온전한 췌장 내에 있는 섬 세포의 이미징은 까다롭고 전체 장기의 외부화가 필요합니다. 비침습적 in vivo 이미징을 위한 강력한 대안은 마우스1의 눈의 전방(AC)에 섬을 이식하는 것입니다. 마우스의 AC에 이식된 섬은 in vivo 환경을 모방하여 종단 연구 및 Ca2+ 이미징 in vivo 2,3을 가능하게 합니다. 그럼에도 불구하고, 섬 혈관재생은 섬 이식 후 몇 주가 걸릴 수 있다
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프로토콜
이 연구에서 사용된 이전에 확립된 형질전환 라인은 Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)6, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)14. 모든 실험은 유럽연합 및 독일 법률(Tierschutzgesetz)에 따라 드레스덴 공과대학교(TU Dresden) 및 작센 작센 공과대학(Landesdirektion Sachsen) 윤리위원회(승인 번호: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016, T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018, TVV33-2019)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 연구에서는 동물 보호법(TierSchVersV §14)에 명시된 대로 수정 후 5일(dpf) 단계를 초과하지 않는 제브라피시 유충을 대상으로 모든 생체 내 이미징 및 포도당 주사와 실험 절차를 수행했습니다. EU 지침 2010/63/EU에 따르면 이러한 초기 제브라피시 단계를 사용하면 3R의 원칙에 따라 실험 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
1. 준비
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결과
이 프로토콜을 사용하여 네이티브 환경에서 개별 β 세포의 포도당 반응을 특성화했습니다. 이를 위해 제브라피쉬 유충은 유리 바닥 페트리 접시에 장착됩니다. 3D 매니퓰레이터를 사용하여 SV를 대상으로 하는 유리 모세관을 순환에 삽입했습니다(그림 1 및 그림 2). 이를 통해 정의된 농도의 특정 부피의 용액을 주입할 수 있습니다. 동시에, 이미징 평면의 모든 β 세포에 대한 Ca2+ 의 포도당 유도 유입을 기록했습니다. 형광 강도 값은 FIJI17을 사용하여 추출되었습니다. 마지막으로, 각 β-세포에 대해 in vivo 에 대해 반응 시간을 평가했습니다(그림 3 및 보충 동영상 1). 이를 위해 GCaMP6s 신호의 변화는 그림 .......
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토론
이 프로토콜에서는 단일 세포 해상도를 가진 기본 미세환경에서 β세포의 Ca2+ 역학을 조사했습니다. 이는 제브라피시 β세포를 순환계에 포도당 주입으로 자극하는 동시에 GCaMP6를 사용하여 Ca2+ 역학을 기록함으로써 가능합니다.
이 프로토콜은 세 가지 주요 이점을 제공합니다. 첫째, 연구자들은 제브라피시 β세포가 생체 내 포도당 자극에 대한 조정된 반응을 보인다는 것을 입증했습니다 7,13,18. 대조적으로, 세포 배양에서 β 세포의 반응은 종종 조정되지 않는 것으로 관찰되었다19. 따라서 in vivo 이미징은 β 세포의 생리적, 조정된 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
니콜라이 니노프는 드레스덴 공과대학교의 드레스덴 재생 치료 센터(Center for Regenerative Therapies Dresden)와 독일 당뇨병 연구 센터(DZD)로부터 연구 보조금을 받았고, 독일 연구 재단(DFG) 및 국제 연구 훈련 그룹(IRTG 2251), 대사 질환의 면역 및 세포 전략(Immunological and Cellular Strategies in Metabolic Disease)으로부터 연구 보조금을 받았습니다. 모든 이미징 기술을 지원해 준 CRTD의 광학 현미경 시설에 감사드립니다. 모든 어류 기술 지원과 지원에 대해 CRTD의 어류 시설에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
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| 블루-그린 필터 큐브 | ZEISS | 489038-9901-000 | 필터 세트 38 HE |
| 컨포칼 현미경 | ZEISS | LSM 980 | |
| D-(+)-글루코스 | 시그마-알드리치 | G7528 | |
| 엑셀 ( 2016) | https://www.office.com/ | ||
| 펨토젯 | Eppendorf | 5252000013 | 이 장비는 공압식 마이크로 펌프로, 정확한 부피 공급이 가능하며 캐필러리 홀더가 함께 제공됩니다. 우리는 마이크로 펌프 Femtojet(사출 압력 500-1000hPa, 보상 압력 = 0hPa, 배송 시간 = 1초)을 사용합니다. |
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| FIJI, ImageJ 버전 사용: 1.51c | https://fiji.sc/ | ||
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| 마이크로캐필러리용 마이크로로더 팁 0.5 – 20 &마이크로; L, 100mm | Eppendorf | 5242956003 | 유리 캐필러리에 솔루션을 로드하는 긴 팁 |
| Micro-tweezers | Dumont Swiss made | 0102-4-PO | 우리는 마이크로 핀셋을 사용하여 장착 중에 제브라 피쉬 유충을 이동하고 유리 모세관의 끝을 잘라냅니다 (예 : 뒤몽, 사이즈 4). |
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참고문헌
- Speier,, et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocol. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Jacob, S., et al. In vivo....
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