이 프로토콜은 화학적으로 변형된 mRNA의 체외 전사(IVT), 양이온 리포좀 제제 및 포유류 세포에서 리포좀 사용 mRNA transfection의 기능 분석을 제공합니다.
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방법 논문
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이 프로토콜은 화학적으로 변형된 mRNA의 체외 전사(IVT), 양이온 리포좀 제제 및 포유류 세포에서 리포좀 사용 mRNA transfection의 기능 분석을 제공합니다.
최근 몇 년 동안 화학적으로 변형된 메신저 RNA(mRNA)는 새로운 종류의 백신, 단백질 대체 요법 및 면역 요법을 포함한 광범위한 치료 응용 분야를 개발하기 위한 강력한 핵산 분자로 부상했습니다. 전달 벡터 중 지질 나노입자는 RNA 분자(예: siRNA, miRNA, mRNA)를 전달하는 데 더 안전하고 효과적인 것으로 밝혀졌으며 일부 제품은 이미 임상에서 사용되고 있습니다. 지질 나노입자 매개 mRNA 전달을 입증하기 위해 기능적 me1Ψ-UTP 변형 eGFP mRNA의 합성, 양이온 리포좀의 준비, 양이온 리포좀을 사용한 mRNA의 정전기 복합체 형성 및 포유류 세포의 transfection 효율 평가를 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 그 결과, 이러한 변형이 양이온성 리포좀과 함께 전달될 때 mRNA의 안정성을 효율적으로 개선하고 포유류 세포에서 eGFP mRNA 번역 효율성과 안정성을 증가시켰음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 원하는 mRNA를 합성하고 포유류 세포에서 표적 유전자 발현을 위해 양이온성 리포좀으로 transfection하는 데 사용할 수 있습니다.
치료 분자로서 mRNA는 플라스미드 DNA(pDNA)와 비교할 때 비통합적 특성과 비유사분열 세포를 transfection할 수 있는 능력으로 인해 여러 가지 이점을 제공합니다1. 1990년대 초에 mRNA 전달이 입증되었지만, 안정성이 부족하고 면역 활성화가 부족하며 번역 효율이 낮기 때문에 치료 적용이 제한적이었습니다2. mRNA에서 슈도우리딘 5'-트리포스페이트(Ψ-UTP) 및 메틸 슈도우리딘 5'-트리포스페이트(me1Ψ-UTP)와 같은 최근에 확인된 화학적 변형은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 되었고, mRNA 연구에 혁명을 일으켰으며, 결과적으로 mRNA를 기초 및 응용 연구 모두에서 유망한 도구로 만들었습니다. 응용 범위는 iPSC의 생성부터 백신 접종 및 유전자 치료에 이르기까지다양합니다 3,4.
mRNA 기술의 발전과 병행하여 비바이러스 전달 시스템의 상당한 발전으로 mRNA의 전달이 효과적이게 되었으며, 이 기술은 여러 치료 응용 분야에서 실현 가능하게 되었습니다
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1. me1 Ψ-UTP 변형 mRNA 생산
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me1Ψ-UTP 변형 mRNA 생산, 리포좀 제제 및 양이온성 리포좀을 사용하여 여러 포유류 세포에 대한 mRNA 형질 주입 실험을 위해 프로토콜을 최적화했습니다(그림 1). mRNA를 합성하기 위해 mEGFP-N1 포유류 발현 벡터에서 포유류 코돈에 최적화된 eGFP IVT 템플릿을 증폭하고 유기 추출/에탄올 침전 방법으로 정제했습니다(그림 2). 나중에, me1Ψ-UTP 변형 RNA와 mRNA가 IVT 과정에 의해 생성되었습니다. 변성 RNA 아가로스 겔 전기영동 데이터는 이러한 합성된 RNA가 우수한 무결성과 올바른 길이(RNA ladder에 대해 750 염기 RNA 및 ~1000 염기 mRNA)를 가진다는 것을 보여주었습니다(그림 3).
양이온 성 리포좀을 제조하기 위해 박막 수화 방법 및 초음파 처리를 사용하여 .......
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변형되지 않은 mRNA의 치료 적용은 반감기가 짧고 세포 내 선천성 면역 반응을 활성화하는 능력으로 인해 제한되어 왔으며, 이는 차례로 형질주입된 세포에서 단백질 발현을 저하시킵니다11. Katalin 등은 m5C, m6A, ΨU 및 me1Ψ-UTP와 같은 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNA가 TLR 활성화를 피할 수 있음을 입증했습니다12. 더 중요한 것은 IVT mRNA에 ΨU 또는 me1Ψ-UTP를 통합하면 표적 단백질의 우수한 번역 효율이 나타나고 실온에서 안정성이 향상되며 뉴클레아제의 분해가 방지된다는 것입니다13, 14.
이 비디오에서는 여러 배양 세포로의 지질 지원 me1Ψ-UTP 변형 mRNA 전달 프로토콜을 시연했.......
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MS는 재정 지원(BT/PR25841/GET/119/162/2017)에 대해 인도 생명공학부에 감사를 표하고, Vellore의 CSCR 책임자인 Alok Srivastava 박사와 이미징 및 FACS 실험을 위한 CSCR 핵심 시설인 Sandhya 박사에게 감사를 표합니다. 리포좀의 물리화학적 데이터를 분석하는 데 도움을 주신 CSIR-Indian Institute of Chemical Technology Uppal Road, Tarnaka, Hyderabad, 500 007, TS, India의 응용 생물학 부서의 R. Harikrishna Reddy와 Rajkumar Banerjee에게 감사드립니다. Vigneshwaran V, Joshua A, CSCR은 비디오 제작에 도움을 주었습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| 목욕 초음파 발생기 | DNMANM 산업 | USC-100 | |
| 에서 합성 | 양이온 성 지질 | ||
| : Chlorofrom | MP biomedicals | 67-66-3 | "주의" |
| , 콜레스테롤 | Himedia | GRM335 | |
| DEPC, 물 | , SRL, BioLit | 66886 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| DNA 사다리 | GeneDireX | DM010-R50C | |
| 도프 | TCI | D4251 | |
| EDTA 나트륨 염 | MP 생물 의학 | 194822 | |
| 에탄올 | 헤이만 | F204325 | "주의" |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 10270 | |
| 유세포 분석 | BD | FACS Celesta | |
| Fluroscence 현미경 | Leica | MI6000B | |
| Gel 문서화 시스템 | Cell Biosciences | Flurochem E | |
| 빙하 아세트산 | Fisher Scientific | 85801 | "주의" |
| mEGFP-N1, 포유류 발현 벡터 | Addgene | 54767 | |
| N1-Methylpseudo-UTP | Jena Bioscience | NU-890 | |
| 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알콜 (25 : 24 : 1), pH 8.0 | SRL BioLit | 136112-00-0 | "주의" |
| 인산염 완충액 식염수 (PBS), pH 7.4 | CellClone | CC3041 | |
| 프로브 초음파 발생기 | Sonics Vibra Cells | VCX130 | |
| RNA ladder | NEB | N0362S | |
| RNase 억제제 | Thermo Scientific | N8080119 | |
| SafeView 염료 | abm | G108 | |
| 아세트산나트륨 | Sigma | S7545 | |
| Thermocycler | Applied biosystems | 4375786 | |
| Thermomixer | Eppendrof | 22331 | |
| Tris buffer | SRL BioLit | 71033 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 |
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