여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 레이저 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 기술로, 전례 없는 시간 분해능으로 부하가 걸린 기존 및 비기존 미오신 모두의 화학 역학을 조사할 수 있습니다. 특히, 액틴-미오신 결합 형성 직후 일정한 힘으로 미오신 모터를 프로브 할 수있는 가능성과 높은 힘 피드백 속도 (200kHz)는 UFFCS가 미오신 작동 스트로크와 같은 빠른 역학의 부하 의존성을 연구하는 데 유용한 도구임을 보여주었습니다. 또한 UFFCS는 프로세스 및 비 프로세스 미오신 - 액틴 상호 작용이 적용된 힘의 강도와 방향에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 연구를 가능하게합니다.
이 프로토콜을 따르면 공정 미오신 -5 모터와 다양한 비 전통적인 미오신에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행 할 수 있습니다. 일부 조정에 의해, 프로토콜은 또한 키네신 및 다인과 같은 다른 종류의 프로세스 모터에 대한 연구로 쉽게 확장 될 수 있습니다. 프로토콜에는 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 교정 절차, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계가 포함됩니다.
서론
지난 수십 년 동안 광학 핀셋은 구조적 변화와 효소 동역학 1,2의 동시 조작 및 측정의 놀라운 가능성으로 인해 단일 분자 수준에서 단백질 상호 작용의 기계 화학을 설명하는 데 유용한 도구였습니다. 특히, 나노미터 미만의 구조적 변화를 측정하는 능력과 함께 세포에서 분자 모터가 가하는 힘 범위의 힘을 적용하고 측정하는 기능은 광학 핀셋을 모터 단백질의 화학기계적 특성과 기계적 조절을 풀기 위한 고유한 단일 분자 도구로 만들었습니다.
초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 광학 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 포스 분광법 기술로, 3비드 형상(그림 1a)3,4에서 부하 상태에서 분자 모터의 빠른 동역학을 연구하기 위해 개발되었습니다. UFFCS는 광학 핀셋의 물리적 한계, 즉 시스템의 기계적 이완 시간까지 모터 단백질에 힘을 가하는 시간 지연을 줄여 미오신 실행 시작 후 (수십 마이크로 초) 힘을 빠르게 적용 할 수 있습니다 3. 이 기능은....
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프로토콜
1. 광학 설정
알림: 실험 설정은 나노미터 포인팅 안정성과 < 1% 레이저 강도 변동이 있는 이중 광학 핀셋으로 구성됩니다. 이러한 조건에서 나노 미터 수준에서 덤벨의 안정성은 일반적인 트랩 강성 (0.1 pN / nm) 및 인장 (1 pN-수십 pN)에서 보장됩니다. 그림 2 는 광학 설정의 세부 체계를 보여줍니다.
- 광학 핀셋 설계 및 시공 9,10,11.
- 설정의 모든 구성 요소를 그림 2의 구성표에 따라 광학 테이블에 놓습니다. 광학 테이블에는 기계적 진동을 최소화하기 위한 능동 아이솔레이터가 포함되어 있습니다. 또한 현미경 구조는 탄성 잡음과 기계적 공명을 흡수하기 위해 엘라스토머 아이솔레이터에 장착됩니다.
- 광학 아이솔레이터를 레이저 소스( 그림 2의 "OI")에 가깝게 삽입하여 광학 피드백으로 인한 임의 진폭 변동을 방지합니다.
- 레이저 포인팅....
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결과
대표 데이터는 그림 4와 같이 시간 경과에 따른 위치 레코드로 구성됩니다. 위치 기록에서 두 종류의 변위가 보입니다. 첫째, 미오신 모터가 액틴 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때 갇힌 비드는 용액의 점성 항력에 대해 일정한 속도로 움직이며 작업자가 삼각형 파3에서 설정 한 진동 범위 내에서 진동하는 선형 변위를 보여줍니다 (긴 시간 스케일로 인해 그림 4에서 보이지 않음). 둘째, 미오신 모터가 필라멘트와 상호 작용하면 움직이는 필라멘트가 전달하는 힘이 단백질로 매우 빠르게 전달되고 시스템 속도가 0으로 떨어지고 (그림 4의 빨간색 선) 스테핑 이벤트가 실행이 끝날 때까지 일정한 힘으로 발생합니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 피드백 시스템에 의.......
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토론
3-비드 분석과 같은 단일 분자 기술은 기술적으로 까다롭고 처리량이 낮지만 UFFCS는 데이터의 높은 신호 대 잡음비 덕분에 분자 상호 작용 감지를 향상시킵니다. UFFCS는 모터 단백질의 부하 의존성을 연구 할 수있게하며, 모터가 필라멘트에 결합 할 때 힘을 매우 빠르게 적용하여 제어 된 힘 하에서 힘 생성 및 약한 결합 상태에서 조기에 매우 빠른 이벤트를 조사하는 주요 이점이 있습니다. 실행 내내 힘을 일정하게 유지하고 힘 방향성을 완전히 제어하여 모터 종속성을 조사합니다. 마지막 지점과 관련하여 여기에서 사용하는 3-비드 형상은 필라멘트 방향을 따라 힘을 적용하고 측정하는 데 매우 효율적이며 가로 또는 수직 구성 요소의 기여를 최소화합니다. 그러나, 모터 단백질이 능동적으로 횡방향 또는 수직력, 또는 심지어 토크를 생성할 것으로 예상되는 경우, 단일 비드 기하학적 구조와 같은 다른 구성이 더 적절하다(2,7,18).
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공개 사항
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 보조금 계약 No. 871124 Laserlab-Europe에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램, 이탈리아 대학 및 연구부(FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) 및 Ente Cassa di Risparmio di Firenze의 지원을 받았습니다. A.V. Kashchuk은 Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008 / 2020-C의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 지방족 아민 라텍스 비즈 | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μ m 직경, 2% (w/v) |
| 아세톤 | Sigma | 32201 | |
| Actin 중합 완충액 | 세포골격 | BSA02 | 10X |
| AOD (음향 광학 디플렉터) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | 레이저 빔 디플렉터 |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin(CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| 소 간에서 추출한 카탈라아제 | Sigma | C40 | |
| 콘덴서 | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, 오일 이멀젼 |
| 크레아틴 인산이나트륨 염 사수화물 | Sigma | 27920 | |
| 크레아틴 포스포키나제 토끼 근육 | 시그마 | C3755 | |
| DDs | AA Opto 전자 | AA. 원디디스크 XX | 2채널 디지털 합성기 |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Aspergillus niger Sigma의 포도당 산화효소 | G7141 | ||
| HaloTag 숙시니미딜 에스테르 O2 리간드 | Promega | P1691 | |
| 고진공 실리콘 그리스 헤비 | 머크 밀리포어 | 107921 | |
| KCl | 시그마 | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | 시그마 | P5379/ P8281 | |
| Labview | 내쇼날인스트루먼트 | 버전 8.1 | 데이터 수집 |
| Labview FPGA 모듈 | , National Instruments | 버전 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks, | 2016 | 데이터 분석 |
| , MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| 현미경, 대물 | Nikon | Plan-Apo, 60X | NA 1.2, WD, 0.2mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| 니트로셀룰로오스 | Sigma | N8267 | 0.45 구멍 크기의 |
| 펜틸 아세테이트 용액 | Sigma | 46022 | |
| 순수 에탄올 | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D 위치 탐지 |
| Rhodamine BSA | 분자 프로브 | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| 실리카 비즈 | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% 고체 |
| 아지드화 나트륨 | 시그마 | S2002 | |
| 스트렙타비딘 단백질 | 시그마 | 189730 |
참고문헌
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 8/25/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy
