Method Article

온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 Bilayer의 특성화

DOI:

10.3791/62362

⸱

April 19th, 2021

 , 
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 높은 용융 온도와 지질에 대한 지질 단층 조립 및 방울 인터페이스 이중 층 형성을 촉진하기 위해 피드백 온도 제어 가열 시스템의 사용을 자세히 설명, 멤브레인의 온도 중심변화를 특성화하는 커패시턴스 측정.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지질 코팅 수성 물방울 사이에 지질 이중층(즉, DIBs)을 조립하는 물방울 인터페이스 바이레이어(DIB) 방법은 다른 방법에 비해 주요 이점을 제공합니다: DIB는 안정적이고 종종 오래 지속되며, 이중층 영역은 가역적으로 튜닝될 수 있으며, 리플렛 비대칭은 방울 조성물을 통해 용이하게 조절되고, 양층과 같은 많은 양층 네트워크와 같은 양층 렌즈에 의해 용이하게 제어된다. DIB를 형성하려면 물방울 표면의 고밀도 지질 단층으로 지질의 자발적인 조립이 필요합니다. 이것은 일반적인 합성 지질을 위한 실온에서 쉽게 생기는 동안, 충분한 단층 또는 안정한 이중층은 몇몇 세포 지질 추출물을 포함하여 실온 위의 융점을 가진 지질을 위한 유사한 조건에서 형성하는 것을 실패합니다. 이 행동은 모형 막 연구 결과에서 DIBs의 조성 및 아마 생물학 관련성 -를 제한했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 DIB 방울을 호스팅하는 오일 저장소를 조심스럽게 가열하고 지질 막에 온도가 미치는 영향을 특성화하기 위해 실험 프로토콜이 제공됩니다. 특히, 이 프로토콜은 피드백 루프에 의해 제어되는 열 전도성 알루미늄 기구 및 저항 가열 원소를 사용하여 더 넓은 지질 유형에 대한 단층 조립 및 이중층 형성을 향상시키는 높은 온도를 처방하는 방법을 보여줍니다. 멤브레인의 구조적 특성뿐만 아니라 이중층을 포함하는 지질의 열TROPIC 상 전이는 DIB의 전기 커패시턴스의 변화를 측정하여 정량화된다. 이 절차는 다중 성분 지질 혼합물에 대한 효과적인 용융온도(TM)를결정하는 것을 포함하여 다양한 온도에 걸쳐 모델 멤브레인에서 생물 물리 학적 현상을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기능은 따라서 모형 막에 있는 자연적인 위상 전이의 더 가깝게 복제하고 더 나은 그들의 세포 대조물의 이질성을 포착하는 것을 포함하여 막 성분의 더 넓은 swath에서 모형 막의 형성 그리고 사용을 격려할 것입니다.

Introduction

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세포막은 모든 살아있는 세포를 캡슐화하고 세분화하는 수천 가지 지질 유형1,단백질, 탄수화물 및 스테롤로 구성된 선택적으로 투과성 장벽입니다. 그들의 구성이 그들의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 이해하고 자연 및 합성 분자가 세포막과 상호 작용, 준수, 중단 및 배할당하는 방법을 밝히는 방법, 따라서 생물학, 의학, 화학, 물리학 및 재료 공학에 광범위한 영향을 미치는 연구의 중요한 영역입니다.

이러한 발견을 목표로 하는 목적은 세포 측의 구성, 구조 및 운송 특성을 모방한 합성 또는 자연발생 지질에서 조립된 지질 이중층을 포함하여 모델 멤브레인을 조립, 조작 및 연구하기 위한 입증된 기술의 직접적인 이점을 누릴 수 있습니다. 최근에는, 액적 인터페이스 바이레이어(DIB) 방법2,3,4는 지질 코팅물 양적물 사이의 평면 지질 이중층을 생성하기 위한것으로, 5,6,7,

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Protocol

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1. 가열 된 설비 준비

  1. 각각 25mm x 40mm로 트리밍된 1mm 두께의 절연 고무 2개, 각각 25mm x 40mm의 6mm 두께 고무 2개, 알루미늄 베이스 설비의 관측 창에 맞는 알루미늄 베이스 설비 조립품 및 아크릴 오일 저장소 2개(그림 S1, S2, S3 참조). UV 경화 접착제가 있는 유리 커버슬립 보기 창에 부착하고 1 저항 가열 요소를 고정물의 각 25mm x 25mm 측면 플랜지의 상단에 부착하여 알루미늄 설비를 먼저 준비합니다.
  2. 각 조각의 긴 가장자리가 무대 개구부(도 1)에접선될 정도로 더 얇은 고무 조각을 현미경의 무대에 놓습니다.
  3. 알루미늄 베이스 설비를 절연 패드 위에 배치하고 객관적인 렌즈 위에 고정물의 시야 창을 배치합니다. 연결된 액적을 이미징하려면 적절한 정렬이 필요합니다.
  4. 각 저항 가열 요소 위에 고무의 두꺼운 조각을 배치하고 장소에 그것을 유지하기 위해 현미경 무대 클립을 사용합니다. 이 조각들은 무대 클립으로 인한 손상으로부터 가열 요소를 보호하고 가열 요소와 알루미늄 설비 및 현미경 단계 사이의 우발적 인 전기 단락으로부터 절연합니다.
  5. 열전대의 측정 끝을 조심스럽게 구부려 끝에....

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Results

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도 1은 알루미늄 설비 및 아크릴 오일 저장소가 DIB 형성을 위한 현미경 단계에서 어떻게 제조되는지를 보여줍니다. 조립 단계 1.2-1.4는 보다 효율적인 가열을 위해 단계에서 설비를 열로 절연하는 역할을 합니다. 1.5-1.7 단계는 열전대를 고정장치에 올바르게 부착하고 오일 저장소를 배치하는 방법을 보여주며, 1.8 -1.9 단계는 이 조각에 오일을 분배하는 데 권장되는 위치를 보여줍니다.

도 2는 피드백 온도 제어를 설정하고 DIB에서 전기 측정을 수행하는 데 사용되는 구성 요소를 간략하게 설명합니다: PC, 고정 게인 전력 증폭기, 패치 클램프 증폭기 및 DAQ 시스템(또는 전압을 적용하고 pA-nA 레벨 전류를 측정하기 위한 동등한 기기), 적절한 아날로그 입력 및 출력을 갖춘 두 번째 DAQ, 파형 발전기, 조립된 알루미늄 기구. DAQ-2는 두 개의

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 명세서에 기재된 프로토콜은 DIB를 형성하는 데 사용되는 오일 및 물방울의 온도를 제어하기 위해 실험 시스템을 조립하고 운영하기 위한 지침을 제공한다. 특히 RT 이상의 온도가 녹는 지질을 사용하여 DIB 형성을 가능하게 하는 데 특히 유용합니다. 더욱이, 오일 저수지의 온도를 정밀하게 변화시킴으로써, 이중층 온도는 커패시턴스, 면적, 두께, 유도된 열tropic 상 변화, 막 활성 종의 운동, 및 이중층인터페이스(37,38)의정력성을 포함한 다양한 멤브레인 특성 및 특성에 대한 높은 온도의 영향을 연구하기 위해 조작될 수 있다.

프로토콜은 DIB 연구에서 사용하기 전에 세 부분으로 구성됩니다: 1) 가열된 단계 기구의 준비 및 조립; 2) 다양한 악기를 연결; 및 3) 선택한 비례 및 일체형 제어 이득으로 적절한 온도 제어 성능을 확인합니다. 2부에서 가장 중요한 경우 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

재정 지원은 국립 과학 재단 그랜트 CBET-1752197및 과학 연구 보조금 FA9550-19-1-0213의 공군 사무실에 의해 제공되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25mm x 40mm x 1mm 절연 고무(x2)Any는 현미경의 스테이지에서 알루미늄 고정 장치의 바닥을 절연
25mm x 40mm x 6mm 절연 고무(x2)Any는 현미경에 의해 발열체가 손상되지 않도록 보호하고, 스테이지는 발열체 상단을 클립하고 절연합니다.
3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산 Sigma AldrichM3183지질 용액용 완충제
아크릴 기판HTD_STG_2~1000 uL 아크릴 우물에서 제작되었으며, 포카 요크 외부 프로필이 있어 방향을 고정합니다
. 알루미늄 조명기구는 집에서 제작되었으며,오일웰이 아실릭 조명기구를 보유하고 있으며, 오일 웰에 인접한 두 개의 평평한 패드를 포함하여 발열체를 위한 HTD_STG_1 베이스 조명기구입니다.
Brain Total Lipid ExtractAvanti131101C-100mg25 mg/mL 돼지 지질 추출물 
컴팩트 DAQ 섀시 (cDAQ)National Instruments cDAQ-9174 여러 유형의 센서 측정 또는 출력 모듈을 수용하는 섀시
데이터 수집 시스템(DAQ)분자 소자 디지데이터 1440A 고해상도 아날로그-디지털 변환기
고정 이득 증폭기/전원 공급 장치Hewlitt PackardHP 6826A는 전압 출력 모듈인
Glass Cover SlipCorningCLS284525알루미늄 베이스의 바닥을 밀봉하고 이중층의 광학적 특성을 가능하게 합니다.
발열체 (x2)OmegaKHLV-101/525 mm x 25 mm 폴리미드 필름 Kapton 발열체는 5 와트 전력 제한이 있습니다.
M3 스테인레스 스틸 스크류McMaster Carr90116A150알루미늄 조명기구에 열전대를 고정
클램프 증폭기분자 장치 액소패치 200B 전류를 측정하고 전압을 헤드스테이지로 출력
개인용 컴퓨터다중 고속 USB 포트와 최소 6 Gb의 램이 있는모든
염화칼시그마 알드리치P3911해리 이온의 전해질 용액
온도 입력 모듈National Instruments NI 9211cDAQ 섀시
열전대OmegaJMTSS-020U-6 직경이 0.02인치이고 길이가 6인치인 U형 열전대
UV 경화성 접착제Loctite19739유리 커버슬립을 알루미늄 베이스 조명기구에 고정합니다.
전압 출력 모듈National Instruments NI 9263아날로그 전압 출력 모듈
 10mV 10Hz 정현파 파형을 출력하는 데 사용됩니다.
합니다.은 합니다. 패치 컴퓨터륨 은 는 cDAQ 섀시 웨이브폼 생성기 Agilent 33210A와 함께 사용하기 위한

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H.

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Droplet Interface BilayerLipid Bilayer AssemblyTemperature ControlMembrane CapacitancePatch Clamp AmplifierThermotropic Phase TransitionBilayer Area TuningIon Channel FormationModel Membrane CharacterizationLipid Melting Temperature

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