방법 논문

Ganglioside 추출, 정제 및 프로파일링

DOI:

10.3791/62385

⸱

2021년 3월 12일

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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강글리오사이드는 시알산 함유 글리코스핑고지질로서 뇌에 특히 풍부하다. 양친매성 성질은 최적의 회수와 정확한 분석을 보장하기 위해 유기/수성 추출 및 정제 기술을 필요로 합니다. 이 기사에서는 분석 및 분취 스케일 강글리오사이드 추출, 정제 및 박층 크로마토그래피 분석에 대한 개요를 제공합니다.

초록

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강글리오시드는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유하는 글리코스핑고지질이다. 그들은 모든 척추 동물 세포와 조직에서 발견되지만 특히 뇌에 풍부합니다. 주로 세포의 원형질막의 외부 전단지에서 발현되며, 측면 연결을 통해 세포 표면 단백질의 활동을 조절하고 세포 - 세포 상호 작용에서 수용체 역할을하며 병원균 및 독소의 표적입니다. 인간에서 강글리오사이드 생합성의 유전적 조절은 심각한 선천성 신경계 장애를 초래한다. 양친매성 특성으로 인해 강글리오사이드의 추출, 정제 및 분석에는 발견 이후 80 년 동안 많은 연구자가 최적화 한 기술이 필요합니다. 여기에서는 몇 시간 안에 완료 할 수있는 조직 및 세포에서 주요 강글리오사이드의 추출, 정제 및 예비 정성 및 정량 분석을위한 벤치 수준의 방법을 설명합니다. 우리는 또한 뇌에서 주요 강글리오사이드 종의 대규모 분리 및 정제를위한 방법을 설명합니다. 함께, 이러한 방법은 생리 활성 분자의이 클래스에 대한 분석 및 준비 규모 액세스를 제공합니다.

서론

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강글리오시드는 하나 이상의 시알산 잔기를 보유하는 글리코스핑고지질1로 정의된다. 이들은 주로 원형질막의 외부 전단지에 매립된 그들의 소수성 세라미드 지질 모이어티와 세포외 공간으로 연장되는 그들의 친수성 글리칸과 함께 세포 표면에서 발현된다2. 척추 동물 세포와 조직에 널리 분포되어 있지만, 척추 동물의 뇌3에 특히 풍부하며, 처음 발견되어 명명되었습니다4.

강글리오사이드 글리칸의 구조는 다양하며 그 명명법의 기초가 됩니다(그림 1). Ganglioside 글리칸은 시알산의 다른 수와 분포를 지닌 중성 설탕 코어로 구성됩니다. 가장 작은 강글리오사이드인 GM4는 단 두 개의 설탕(갈락토오스에 결합된 시알산)5만을 가지고 있다. 더 큰 자연 발생 신경절은 단일 중성 코어에 수십 개의 총 설탕6 또는 최대 일곱 개의 시알산을 함유할 수 있습니다7. 이들의 세라미드 지질 모이어티는 또한 다양하며, 상....

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프로토콜

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조직 수집은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 조건 하에서 수행되었다.

1. 소규모 강글리오사이드 추출 및 부분 정제

주의: 휘발성 및 독성 용매로 작업할 때는 적절한 환기를 사용하십시오. 플라스틱을 전체적으로 피하십시오. 용매는 후속 분석을 방해하는 많은 플라스틱에서 화학 성분을 추출합니다. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)은 예외이고; PTFE 라인 클로저는 유리 저장 바이알을 캡핑하는 데 사용해야합니다.

  1. 추출
    1. 신선하거나 해동된 단일 마우스 뇌(또는 시상 반뇌, ~0.2-0.5 g)를 칭량하고 얼음 양동이에 미리 냉각된 포터-엘베젬 균질기에 넣는다.
      참고 : 이전에 냉동 된 뇌는 0-4 °C에서 해동 한 후에 사용할 수 있습니다.
    2. 젖은 물 중량 g 당 4.1 mL의 조직을 넣고 10 스트로크로 균질화하십시오.
      참고 : 정확한 용매 비율은 최적의 추출 및 분할의 핵심이며, 뇌 조직이 80 % 수성이라고 가정하면 클로로포름 - 메탄올 - 수성 (4 : 8 : 3)이 목표입니다.
    3. 조직 g 당 13 mL의 습윤 중량의 메탄올을 첨가하고, 주위 온도 (22°C)로 이동시키고, 혼합한다.
      참고:....

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결과

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섹션 1 (소규모)에 설명 된 방법은 주요 뇌 신경절의 질적 및 양적 결정을 위해 충분한 양과 순도로 강글리오사이드를 제공합니다. 마우스 뇌로부터의 회복은 기재된 바와 같이 제조될 때 뇌 습윤 중량 g 당 ~1 μmol 강글리오시드 (1 nmol/μL)이다. 섹션 3을 이용한 1 μL(1 nmol)의 TLC 분해능은 레조르시놀 검출을 위한 충분한 물질을 제공하고, 도 4의 야생형 및 유전자 변형 마우스에 대해 나타낸 바와 같이 모든 주요 뇌 신경절을 해결한다. 섹션 1을 사용하여 제조된 혼합 강글리오시드는 다른 주요 지질이 없지는 않지만, 강글리오시드는 도 5에 도시된 바와 같이 질량 분광법(MS) 결정을 위해 충분한 순도를 가지며, 음성 모드에서 천연 정제된 강글리오시드로서 또는 양성 모드9에서 과메틸화 후에 존재한다. 섹션 1은 인지질을 제거하기 위해 알칼리성 가수분해를 피하기.......

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토론

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여기에 보고된 소규모 및 대규모 강글리오시드 추출 및 단리를 위한 방법은 독특하지 않다-우수한 결과를 제공하는 많은 상이한 용매 추출 및 정제 접근법이 있다12. Fredman과 Svennerholm13의 뇌로부터의 소규모 정화를 위해 여기에 보고된 방법은 회복을 최적화하는 것으로 나타났으며 우리 실험실에서 수년 동안 견고하고 직접적인 것으로 입증되었습니다. TLC 및 MS에 적합한 단리 및 정제는 무손상 조직으로부터 단리된 강글리오시드까지, 수 시간 내에 용이하게 완료될 수 있다. MS는 음성 모드에서 또는 양성 모드에서 퍼메틸화 후 천연 정제된 강글리오시드 상에서 수행될 수 있다 (도 7, 예를 들어, Sturgill et al.9 참조). 수율은 대부분의 포유동물에 대해 신선한 뇌 조직 g 당 1 μmol 강글리오시드 (≈ 2 μmol 강글리.......

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공개 사항

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저자는 경쟁 이익이 없다고 주장합니다.

감사의 글

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이 연구는 국립 보건원 (NIH) 글리코 사이언스 보조금 U01CA241953을위한 공통 기금에 의해 지원되었습니다. MJP는 존스 홉킨스 (T32GM080189)의 화학 생물학 인터페이스 프로그램 (T32GM080189)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 뇌, 벗겨진PelFreez57105-1
Ganglioside 표준MatreyaGM1, 1061; GD1a, 1062년; GD1b, 1501년; GT1b, 1063
PTFE 라이닝 캡이 있는 유리병Fisher Scientific02-911-739
유리 원심분리기 병Fisher Scientific05-586B
유리 배양 튜브, 16 x 125mmVWR60825-430HPLC 분획 수집용
유리 분리 깔때기(2L)Pyrex6400-2L
주입 주사기 - Hamilton 1750 Gastight 500 &마이크로; l해밀턴81265
p-애니살데히드, 98%시그마-알드리치  A88107
Potter-Elvhjem HomogenizerFisher Scientific08-414-14A적절한 볼륨 옵션
선택 Reprosil 100 NH2 10µ m 5x4mm 가드 컬럼분석 - 상점AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μ m, 250mm x 20mm HPLC 컬럼분석 - 쇼핑맞춤형 포장기타 크기 사용 가능
레조르시놀Sigma-Aldrich30752-1
회전 증발기BuchiR-300
모델 7725 인젝터용 샘플 루프(5ml)Sigma-Aldrich57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35cc(10g)WatersWAT043350
Sep-Pak tC18 Plus 짧은 카트리지, 400 mgWatersWAT036810
스포팅 주사기 - Hamilton 701N 10 µ lHamilton80300
PFTE 라이닝 캡이 있는 두꺼운 벽 13mm 직경 시험관Fisher Scientific14-933A
PFTE 라이닝 캡이 있는 나사산 2ml 바이알Fisher Scientific14-955-323강글리오사이드 스토리지
TLC 플레이트의 경우 HPTLC 실리카겔 60 F254 다중 형식Fisher ScientificM1056350001 형광 함침(F254)으로 흡착제 안정화 표면
TLC 시약 분무기Fisher Scientific05-723-26A
10 x 10cm 플레이트용 TLC 러닝 챔버Camag22.5155
Waring 1리터 스테인리스 스틸 폭발 방지 블렌더WaringE8520

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
  2. DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of....

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Ganglioside ExtractionGanglioside PurificationGanglioside ProfilingThin Layer ChromatographySolid Phase ExtractionBrain GangliosidesLipid StainingSaponification MethodHPLC ResolutionMass Spectrometric Analysis

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