방법 논문

ApoE에서 뒷다리 허혈의 변형 된 수술 모델-/- 소형 절개를 사용하여 마우스

DOI:

10.3791/62402

⸱

2021년 5월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서는 작은 절개를 가진 마우스에 있는 심각한 허혈을 확립하기 위하여 능률적인 외과 접근을 보여줍니다. 이 방법은 실험실 업그레이드없이 대부분의 연구 그룹에 의해 적용 될 수있다.

초록

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이 연구의 목적은 대부분의 동물 실험실에서 구현 될 수있는 마우스에서 급성 허혈을 유도하기 위해 수정 된 수술 방법을 도입하고 평가하는 것입니다. 대퇴동맥(DLFA)의 이중 결찰에 대한 기존의 접근법과는 달리, DLFA를 수행하기 위해 근위 대퇴동맥(FA)을 노출시키기 위해 올바른 인게날 부위에 대한 작은 절개가 이루어졌다. 이어서, 7-0 봉합사를 사용하여, 절개는 말단 FA를 노출하기 위해 무릎 영역으로 끌려갔다. 수술 후 0, 1, 3, 5 및 7일 동안, 뒷사지의 기능적 회복은 탈로프 스케일을 사용하여 시각적으로 평가되고 등급화되었다. 히스토로지평가는 DLFA 이후 7일 후에 동물을 안락사한 후 수행되었다. 절차는 성공적으로 10 ApoE-/- 마우스에 있는 오른쪽 다리에, 그리고 어떤 마우스는 후속 관찰 도중 정지했습니다. 10마리의 마우스 의 절개 크기는 5mm(4.2± 0.63mm) 미만이었다. MRI 결과는 허혈성 측의 FA 혈류가 명확하게 차단되었다는 것을 보여주었습니다. Tarlov 스케일 결과는 수술 후 뒷다리 기능이 현저히 감소하고 다음 7일 동안 서서히 회복되었다는 것을 보여주었습니다. 조직학적 평가는 허혈성 측에 상당한 염증 반응을 보였고 허혈성 뒷두발의 미세 혈관 밀도를 감소시키는 것으로 나타났다. 결론적으로, 이 연구는 DLFA를 사용하여 뒷다리 허혈 (HLI)을 수행하기 위해 소형 절개를 사용하여 수정 된 기술을 소개합니다.

서론

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말초 동맥 질환 (PAD)과 같은 혈관 질환연구를 위한 전임상 동물 모델에 대한 충족되지 않은 필요성이 있습니다. 진단 및 치료의 고급 발달에도 불구하고 2018 년1에서 PAD를 가진 2 억 명 이상의 환자가 있었고 그 수는 지속적으로 증가하고 있습니다. 비록 몇몇 새로운 치료 접근법2,3,4,5,6,7이 기술되었지만, 이러한 치료 양식의 성공적인 번역을 임상 응용 프로그램으로 성공적으로 번역하는 것은 어려운 작업으로 남아 있다. 따라서, 인간 질환 상태를 시뮬레이션하는 생체 내 실험 모델에서 안정적이고 관련성이 높은 이러한 새로운 치료 접근법의 잠재적 기전및 효율을 조사하여 PAD6,7을치료해야 한다.

고지혈증과 죽상 경화증 (AS)은 PAD의 발달을위한 주요 위험 요소입니다. ApoE-/-- 마우스(고지방 식단)는 비정상적인 지방 대사와 고지혈증을 표시하고, 이후ApoE-/-마우스를 임상적으로 관련 있는 PAD를 시뮬레이션하는 최선의 선택으로 동맥 경화성 플라크를 개발한다. 전임상 HLI 동물 모델은 전 세계8, 9,10, 11,12,13,14,15에 걸쳐 실험실에서 가장 널리 사용되는 접근법인 대퇴동맥(DLFA)의 이중 결찰을 통해 생성된다. 그러나, 이 접근은 일반적으로 상대적으로 크고 침략적인 절개를 요구합니다. 더욱이, 그것은 필연적으로 증가 된 통증 손상 및 염증으로 고통받는 동물 (특히 마우스)으로 이어지며, 이는 또한 후속 실험 결과에 영향을 미치는5,6,16,17. 이 논문은 매우 작은 절개를 사용하여APOE-/-마우스의 급성 만성 HLI 모델을 설명합니다.

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프로토콜

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참고: 모든 실험 절차는 EC 지침 EC 2010/63/EU에 따라 수행되었으며 현지 독일 법률(35-9185.81/G[1]239/18)의 승인을 받았습니다. C57BL/6J 배경이 29.6-38.0g인 10마리의 수컷 아포에 마우스는 12시간 광/암흑주기에 보관되어 서양 식단(콜레스테롤 1.25%, 지방 21%)과 8주 부터 12주 동안 물 광고 리비툼을 공급하였다. HLI는 아래에 설명된 바와 같이 20주 된 마우스에 수행되었다.

1. ApoE에서 HLI 유도-/- 마우스

  1. 수술에 필요한 장비와 도구를 준비합니다(재료 표 및 그림 1참조). 사용하기 전에 오토클레이브를 통해 수술 기구를 살균하고 수술 중에 유리 비드 멸균제를 사용하십시오.
  2. 미다졸람(5mg/kg), 메데토미딘(0.05 mg/ml/kg), 펜타닐(0.5 mg/kg)의 혼합물을 모든 수술 전에 피하 주사(S.C.)로 마우스를 마취시킵니다.
    1. 마취가 발병한 후, 눈에 수의사 연고를 사용하여 건조함을 방지하고 앞다리와 뒷다리에 페달 철수 반사가 없는지 확인합니다.
  3. 그 후 마우스를 가열 패드에 배치하여 코어 체온을 약 37°C로 유지합니다. 면 봉면과 제모 크림을 사용하여 오른쪽의 뒷다리 피부에서 모발을 조심스럽게 제거합니다.
    참고: 제모 크림은 뒷다리, 특히 절개가 만들어질 인귀부위를 덮기 위해 충분한 양으로 사용되어야 합니다. 제모 크림은 3 분 미만의 기간 동안 사용되어야하며, 나중에 촉촉한 면 봉면 2 ~ 3 번 제거해야합니다.
  4. 해부 현미경아래 가열 패드의 척추 위치에 마우스를 놓습니다. 마우스의 피부를 소독하기 위해 피부 방부제 (재료의 표참조)를 사용합니다. 그 후, 뾰족한 집게와 외과 가위를 사용하여 잉구이 영역의 중간에 약 3-4mm 절개를 합니다. 절차의 회로도는 그림 2를 참조하십시오.
  5. 피하 지방 조직을 미세한 뾰족한 집게의 도움으로 조심스럽게 제거하여 근위 대퇴 신경 혈관 번들을 노출시하십시오. 조심스럽게 대퇴 칼집의 막을 관통하기 위해 미세 한 뾰족한 집게를 사용합니다. 대퇴신경(FN)과 대퇴정맥(FV)에서 조심스럽게 대퇴동맥(FA)을 옮기려면 식염수로 촉촉한 면봉을 사용한다.
  6. 근교 FA를 통해 7-0으로 흡수 가능한 봉합사 2개를 통과하고 스프링 가위를 사용하여 더블 매듭을 만들어 두 동점 사이를 오가며 FA를 통과합니다.
  7. 실사 FA를 노출하려면 절개 하부 가장자리를 통해 7-0 흡수 가능한 봉합사를 통과하고 절개를 뒷다리의 무릎 오른쪽 영역으로 부드럽게 드래그합니다.
  8. 피하 조직을 조심스럽게 옆으로 움직여 신경 혈관 번들을 노출시하십시오. 미세 한 뾰족한 집안집을 사용하여 대퇴 칼집의 막을 관통하고 FV 및 FN에서 FA를 해부하십시오.
  9. 실사 FA를 통해 흡수 가능한 봉합사 2개를 통과하고 더블 매듭을 만듭니다. 스프링 가위를 사용하여 두 관계 사이에 FA를 변환합니다.
    참고: 왼쪽 사지에서 리시레이션이 수행되지 않았으며, 이는 각 마우스의 컨트롤역할을 합니다.
  10. 그 후 6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 절개를 바느질하십시오. 깨끗한 케이지에 가열 패드에 마우스를 놓고 복구 될 때까지 중요한 매개 변수를 계속 모니터링합니다. 수술 후 진통제 제공: Buprenorphine s.c. (0.1 mg/kg 체중 마다 8 시간 마다 48 h). 48 h 작업 후, 식수에서 메타미졸을 관리 (24 mg/5mL의 물은 200 mg/kg 4 배 매일).

2. 자기 공명 이미징

참고: DLFA 가 끝난 지 하루 만에 마우스는 FA 막힘을 평가하기 위해 MRI 검사를 받아야 합니다.

  1. 마우스를 투명 유도 챔버에 놓고 마우스를 1.5-2%의 이소플루란으로 마취하여 오른쪽 반사를 상실할 때까지 주변 공기에 시동을 놓습니다.
  2. 마우스를 물린 홀더가 장착된 가열된 동물 침대에 놓고 레이저 제어 시스템으로 자석쪽으로 배치합니다. 체온을 37±1°C에서 유지합니다.
  3. 이미지 수집 중에 주변 공기에서 1.5-2 %의 이소플루란으로 마취를 유지하고 압력 프로브를 사용하여 호흡을 모니터링합니다.
  4. 3차원(3D) 비행 시간(TOF) 혈관조영서열을 사용하여 횡단 슬라이스 방향으로 이미지를 획득하여 파라미터 에코 시간(TE)/반복 시간(TR)/플립 각도(FA) = 2ms/12 ms/13°, 4개의 평균, 178 x 144의 획득 매트릭스를 256 x 192및 12111로 재구성하여 1211mm의 해상도로 재구성하였다. 정맥에서 신호를 억제하려면 채도 슬라이스를 뒷다리에 disation로 배치합니다.

3. 임상 평가 및 후속 조치

  1. 기능적 점수매기를 이용하여 수술 후1,3rd,5일및7일 동안 기능적 회복을 추정한다18,19(표 1).

4. 히토로지 평가

  1. 수술 후 7일 후, 펜토바르비탈 주사(115 mg/kg)를 적용하여 마우스를 안락사시킵니다.
  2. 좌측 심장 심실(마우스당 100mL)을 통해 1% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 인산염 완충식염(PBS). 4°C에서 하룻밤 사이에 4% PFA에서 마우스의 양측 위트로테미에(Gm)를 수정한다.
  3. 이전에 설명된프로토콜(20)에따라 파라핀에 샘플을 포함하였다.
    1. 마이크로톤에 파라핀 임베디드 조직 블록의 4-5 μm 두께의 부분을 잘라냅니다. 둥근 페인트 브러시의 도움으로 42 °C에서 유지 되는 수조에 절단 조직 섹션을 배치합니다.
    2. 현미경 슬라이드를 45° 각도로 물에 삽입하고 수집할 섹션 그룹 아래에 조심스럽게 배치합니다.
    3. 조심스럽게 물에서 슬라이드를 들어 올리고, 섹션이 슬라이드에 부착하고 37 ° C에서 벤치 탑 인큐베이터에서 밤새 건조 할 수 있습니다.
  4. 파라핀 섹션의 헤마톡시린/에오신(HE) 염색을 수행한다.
    1. 섹션이 포함된 슬라이드를 슬라이드 홀더에 배치합니다. 신선한 자일렌 3개의 용기를 준비하고 슬라이드를 각 용기에 5분 동안 배치하여 섹션을 분리합니다.
    2. 슬라이스를 96%, 80%, 70%, 50%, 30% 에탄올, 탈온수 5분으로 연속적으로 찍어 섹션을 수분화합니다.
    3. 10 분 동안 헤마톡슬린 용액에 얼룩.
    4. 슬라이스를 탈이온된 물 용기에 옮기고 흐르는 수돗물 아래에 5분 동안 놓아 헹구는 것입니다.
    5. 현미경을 사용하여 헤마톡슬린 염색의 강도를 확인하십시오. 염색이 세포 핵을 명확하게 식별할 수 있으면 다음 단계로 계속하십시오. 염색 강도가 세포 핵의 식별을 용이하게하지 않거나 염색강도가 희미해지면 헤마톡시린 용액에 슬라이드를 1 분 동안 넣고 물로 세척을 반복한 다음 다시 확인하십시오.
    6. 5 분 동안 eosin-Y 솔루션에 카운터 스테인.
    7. 슬라이스를 탈수하여 분해된 물과 30%, 50%, 70%, 80%, 96%의 에탄올을 각각 10s씩 연속적으로 담그면 단면을 탈수합니다. 다음으로, 각각 10 초에 신선한 자일렌의 세 용기에 섹션을 순차적으로 놓습니다.
    8. 슬라이드를 미세한 슬라이드 저장 맵에 수평으로 배치하고 섹션은 위쪽으로 향합니다. 슬라이드에 충분한 장착 매체를 추가하고 슬라이드에 커버립을 장착합니다.
  5. 파라핀 섹션의 면역히스토케미칼(IHC) 염색을 수행한다.
    1. 반복 비카페인화 및 재수화 단계 4.4.1-4.4.2. 이어서, 10mM 나트륨 구연산 버퍼, pH 6로 용기에 섹션을 담그고, 마이크로웨이브에서 시료를 끓이도록 한다.
      참고: 시료의 과다 또는 과소 가열로 인해 일관되지 않은 염색이 발생할 수 있으므로 10분 동안 끓는 점 바로 아래에서 온도를 유지합니다.
    2. 다음으로 벤치탑의 섹션을 30분 동안 식힙니다. 그 후, PBS에서 섹션을 5 분 동안 세 번 씻으시면 하십시오. 조심스럽게 샘플 주변의 영역을 건조하고 소수성 펜을 사용하여 샘플 주위에 큰 원을 그립니다. .
      참고: 샘플을 만지지 마십시오. 소수성 펜으로 표시하는 것은 소수성 경계를 생성하여 더 적은 양의 항체 용액의 사용을 용이하게 합니다.
    3. 10분 동안 PBS에서 0.3% H2O2로 섹션을 배치하여 내인성 과옥시다제 활성을 담금질한다. 400μL의 블록 버퍼(PBS포함 3% 소 세럼 알부민 및 비이온 세제의 0.3%)를 가습 챔버의 실온에서 1시간 동안.
    4. PBS에서 5 분 동안 섹션을 씻으면 하십시오. 다음으로, 단면을 커버할 수 있을 만큼 희석된 안티CD31 항체(1:250)의 100-400 μL을 추가한다. 이에 따라, 가습 챔버에서 4 °C에서 하룻밤 동안 섹션을 배양한다.
      참고: 단면도가 항체 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인합니다.
    5. 1 차적인 항체를 제거하고, PBS에서 각각 5 분 동안 섹션을 세 번 씻는다.
    6. DAB 농축액 1mL에 DAB 농축액 1방울을 첨가하여 3, 3'-디아미노벤지딘(DAB) 혼합물을 준비하고 잘 섞는다. 그 후, 단면에 DAB 혼합물의 100-400 μL을 추가하고, 허용 가능한 염색 강도가 관찰될 때까지 2분 동안 눈으로 면밀히 모니터링한다.
      참고: 단면도가 DAB 혼합물로 완전히 덮여 있는지 확인합니다.
    7. 그 후, 흐르는 수돗물 아래에서 5 분 동안 헹구십시오. 단계 4.4.3-4.4.5에 설명된 바와 같이 헤마톡슬린 염색을 수행한다.
    8. 4.4.6 단계에서 설명된 eosin-Y 염색을 수행한다. 4.4.7 단계에서 설명된 탈수 단계를 수행한다.
    9. 마운팅 매체를 사용하여 커버립으로 섹션을 장착했습니다. ImageJ를 사용하여 이전에 설명된 21과 같이 미세 혈관 밀도로 간주될 수 있는 5개의 무작위로 선택된 필드(40x)에서CD31양성 영역(%)의 백분율을 추정한다.

5. 통계 분석

  1. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 결과를 표준 편차로 ± 표현하고 비교에 대해 페어링되지 않은 t-test를 수행합니다. P < 0.05가 통계적으로 유의하다고 생각해 보십시오.

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결과

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아포에의 특성-/-- 마우스
DLFA 수술은 HLI 모델을 확립하기 위해 10마리의 마우스에서 성공적으로 수행되었으며, 수술 후 마우스 중 누구도 사망하지 않았습니다. 체중의 변화를 따르기 위해, 마우스는 DLFA 절차 (PRE DLFA) 및 DLFA 수술 후 7 일 전에 무게를 측정했다 (포스트 DLFA). 사전 DLFA 가중치는 29.6에서 38.0g(평균 34.74 ± 2.47g)이며, DLFA 이후 의 무게는 26.5에서 34.1g(평균 30.77 ± 2.15g)으로, 이는 전 DLFA가중치(P < 0.05, 피겨 3)보다현저히 낮았다. 수술 시간은 15분에서 47분까지 다양했다(평균 34.2± 8.82분, 마취 시간을 포함하지 않음). 10마우스의 절개 크기는 3mm에서 5mm(평균 4.2 ± 0.63 mm)에 구역수색되었습니다....

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토론

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이 연구는 필요한 실험실 업그레이드없이 3-4mm 절개를 통해 FA의 근위 및 탈산 영역에서 이중 결찰을 사용하여ApoE-/-마우스에 HLI 모델을 확립하기 위한 수정, 단순화 및 외과 효율적인 접근법을 보고합니다. 이 방법의 주요 특징은 마우스 HLI 모델8,9,10,11,12,15,20,22, 23,24를 설명하는 이전에 보고된 연구 결과에 비해 절개크기가

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 기사 콘텐츠가 잠재적 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 경우 구성되었다고 선언합니다.

감사의 글

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저자는 뛰어난 기술 지원에 대한 빅토리아 스쿠드, 알렉산더 슐룬드, 펠릭스 회너에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x 인산염 완충액 식염Roth9143.1헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역조직화학 염색에 사용
30% H2O2Roth9681.2면역조직화학 염색
6-0 흡수성 봉합PROLENE8776H피부 봉합에 사용
6-0 흡수성 봉합PROLENEEP8706수술에 사용
7-0 흡수성 봉합PROLENEEH8021E동맥
7-0 absroable 봉합PROLENEEP8755수술에 사용
아세트산Roth6755.1헤마톡실린 및 에오신 염색에 사용
Albumin Fraktion VRoth8076.2면역조직화학 염색에 사용
오토클레이브Systec GmbHSystec VX-150수술 기구
Axio vert A1 현미경Carl ZeissZEISS Axio Vert.A1혈구 및 에오신 염색 및 면역조직화학 염색
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/A대퇴 동맥 막힘
스캔 Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)수술 후 통증 관리에 사용됩니다. 투여량 - 수술 후 48시간 동안 8시간마다 체중 0.1mg/kg
CD31 항체Abcamab28364면역조직화학 염색에 사용
물에서 Eosin Y 용액 0.5RothX883.1헤마톡실린 및 에오신 염색에 사용
에피토프 회수 용액 pH 6Leica Biosystems6046945면역조직화학 염색에 사용
에탄올 ≥ 99,5 %Roth5054.1헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역조직화학 염색에 사용
펜타닐케이맨 화학437-38-7마취에 사용
미세한 포인트 집게 집게Medixplus93-4505S신경 및 정맥에서 동맥을 분리하는 데 사용
유리 구슬 살균기Simon KellerType 250수술 기구의 살균에 사용
Graefe iris 집게 곡선VUBU VUBUVUBU-02-72207피부와 피하 조직의 무딘 분리에 사용
헤어 리무버 크림, Veet (알로에 베라 포함)Reckitt Benckiser108972마우스 뒷다리에서 헤어 제거
가열판ST Ö RK-TRONIC7042092마우스의 새틀 온도를 유지하십시오
HematoxylinRothT865.2헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역 조직 화학 염색에 사용
Leica 수술 현미경 LeicaM651작업을 용이하게하기 위해 시야를 확대
Liquid DAB + Substrate Chromogen SystemDakoK3468면역 조직 화학 염색
에 사용남성 ApoE-/- 생쥐Charles River LaboratoriesN/A말초 동맥 질환 생쥐 모델
MedetomidineCayman Chemical128366-50-7설립
마이크로 바늘 홀더Black & Black SurgicalB3B-18-8바늘을 잡고
마이크로 봉합사 묶는 집게Life Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145수술 중 매듭을 돕기 위해 사용
MicrotomeBiobaseBk-Mt268m조직 절편에 사용
MidazolamRatiopharm44856.01.00마취에 사용
MR 호환 소동물 모니터링 및 게이팅 시스템 모델 1025SA 기기MRI 스캔 중 동물의 활력 징후 모니터링N/a
Octeniderm farblosSchü LKE & Mayr GmbH180212피부 소독에 사용
눈과 코 연고Bayer AG1578675마취
파라 포름 알데히드Roth0335.1조직의 고정에 사용
PentobarbitalNembutal76-74-4마취에 사용
식염수DeltaSelect1299.99.99사용 마취
스프링 핸들 가위 미세하고 날카로운 팁블랙 & Black SurgicalB66167동맥 절단에 사용
SuperCut 가위Black & 검은 외과B55992피부 절단에 사용
Triton X-100Roth9002-93-1면역 조직 화학 염색
서양 다이어트에 사용, 1.25 % 콜레스테롤ssniff Spezialdi & auml; ten GmbHE15723-34생쥐용 다이어트
XyleneRoth4436.3헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역조직화학 염색에 사용
수 사 사 사 사 결찰에 사용 % 하십시오 에 사용 마취

참고문헌

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