B형 간염 바이러스(HBV)유래 펩타이드 매트릭스에 기초하여, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응은 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프의 식별과 병행하여 평가될 수 있었다.
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방법 논문
펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석
이 논문에서
요약
초록
CD4 T 세포는 만성 B형 간염의 병인에 있는 중요한 역할을 합니다. 다목적 세포 집단으로서, CD4 T 세포는 분비한 사이토카인에 기초한 뚜렷한 기능성 하위 집합으로 분류되었습니다: 예를 들어, CD4 T 도우미 1 세포를 위한 IFN-γ, CD4 T 도우미 2 세포에 대한 IL-4 및 IL-13, CD4 T 여포 도우미 세포를 위한 IL-21 및 CD4 T 헬퍼 셀용 IL-17. HBV 유래 펩티드 자극 후 사이토카인 분비를 기반으로 한 B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD4 T 세포의 분석은 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응의 크기뿐만 아니라 HBV 특이적 CD4 T 세포의 기능적 서브세트에 대한 정보를 제공할 수 있었다. 전사학 및 메타볼로믹스 분석과 같은 새로운 접근법은 HBV 특이적 CD4 T 세포에 대한 보다 상세한 기능 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 접근법은 일반적으로 펩타이드-주요 조직적합성 복합-II 멀티머를 기반으로 실행 가능한 HBV 특이적 CD4 T 세포의 격리가 필요하며, 현재 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프에 대한 정보는 제한적이다. HBV 유래 펩타이드 매트릭스를 기반으로, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 평가하고 만성 HBV 감염 환자로부터 말초 혈액 단핵세포 샘플을 사용하여 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별하는 방법이 개발되었다.
서론
현재 항원 특이적 T 세포를 분석하는 3가지 주요 접근법이 있다. 첫 번째 접근법은 T 세포 수용체와 펩타이드 (epitope)사이의 상호 작용에 기초한다. 항원 특이적 T 세포는 펩티드-주요 조직적합성 복합체(MHC) 다중머로 직접 염색될 수 있다. 이 방법의 장점은 다운스트림 전사학/메타볼로믹스 분석에 적합한 실행 가능한 항원 특이적 T 세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법의 한계는 특정 항원에 대한 전체 T 세포 반응에 대한 정보를 제공할 수 없다는 것입니다, 특정 항원에 대한 확인된 에피토프의 수가 현재 제한되어 있는 동안 검증된 에피토프 펩티드가 필요하기 때문이다. B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD8 T 세포 에피토프에 비해, HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프가1,2로확인되어현재 HBV 특이CD4 T 세포의 분석에 덜 적용할 수 있게 되었다.
두 번째 접근법은 항원 펩타이드 자극3후 일련의 활성화 유도 마커의 업레조절에 기초한다. 일반적으로 사용되는 마커는 CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4를포....
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프로토콜
연구에 포함된 각 환자로부터 서면 통보 된 동의를 얻었다. 연구 프로토콜은 사우스 웨스트 병원의 의료 윤리위원회의 사전 승인에 반영된 1975 년 헬싱키 선언의 윤리 지침을 준수합니다.
1. HBV 유래 펩타이드 매트릭스의 설계
- NCBI 데이터베이스에서 HBV 코어 항원의 아미노산 서열을 다운로드합니다(GenBank: AFY98989.1).
- HBV 코어 항원 유래 펩티드(펩티드 합성 서비스 제공업체로부터 HBV 코어 항원 유래 펩타이드(351-메르 펩타이드 35개 패널)를 10잔류, 순도 > 90%, 4 mg/펩티드로 겹친다.
- 1 펩티드만 을 포함하는 매트릭스의 각 위치와 사각형 6×6 펩티드 매트릭스를 설정합니다. 12 펩티드 풀이 있습니다 : 6 행 펩티드 풀과 6 열 펩타이드 풀, 각 풀16에서5-6 펩타이드. 행렬의 행 펩티드 풀과 컬럼 펩타이드 풀은 HBV 코어 항원 2개의 분리된 형성을 나타낸다.
- 구입한 펩타이드의 3/4의 경우, 매트릭스의 동일한 행/열에 펩타이드를 디메틸 설프리산화물(DMSO)(각 펩타이드에 대해 2μg/μL)으로 함께 용해시킴으로써 12개의 별도의 펩타이드 풀에 펩타이드를 섞는다. HBV 특이CD4....
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결과
CD4 T 세포를 분비하는 사이토카인의 빈도는 단일 생산자와 이중 생산자 모두의 합으로 계산됩니다. 도 1에서입증된 바와 같이, TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 배경 제어(DMSO)에서 CD4 T 세포를 분비하는 IFN-γ 의 주파수는 각각 0.154% 및 0.013%이다. TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 펩타이드 풀 코어11에 특정 된 IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수는 각각 0.206 및 0.017, 그래서 TNF-α 분비 CD4 T 셀 응답 및 IFN γ 분비 CD4 T 셀 응답이 펩 티 드 풀에 대 한 부정적인 것으로 간주 됩니다. TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 펩타이드 풀 코어09에 특정 된 IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수는 각각 2.715 % 및 0.973 %이므로 TNF-α 분비 CD4 T 셀 응답 및 IFN-γ 비밀 CD4 T 셀 응답이 펩 타이드 풀에 대한 긍정적 인 것으로 간주됩니다.
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토론
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같이 나열됩니다: 1) PBMC 확장을 시작할 가능성이 높은 충분한 PBMC; 2) PBMC 확장에 적합한 환경; 및 3) 에피토프 식별 전에 PBMC 배양에서 잔류 펩티드 풀을 완전히 제거합니다.
이 프로토콜의 모든 분석은 CD4 T 셀의 강력한 증식에 따라 달라집니다. 일반적으로 10일 확장 후 PBMC 수는 초기 수의 2~3배입니다. 세포 수와 PBMC의 생존 가능성은 PBMC 확장의 2가지 주요 요소입니다. 목적은 에피토프 식별없이 HBV 특정 CD4 T 세포를 분석하는 경우, 혈액 샘플의 양이 제한되는 경우에 특히 초기 PBMC 수를 줄이는 것이 합리적이다. 우리의 경험에 따르면, PBMC의 시작 수는 1.5×105 셀 / 웰 미만인 경우 성공적인 PBMC 확장을 거의 얻을 수 없습니다. 확장에 신선한 PBMC를 사용할 때 셀 생존도 문제가 되지 않습니다. 확장에 극저온 보존 된 PBMC를 사용하는 동안, P.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81930061), 충칭자연과학재단(cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxxX0004), 중국키에 의해 지원되었습니다.
전염병 전문 프로젝트 (2018ZXX10723203).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알부민 소 V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC 활용 항 인간 TNF -&알파; | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | HLA-DRB1*0803 homozygote | |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | HLA-DRB1*1202 homozygote | |
| 세포 배양 플라스크 (T75) | Corning | 430641 | |
| 세포 배양 플레이트 (96-well, 평평한 바닥) | Corning | 3599 | 평평한 바닥 |
| 세포 배양 플레이트 (96-well, 둥근 바닥) | Corning | 3799 | 둥근 바닥 |
| 세포 여과기 | Corning | CLS431751 | Pore size 70 &뮤; m, 흰색, 멸균 |
| 원심분리기 튜브(15 mL) | KIRGEN | KG2611 | 멸균 |
| 원심분리기 튜브(50 mL) | Corning | 430829 | 멸균 |
| 원심분리기, 냉장 | Eppendorf | 5804R | |
| 원심분리기, 냉장 | Thermo | ST16R | |
| 원심분리기, 냉장 | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 | NaCl(8000mg), KCl(200mg), KH2PO4(200mg) 및 Na2HPO4.7H2O(2160 mg)를 포함하는 ddH2O(1000ml)를 준비합니다. PH를 7.4로 조정합니다. 오토클레이브를 통해 살균합니다. | ||
| Ficoll-Paque 프리미엄 | GE 헬스케어 | 17-5442-03 | |
| 필터 팁 (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | 멸균 |
| 필터 팁 (100-1000) | Kirgen | KG5333 | 멸균 |
| 필터 팁 (1-200) | Kirgen | KG5233 | 멸균 |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | 빛 |
| 정착성 생존도 염료 eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | 빛으로부터 보호 유지 |
| GolgiStop 단백질 수송 억제제(모넨신 포함) | BD Biosciences | 554724 | 단백질 수송 억제제 |
| 혈구계 | 브랜드 | 718620 | |
| HBV 코어 항원 유래 펩타이드 | 중국펩타이드 | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| 인간 혈청 AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa 유세포 분석기 | BD | ||
| L-글루타민 | Gibco | 25030081 | 100ml |
| 마이크로 원심분리기 튜브(1.5mL) | Corning | MCT-150-C | 전 고압멸 |
| Microplate Shaker | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR 튜브 (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | 로부터 보호해 주세요 |
| ; | eBioscience | 12-7319-42 | 빛으로부터 보호 유지 |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | 100ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | 빛으로부터 보호 유지 |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| 재조합 인간 IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 재조합 인간 IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI 매체 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| 피루브산 나트륨, 100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan 블루 스테인(0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA 정화 키트 | Promega | A1125 |
참고문헌
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
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재인쇄 및 허가
