고분해능 C18 RP-nano-HPLC 컬럼 패킹을 위한 강력한 방법

요약

여기에서는 LC-MS/MS 단백질체학 워크플로우를 사용하여 펩타이드 특성 분석을 위한 저비용 역상 나노 흐름 액체 크로마토그래피 컬럼을 만들기 위한 프로토콜을 제시하고 평가합니다.

초록

생물학적 시료에 널리 퍼져 있는 높은 복잡성으로 인해 효과적인 분석을 위해 높은 감도와 분해능을 가진 크로마토그래피 분리가 필요합니다. 여기에서는 기존의 상향식 단백질체학 워크플로우에서 질량 분광계에 도입 및 검출하기 전에 분석 펩타이드를 온라인 분리하기 위한 나노 흐름 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 컬럼 준비를 위한 강력하고 재현 가능하며 저렴한 프로토콜을 소개합니다. 실험의 목적과 분리되는 분석물질의 화학적 특성에 따라 최적의 컬럼 파라미터는 내부 또는 외부 직경, 길이, 입자 크기, 공극 크기, 고정상 입자의 화학적 성질, 팁에 통합된 전기 분무 이미터의 유무에 따라 달라질 수 있습니다. 자체 컬럼 패킹 시스템을 사용하면 원하는 특성을 가진 컬럼을 신속하게 제작할 수 있을 뿐만 아니라 공정 비용을 크게 절감할 수 있습니다. 여기에서 논의된 C18 AQ(수성) 용융 실리카 컬럼 패킹을 위한 최적화된 프로토콜은 분석물질의 효과적인 분리를 달성하기 위한 다양한 액체 크로마토그래피 기기와 호환됩니다.

서론

HPLC 컬럼은 제약, 의료 및 환경 연구 분야의 생산성에 크게 기여했습니다 1,2,3,4. 고품질 크로마토그래피 컬럼에 접근하는 것은 복잡한 분석물질의 분획에서 중추적인 단계입니다. 샷건 단백질체학에서는 전기분무 이온화(ESI) 질량분석법(MS)을 나노플로우 크로마토그래피 ^5,6,7,8에 결합하여 높은 분석 감도를 일상적으로 달성합니다. 수천 개의 펩타이드를 효율적으로 분리하는 것은 질량분석기가 높은 감도와 분해능으로 분석물을 식별하고 정량화할 수 있도록 하기 때문에 이 응용 분야에서 가장 중요합니다.

질량 분석 응용 분야를 위한 컬럼 패킹 분야는 고정상 형태학, 용매-입자 상호 작용 및 하드웨어 설계와 관련된 기본 컬럼 패킹 원리에 대한 이해가 발전함에 따라 최근 몇 년 동안 엄청난 성장을 목격하여 복잡한 생물학적 환경에서 광범위한 생체 분자의 상세한 특성화를 가능하게 했습니다 9,10,11,12,13,14 입니다. LC-MS 목적으로 분석 컬럼을 패킹할 때 실질적인 고려 사항을 강조하는 노력은 단백질체학 실험실에서 최대 성능 ^15,16,17,18을 약속하는 특정 관심사를 충족하는 자체 패킹 시스템을 개발할 수 있는 길을 열었습니다.

내부 직경이 50-150μm 범위이고 끝이 가늘어지는 나노 스프레이 컬럼은 전기 분무 이온화 목적에 매우 적합합니다. 샷건 단백질체학 분야에서 분리는 일반적으로 1.7에서 3.5 μm 사이의 입자 크기를 갖는 가장 일반적으로 소수성 탄소 사슬 결합 실리카 (C8-C30)인 패킹 된 비극성 고정상을 통해 흐르는 용매 구배를 사용하여 수행됩니다 19,20,21,22. 용리 분석물은 컬럼 내에 통합된 ESI 이미터를 통해 방출되며, 이는 용액상 분석물이 기체 이온으로 연질 이온화되도록 보장합니다. LC 컬럼과 ESI-MS의 결합은 탠덤 질량 분석법의 적용을 생물 의학의 단백질체학 전략에 크게 발전시켰습니다.

내부 직경이 좁은 LC 컬럼은 더 높은 보어(bore), 마이크로플로우(microflow) 컬럼에 비해 크로마토그래피 피크가 좁고 감도가 높기 때문에 단백질체학 워크플로우에 특히 유리합니다. 시판되는 사전 패킹 LC 컬럼은 편리함과 사용 편의성으로 인해 매력적인 옵션이지만, 엄청나게 비싸고 사내 옵션보다 유연성이 떨어질 수 있습니다. 이 작업의 목표는 융합 실리카 모세관과 단백질체학 응용 분야를 위한 사내 제작 압력 폭탄 시스템을 사용하여 좁은 내경 역상 HPLC 컬럼을 준비하기 위해 기술적으로 간단하고 저렴한 슬러리 패킹 접근 방식을 설명하는 것입니다.

프로토콜

1. 모세관 팁의 준비

1. 세라믹 절단석을 사용하여 내경(ID)이 75μm이고 외경(OD)이 360μm인 폴리이미드 코팅된 용융 실리카 모세관을 약 60-70cm로 절단합니다.
2. 손가락 사이에 4-5cm의 간격을 두고 손으로 모세혈관을 길이의 중간 정도까지 잡고 알코올 램프의 불꽃 위에서 회전시키면서 틈새 부분을 가열합니다. 유리가 보일 때까지 메탄올에 적신 낮은 보푸라기 티슈를 사용하여 탄 부분을 깨끗하게 닦습니다. (그림 1).
   참고: 폴리이미드 코팅된 용융 실리카 모세관의 4-5cm는 레이저 풀러에 로드하기 전에 노출되고 연마되어야 합니다.
3. ESI용 원뿔 모양의 이미터를 당기려면 열 값 300(레이저 출력 2W에 해당), 속도 10(0.25mm/s에 해당) 및 지연 180밀리초의 특수 프로그램 설정이 있는 레이저 팁 풀러를 사용하여 ~1-5μm 직경 팁을 얻습니다(그림 2 및 그림 3A). 연마된 모세관 부분을 레이저 풀러에 로드하고 프레스 풀(Press Pull)을 누르면 두 개의 빈 모세관 컬럼을 포장할 준비가 됩니다.
   알림: 모든 단계에서 팁의 빈번한 검사는 현미경을 사용하여 수행됩니다. 설정은 레이저 풀러마다 다를 수 있으며 경험적으로 결정해야 합니다.

2. 팁의 중합/에칭

1. 모세관 내의 고정상 입자를 유지하기 위해, 두 개의 규산칼륨 용액과 포름아미드의 혼합물로부터 다공성 프릿을 준비한다. 사용 직전에 2mL 튜브에 용액을 넣고 와류를 사용하여 혼합합니다.
   1. SiO₂/K₂O 비율이 2.50(w/w) 및 1.65(w/w)인 두 개의 규산칼륨 용액과 포름아미드를 각각 1:3:1(v/v/v)의 비율로 혼합합니다. 예를 들어, 100μL의 규산칼륨과 SiO₂/K₂O 비율 2.50(w/w), 300μL 규산칼륨과 SiO₂/K₂O 비율 1.65(w/w)), 100μL의 포름아미드를 혼합한 후 볼텍싱을 수행합니다. 이 용액은 가열되면 중합되어 다공성 프릿을 생성합니다.
2. 레이저로 뽑은 모세관 끝을 프릿 현탁액(침전물이 아님)의 투명한 모액에 약 10-20초 동안 담그고 모세관 작용으로 팁 안으로 약 5mm 침투할 수 있도록 합니다. 팁의 너비에 따라 팁을 프릿 용액에 더 오래 담가야 할 수도 있습니다. 일반적으로 용액이 팁에 더 빨리 들어갈 수 있기 때문에 팁이 넓으면 침지 시간이 짧아집니다.
3. 팁을 따라 뜨거운 납땜 인두(350°F로 설정)를 놓고 현미경으로 모세관을 검사하는 동안 프릿 용액의 중합을 시작합니다. 그림 3 을 참조하여 중합 전(그림 3A)과 중합 후(그림 3B) 당긴 팁을 확인하십시오.
4. 프릿 중합 후 이미터가 막히는 것을 방지하려면 컬럼 팁을 50% 불화수소산(HF) 용액에 5분 동안 담그십시오(설정은 그림 4 참조). HF 에칭은 또한 컬럼에 평평한 원뿔 모양의 형상을 부여하여 수명을 연장합니다. HF 에칭 후에는 컬럼 팁을 먼저 HF 중화제로 철저히 세척한 다음 물로 넉넉하게 세척하여 산과의 접촉을 방지합니다.
   주의 : HF는 매우 위험하고 부식성이 있는 화학 물질입니다. 노출을 방지하기 위해 취급하는 동안 각별한 주의가 권장됩니다. HF가 "위험! 급성 독소".
   1. 안전을 위해 HF를 다루는 동안 니트릴 및 네오프렌 장갑을 이중으로 겹쳐 착용하는 것 외에도 일반 및 불연성 실험실 코트를 모두 사용하십시오.
      참고: 모세관 팁을 frit 하는 것은 선택 사항입니다. 그러나 그것은 기둥을 막힘에 훨씬 더 잘 견디게 하고 수명을 증가시킵니다. 전기 분무 이미터가 통합된 빈 용융 실리카 모세관 컬럼은 상업적으로 이용 가능하며 필요한 경우 1단계와 2단계를 대체하는 데 사용할 수 있습니다.

3. 고정상의 준비

1. 300 μL의 메탄올에서 1.9 μm 입자 크기와 120 Å 공극 크기를 가진 25-50 mg의 완전 다공성 ReproSil-Pur 120 C18-AQ 실리카 입자를 현탁시킵니다. 메탄올에 있는 슬러리 입자의 균질한 혼합물을 보장하기 위해 약 20회 동안 피펫을 위아래로 움직입니다.
2. 슬러리 현탁액이 들어있는 튜브를 사내에서 제작 한 컬럼 패킹 폭탄 시스템의 압력 셀 챔버 내부에 배치하고, 슬러리 입자가 현탁액을 유지할 수 있도록 자석 교반기 위에 설정합니다. 패킹 중 HPLC 슬러리가 중단되지 않도록 일정한 압력에서 작동하는 헬륨 탱크(<1500psi)에 폭탄을 연결합니다. (그림 5에 나타난 개략도).
3. 그림 6A와 같이 볼트로 제자리에 조여 압력 셀의 뚜껑을 고정합니다.
   참고: HPLC 펌프와 HPLC 패킹 폭탄의 작동 차이를 이해하는 것이 중요합니다. 전자는 컬럼의 고정상에 의해 가해지는 배압에 관계없이 일정한 유속으로 작동하도록 설계되었지만, HPLC 패킹 압력 시스템은 일정한 압력으로 작동하여 모세관 컬럼 길이 전체에 걸쳐 고정상 입자의 끊김 없고 조밀한 패킹을 보장합니다.

4. 정지된 단계를 가진 란 패킹

1. 컬럼의 끝이 위쪽을 향하도록 압력 폭탄 상단의 손가락으로 조이는 피팅을 통해 컬럼 하단을 먼저 끼우십시오. 슬러리가 들어 있는 바이알 바닥에 닿을 때까지 컬럼을 밀어 넣고 바닥에서 1-2mm 위로 집어넣습니다. 손가락으로 조이는 피팅(Fitting)을 조여 컬럼을 제자리에 고정합니다.
2. 패킹 폭탄을 헬륨 가스 탱크(권장 압력 < 1500psi)에 연결하고 ~ 1300psi의 압력으로 켭니다. 헬륨 가스는 3방향 밸브를 통해 슬러리가 들어 있는 바이알을 수용하는 압력 셀로 들어갑니다. 밸브를 시계 방향으로 180° 천천히 돌려 엽니다.
   참고: 헬륨 가스가 챔버 내부로 흐르기 시작하자마자 슬러리를 튜브에서 모세관으로 밀어 넣습니다. 슬러리가 컬럼을 통과할 때 입자는 모세관에 유지되고 용매는 컬럼 끝에서 액체 방울을 형성합니다(그림 6B).
   1. 컬럼 팁에 액체 방울의 형성이 지연되면 팁을 빠르게 화염에 노출시켜 팁이 열렸는지 확인합니다. 이 단계에서 컬럼 뒤에 배치된 광원은 패킹 공정의 진행 상황을 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다(그림 7). ID가 75μm인 컬럼의 경우 약 30cm 길이의 포장하는 데 일반적으로 ~30-60분이 걸립니다.
   2. 컬럼을 통한 슬러리의 흐름이 멈추거나 느려지면 패킹 폭탄의 손가락으로 조이는 피팅 위로 모세관을 단단히 잡고 약 1/4 바퀴 돌려 약간 풉니다(감압의 쉿하는 소리가 들릴 수 있음).
      참고: 이렇게 하면 폭탄을 완전히 감압할 필요 없이 컬럼을 재배치할 수 있습니다.
   3. 이제 컬럼을 위아래로 움직여 컬럼의 위치를 부드럽게 재조정한 다음 컬럼이 바이알 바닥에 닿지 않도록 손가락으로 조이는 피팅을 다시 조입니다. 이것은 항상 모세관을 통한 슬러리의 균일한 흐름을 보장합니다.
   4. 앞서 언급 한 조치로 포장이 재개되지 않으면 밸브를 닫고 포장 폭탄을 배출하고 뚜껑을 풀고 슬러리를 검사하여 침전물이 없는지 확인하십시오. 또한 컬럼 끝이 고체 고위상 입자로 막혔을 수도 있으며, 이 경우 모세관 뒤쪽에서 작은 길이를 절단하면 흐름을 재개하는 데 도움이 될 수 있습니다.
3. 컬럼 끝에서 원하는 길이보다 몇 cm 더 길게 패킹하여 고정 입자가 완전히 패킹되도록 하고 패킹된 컬럼에 헬륨 기포가 유입될 가능성을 최소화합니다.

5. 란을 끝내고 back-frit를 만들기

1. 원하는 패킹 길이에 도달하면 헬륨 가스 탱크의 메인 밸브를 닫고 컬럼이 균일하게 패킹되고 시스템이 자체 감압될 때까지 최소 15분 동안 기다립니다.
   참고: 컬럼 끝에 빈 용융 실리카로 인해 He 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 더 긴 패킹 길이를 사용하는 것이 좋습니다. 눈에 보이는 컬럼 부분이 압력 챔버 내부의 모세관 길이를 고려하여 패킹된 후에도 패킹 프로세스를 계속하는 것이 중요합니다. 또한 컬럼의 반복적인 재배치가 필요한 경우 더 긴 보압 길이가 권장되므로 기포가 적고 보압 효율이 높아집니다.
2. 밸브를 원래 위치로 시계 반대 방향으로 180도 회전하여 챔버의 압력을 부드럽게 낮춥니다. 컬럼을 단단히 잡고 손가락으로 조이는 피팅의 나사를 풀고 컬럼을 서서히 제거하십시오. 이 단계는 기포가 유입되지 않도록 매우 부드럽게 수행해야 합니다.
3. 기둥 끝을 25.5cm 길이로 자릅니다. 현미경으로 검사하는 동안 350°F에서 열간 납땜 인두를 사용하여 컬럼 뒤쪽 끝에서 0.5cm 길이의 슬러리를 제거합니다.
   1. 2.1단계에서 남은 프릿 용액에 컬럼의 뒤쪽 끝을 약 10초 동안 담그고 현미경으로 검사하면서 컬럼 뒷면을 따라 뜨거운 납땜 인두를 놓아 중합합니다. 백 프릿은 ReproSil-Pur 120 C18-AQ 입자가 컬럼에 남아 있도록 하고 크로마토그래피 세척 중 역류를 방지합니다.
      참고: 컬럼 뒤쪽의 프릿도 선택 사항이지만 2단계에서 앞면 프릿에 대해서도 언급했듯이 컬럼을 더 견고하게 만듭니다.

결과

컬럼의 성능을 평가하기 위해 HEK293 세포의 전체 세포 용해물에서 준비한 750ng의 트립틱 펩타이드 분해물을 프로토콜에 설명된 대로 벌크 ReproSil-Pur 120 C18-AQ 입자로 사내에서 충전된 25cm 길이, 75μm ID 용융 실리카 모세관을 사용하여 온라인으로 분획화했습니다. 샘플 로딩 전에, 컬럼을 아세토니트릴, 이소프로판올 및_H2O의 혼합물 6μL를 6:2:2의 비율로 세척하고 완충액 A(완충액 A: 3% DMSO를 함유한 물)로 사전 평형화했습니다. 트립틱 펩타이드 분해물은 70분 역상 구배를 사용하여 분석되었습니다. 용매 그래디언트는 버퍼 B(버퍼 B: 3% DMSO 및 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴)로 시작하여 400nL/min의 유속으로 4분에 걸쳐 0%에서 6%로 증가했습니다. 그런 다음 유속을 200nL/min으로 줄이고 6-25% 버퍼 B에서 시작하는 선형 그래디언트를 다음 58분 동안 컬럼에 적용했습니다. 버퍼 B를 8분 동안 25-32%로 더 증가시킨 후 컬럼 세...

토론

현대의 단백질체학 전략은 복잡한 생물학적 시스템을 효과적으로 분석하기 위해 고품질 크로마토그래피 분리에 의존합니다. 따라서 고성능의 비용 효율적인 나노플로우 LC 컬럼은 단일 워크플로우에서 수천 개의 단백질을 특성화하는 것을 목표로 하는 성공적인 탠덤 질량 분석 체제의 중요한 구성 요소입니다.

이 연구에서는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 만든 LC-MS/MS용 LC 컬럼 제품군의 성능과 신뢰성을 평가했습니다. 2년에 걸쳐 준비된 이러한 컬럼의 성능을 HEK293 세포 트립틱 분해물의 온라인 분획에 사용하여 테스트한 후 탠덤 질량 분석법을 사용하여 분석했습니다. 그림 8 및 그림 9에서 볼 수 있듯이, 크로마토그래피 용리 프로파일의 정렬과 식별된 펩타이드 및 단백질의 수와 같은 컬럼 파라미터의 비교는 재현 가능하...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
99.99% 포름아미드 산	시그마-알드리치		프릿
알코올 램프	모든 브랜드		제공용
브레흐뷸러 헬륨 압력 셀	BioSurplus		패킹 컬럼
세라믹 컬럼 커터	실리카 모세관 절단용	모든 브랜드
디메틸 설폭사이드(DMSO) ≥ 99%	시그마-알드리치		가연성 캐비닛에 보관
Formamide  ≥ 99.5%	Sigma-Aldrich		프릿 제작용
산(HF) (50%)	Fisher Scientific		중합 후 이미터 개방
KASIL(규산칼륨 용액)	PQ Corporation		frit
제작용 Lumos	Thermo Fisher Scientific		MS 데이터 수집용
P2000 Laser Puller	Sutter		모세관 당기기용
PTFE 1/16" 페룰 0.4mm ID(긴) 튜브 피팅용	Chromre	214104	폭탄 설정용
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
솔더링	모든 브랜드		폴리머화 시작용
스테인리스 스틸 파이프 피팅, 육각 커플링, 1/4 in. 폭탄 세팅용 암 NPT	스웨즈락	SS-4-HCG
, 용융 실리카, 75 &마이크로TSP075375 m ID x 360 &마이크로; OD	MOLEX/Polymicro	1068150019	컬럼 튜빙용
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC 타입