생체 내 β세포 기능을 조사하기 위한 살아있는 제브라피시의 칼슘 이미징 및 포도당 자극 동시

요약

여기에서 이 연구는 생체 내에서 제브라피쉬의 췌장 β세포의 칼슘 이미징 및 포도당 자극을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

췌장 β세포는 혈당 수치에 따라 인슐린을 생산하고 분비하여 전신 포도당 항상성을 유지합니다. β세포 기능의 결함은 당뇨병으로 이어질 수 있는 고혈당증과 관련이 있습니다. 인슐린이 분비되는 과정에서 β세포는 Ca²⁺의 유입을 경험합니다. 따라서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 사용하여 포도당 자극 Ca²⁺ 유입을 이미징하면 β세포 기능을 연구할 수 있습니다. 이전에 연구에 따르면 GCaMP6를 발현하는 고립된 제브라피시 섬은 정의된 포도당 농도로 자극할 때 상당한 Ca²⁺ 활성을 나타냅니다. 그러나 β세포가 포도당에 어떻게 반응하는지 연구하는 것이 가장 중요하며, 포도당은 단독으로 반응하는 것이 아니라 전신적으로 연결되고, 혈관화되고, 조밀하게 신경분포되어 있는 본래 환경에서 포도당에 반응합니다. 이를 위해 이 연구는 발달 초기 단계에서 제브라피시 유충의 광학적 투명도를 활용하여 생체 내에서 β세포 활동을 조명했습니다. 여기에서는 in vivo에서 β세포 기능을 조사하기 위한 Ca²⁺ 이미징 및 포도당 자극에 대한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 분해능으로 β-세포에서 조정된 Ca²⁺ 역학을 모니터링할 수 있습니다. 게다가, 이 방법은 작은 분자 펩티드와 같은 어떤 주사 가능한 해결책든지 사용하기 위하여 적용될 수 있습니다. 전체적으로 이 프로토콜은 생체 내에서 섬 조정을 조사하고 환경 및 유전적 요소가 β세포 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 특성화할 수 있는 제브라피시 모델의 잠재력을 보여줍니다.

서론

췌장 β세포는 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 독특한 능력을 나타냅니다. 탄수화물이 풍부한 식사를 한 후에는 혈당이 증가하여 β세포로 들어가 빠르게 대사되어 ATP를 생성합니다. ATP/ADP의 세포 내 비율의 증가는 ATP 의존성 K⁺ 채널의 폐쇄로 이어지며, 세포막을 탈분극시키고 전압 의존성 Ca²⁺ 채널을 활성화합니다. 세포 내 Ca²⁺ 의 급격한 증가는 β세포의 인슐린 과립 분비를 자극합니다.

생쥐의 온전한 췌장 내에 있는 섬 세포의 이미징은 까다롭고 전체 장기의 외부화가 필요합니다. 비침습적 in vivo 이미징을 위한 강력한 대안은 마우스¹의 눈의 전방(AC)에 섬을 이식하는 것입니다. 마우스의 AC에 이식된 섬은 in vivo 환경을 모방하여 종단 연구 및 Ca²⁺ 이미징 in vivo ^2,3을 가능하게 합니다. 그럼에도 불구하고, 섬 혈관재생은 섬 이식 후 몇 주가 걸릴 수 있다

프로토콜

이 연구에서 사용된 이전에 확립된 형질전환 라인은 Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. 모든 실험은 유럽연합 및 독일 법률(Tierschutzgesetz)에 따라 드레스덴 공과대학교(TU Dresden) 및 작센 작센 공과대학(Landesdirektion Sachsen) 윤리위원회(승인 번호: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016, T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018, TVV33-2019)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 연구에서는 동물 보호법(TierSchVersV §14)에 명시된 대로 수정 후 5일(dpf) 단계를 초과하지 않는 제브라피시 유충을 대상으로 모든 생체 내 이미징 및 포도당 주사와 실험 절차를 수행했습니다. EU 지침 2010/63/EU에 따르면 이러한 초기 제브라피시 단계를 사용하면 3R의 원칙에 따라 실험 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

1. 준비

결과

이 프로토콜을 사용하여 네이티브 환경에서 개별 β 세포의 포도당 반응을 특성화했습니다. 이를 위해 제브라피쉬 유충은 유리 바닥 페트리 접시에 장착됩니다. 3D 매니퓰레이터를 사용하여 SV를 대상으로 하는 유리 모세관을 순환에 삽입했습니다(그림 1 및 그림 2). 이를 통해 정의된 농도의 특정 부피의 용액을 주입할 수 있습니다. 동시에, 이미징 평면의 모든 β 세포에 대한 Ca²⁺ 의 포도당 유도 유입을 기록했습니다. 형광 강도 값은 FIJI¹⁷을 사용하여 추출되었습니다. 마지막으로, 각 β-세포에 대해 in vivo 에 대해 반응 시간을 평가했습니다(그림 3 및 보충 동영상 1). 이를 위해 GCaMP6s 신호의 변화는 그림 .......

토론

이 프로토콜에서는 단일 세포 해상도를 가진 기본 미세환경에서 β세포의 Ca²⁺ 역학을 조사했습니다. 이는 제브라피시 β세포를 순환계에 포도당 주입으로 자극하는 동시에 GCaMP6를 사용하여 Ca²⁺ 역학을 기록함으로써 가능합니다.

이 프로토콜은 세 가지 주요 이점을 제공합니다. 첫째, 연구자들은 제브라피시 β세포가 생체 내 포도당 자극에 대한 조정된 반응을 보인다는 것을 입증했습니다 ^7,13,18. 대조적으로, 세포 배양에서 β 세포의 반응은 종종 조정되지 않는 것으로 관찰되었다¹⁹. 따라서 in vivo 이미징은 β 세포의 생리적, 조정된 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35 mm 직경의 유리바닥 접시	Mattek	P35G-1.5-14-C	우리는 이 유리바닥 접시를 사용하여 제브라피쉬 유충을 장착하고 컨포칼 현미경을 수행합니다
블루-그린 필터 큐브	ZEISS	489038-9901-000	필터 세트 38 HE
컨포칼 현미경	ZEISS	LSM 980
D-(+)-글루코스	시그마-알드리치	G7528
엑셀 ( 2016)			https://www.office.com/
펨토젯	Eppendorf	5252000013	이 장비는 공압식 마이크로 펌프로, 정확한 부피 공급이 가능하며 캐필러리 홀더가 함께 제공됩니다. 우리는 마이크로 펌프 Femtojet(사출 압력 500-1000hPa, 보상 압력 = 0hPa, 배송 시간 = 1초)을 사용합니다.
펨토팁, 바로 사용할 수 있는 유리 모세관.	Eppendorf	5242952008	이 제품은 당긴 모세관을 대체할 수 있는 유리 모세관을 바로 사용할 수 있습니다.
FIJI, ImageJ 버전 사용: 1.51c			https://fiji.sc/
형광 램프	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
유리 모세관 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	우리는 이 유리 모세관을 사용하여 모세관 풀러
Injectman	Eppendorf	Piper로	이 장비는 모세관 홀더의 3D 조작을 허용합니다.
용융 아가로스	Biozym	Art. -Nr.: 840101	우리는 아가로스를 사용하여 제브라피쉬를 유리 바닥 접시에 장착합니다.
마이크로캐필러리용 마이크로로더 팁 0.5 – 20 &마이크로; L, 100mm	Eppendorf	5242956003	유리 캐필러리에 솔루션을 로드하는 긴 팁
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	우리는 마이크로 핀셋을 사용하여 장착 중에 제브라 피쉬 유충을 이동하고 유리 모세관의 끝을 잘라냅니다 (예 : 뒤몽, 사이즈 4).
미네랄 오일	Sigma-Aldrich	M5904	우리는 미네랄 오일을 사용하여
P-1000 차세대 피펫 풀러	과학 제품	P-1000	. P-1000 모세관 풀러는 열: 650, 당기기: 20, 벨: 160, 시간: 200, 압력: 500 매개변수와 함께 사용합니다.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	우리는 이 화합물을 사용하여 제브라피쉬 개발 중 색소 침착을 억제합니다
레드 필터 큐브	ZEISS	000000-1114-462	필터 세트 45 HQ TexasRed
실체 현미경	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
주사기 필터, 멸균. 기공 크기 0.2 µ m	Pall 코퍼레이션	4612	우리는 이것을 사용하여 모든 용액을 걸러내고 모세관 바늘 의류
형질전환 제브라피시 라인을 방지합니다.Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(인스:GCaMP6s; cryaa:mCherry)
트리카인 메탄설포네이트(MS222)	시그마-알드리치	E10521	우리는 이 화합물을 사용하여 물고기 유충을 마취합니다.

. 당겨 주입 모세혈관을 준비합니다5192000019 낮은 유리 을 주입하기 위해 입자 크기를 보정합니다.