화학적으로 변형된 mRNA를 포유류 세포로 전달하기 위해 지질 나노입자 사용

요약

이 프로토콜은 화학적으로 변형된 mRNA의 체외 전사(IVT), 양이온 리포좀 제제 및 포유류 세포에서 리포좀 사용 mRNA transfection의 기능 분석을 제공합니다.

초록

최근 몇 년 동안 화학적으로 변형된 메신저 RNA(mRNA)는 새로운 종류의 백신, 단백질 대체 요법 및 면역 요법을 포함한 광범위한 치료 응용 분야를 개발하기 위한 강력한 핵산 분자로 부상했습니다. 전달 벡터 중 지질 나노입자는 RNA 분자(예: siRNA, miRNA, mRNA)를 전달하는 데 더 안전하고 효과적인 것으로 밝혀졌으며 일부 제품은 이미 임상에서 사용되고 있습니다. 지질 나노입자 매개 mRNA 전달을 입증하기 위해 기능적 me1Ψ-UTP 변형 eGFP mRNA의 합성, 양이온 리포좀의 준비, 양이온 리포좀을 사용한 mRNA의 정전기 복합체 형성 및 포유류 세포의 transfection 효율 평가를 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 그 결과, 이러한 변형이 양이온성 리포좀과 함께 전달될 때 mRNA의 안정성을 효율적으로 개선하고 포유류 세포에서 eGFP mRNA 번역 효율성과 안정성을 증가시켰음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 원하는 mRNA를 합성하고 포유류 세포에서 표적 유전자 발현을 위해 양이온성 리포좀으로 transfection하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

치료 분자로서 mRNA는 플라스미드 DNA(pDNA)와 비교할 때 비통합적 특성과 비유사분열 세포를 transfection할 수 있는 능력으로 인해 여러 가지 이점을 제공합니다¹. 1990년대 초에 mRNA 전달이 입증되었지만, 안정성이 부족하고 면역 활성화가 부족하며 번역 효율이 낮기 때문에 치료 적용이 제한적이었습니다². mRNA에서 슈도우리딘 5'-트리포스페이트(Ψ-UTP) 및 메틸 슈도우리딘 5'-트리포스페이트(me1Ψ-UTP)와 같은 최근에 확인된 화학적 변형은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 되었고, mRNA 연구에 혁명을 일으켰으며, 결과적으로 mRNA를 기초 및 응용 연구 모두에서 유망한 도구로 만들었습니다. 응용 범위는 iPSC의 생성부터 백신 접종 및 유전자 치료에 이르기까지^{다양합니다 3,4}.

mRNA 기술의 발전과 병행하여 비바이러스 전달 시스템의 상당한 발전으로 mRNA의 전달이 효과적이게 되었으며, 이 기술은 여러 치료 응용 분야에서 실현 가능하게 되었습니다⁵. 비 바이러스 벡터 중 지질 나노 입자는 핵산을 전달하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌습니다 ^6,7. 최근 Alnylam은 유전성 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증(hATTR 아밀로이드증)에 대한 파티시란(Patisiran)과 급성 간 포르피린증(AHP)에 대한 지보시란(Givosiran)을 포함하여 간 질환 치료를 위한 지질 기반 siRNA 약물에 대한 FDA 승인을 받았습니다⁸. COVID19 팬데믹 기간 동안 화이자-바이오엔테크(Pfizer-BioNtech)와 모더나(Moderna)의 지질 캡슐화 mRNA 기반 백신은 효능을 입증하고 FDA 승인을 받았습니다 ^9,10. 따라서 지질 지원 mRNA 전달은 큰 치료 잠재력을 가지고 있습니다.

여기에서는 화학적으로 변형된 체외 전사 eGFP mRNA, 양이온 리포좀 제제, mRNA-지질 복합체 최적화 및 포유류 세포로의 형질주입 생산을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1).

프로토콜

1. me1 Ψ-UTP 변형 mRNA 생산

1. 체외 전사(IVT) DNA 템플릿 준비
   참고: IVT DNA 템플릿(T7 promoter- 유전자의 ORF(open reading frame)) 준비를 위해 관심 유전자에 대한 유전자 특이적 프라이머 세트를 설계합니다. 유전자 특이적 전방 프라이머 전에 T7 promoter (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNN-3') 염기서열을 추가합니다.
   1. PCR 반응 혼합물을 표 1에 기재된 바와 같이 제조한다.
      참고: IVT에 대한 IVT DNA 템플릿 농도와 품질을 높이려면 최소 4회의 PCR 반응을 실행합니다.
   2. 반응 혼합물을 마이크로피펫과 완전히 혼합하고 마이크로퓨지를 사용하여 스핀다운합니다.
   3. 표 2 에 제시된 PCR 사이클링 프로토콜을 써모사이클러에서 실행합니다.
2. 유기추출/에탄올 침전에 의한 IVT DNA template의 정제
   1. 1.5mL 마이크로분리관(nuclease-free)에서 DEPC 처리된 물을 사용하여 증폭된 PCR 반응 혼합물을 총 200μL로 조정합니다.
   2. 200μL의 TE-포화 페놀/클로로포름, pH 8.0을 추가합니다. 10초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.
   3. 12,000 x g에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 상을 분리하고 수성 상부상(약 200μL)을 새로운 1.5mL 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.
   4. 3M 아세트산나트륨의 1/10⁽ 20μL) 부피, pH 5.5 및 99-100% 에탄올의 2부피(400μL)를 추가합니다. 잘 섞은 다음 -20 ° C에서 최소 30 분 동안 배양하십시오.
   5. DNA 템플릿을 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다.
   6. 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 완전히 제거합니다.
   7. 펠렛에 0.5mL의 75% 에탄올을 넣고 5-10회 반전시킵니다.
   8. 4°C에서 12,000 x g에서 2분간 원심분리기. 그런 다음 DNApellet을 방해하지 않고 피펫으로 에탄올을 완전히 제거합니다.
   9. 펠릿이 약간 반투명해질 때까지 펠릿을 실온에서 건조시킵니다.
   10. 뉴클레아제가 없는 물 20μL를 넣고 몇 초 동안 완전히 재현탁합니다.
3. 정제된 IVT DNA 템플릿에 대한 품질 관리
   1. 부량
      1. 마이크로 분광 광도계를 사용하여 정제된 IVT DNA 템플릿 농도와 품질을 측정합니다.
         참고: 예상 DNA 농도는 약 300-600ng/μL입니다. IVT DNA 템플릿을 -20°C에서 장기간 보관하십시오.
   2. DNA 아가로스 겔 전기영동
      참고: 이 실험은 정제된 IVT DNA 템플릿이 올바른 크기이고 비특이적 제품 오염이 없는지 확인하기 위한 것입니다.
      1. 1% 아가로스 젤을 준비하려면 원뿔형 플라스크에 아가로스 0.5g과 1x TAE 50mL를 추가합니다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 아가로스를 실온에서 5분간 식힙니다.
      2. 50mL 아가로스 용액에 1μL의 핵산 염색제(SafeView 염료)를 추가합니다.
      3. 아가로스 용액을 빗으로 젤 주조 트레이에 붓고 젤이 응고될 때까지 그대로 둡니다.
      4. 젤에서 빗을 꺼내고 젤을 1x TAE 완충 탱크에 보관합니다.
      5. 10 μL의 100-10000 bp DNA ladder와 100-200 ng의 PCR 정제 템플릿 제품을 2 μL의 6x DNA 로딩 버퍼와 총 부피 12 μL에 혼합합니다.
      6. 각 샘플을 각각의 웰에 로드하고 최소 45-60분 동안 100V에서 실행합니다.
      7. 겔 문서화 기기에서 DNA 밴드를 시각화합니다(그림 2).
4. me1Ψ-UTP 변형 RNA의 합성
   알림: 이 실험을 시작하기 전에 작업 영역(층류 기류)을 DEPC 처리된 물에 70% 에탄올로 청소해야 합니다. 멸균 뉴클레아제 및 내독소가 없는 저잔류 튜브와 필터 배리어 팁을 사용합니다. 장갑을 낀 손에 70% 에탄올을 자주 바르십시오.
   1. 표 3에 나타난 바와 같이 IVT 반응 혼합물을 실온에서 0.2 mL 튜브에 넣고 마이크로피펫을 이용하여 철저히 혼합한다.
   2. 마이크로퓨지에서 튜브를 10초 동안 돌립니다.
   3. 37°C에서 열순환기에서 3시간 동안 배양합니다.
5. DNase 1 처리에 의한 IVT DNA 주형의 분해
   1. 1 μL의 1 U/μL DNase 1(RNase free)을 IVT 반응 혼합물에 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
6. 유기 추출에 의한 RNA 정제/아세트산 암모늄 침전
   1. IVT 반응 혼합물의 부피를 179μL의 DEPC 처리수와 함께 200μL로 조정합니다.
   2. 200μL의 TE-포화 페놀/클로로포름 pH 8.0을 추가합니다. 10초 동안 소용돌이칩니다.
   3. 12,000 x g에서 25°C에서 5분간 원심분리기를 사용하여 두 상을 분리합니다.
   4. 수성 상부상(200μL)을 1.5mL 튜브로 옮기고 200μL의 5M 아세트산암모늄을 추가합니다. 잘 섞은 다음 얼음에서 15분 동안 배양하여 RNA를 침전시킵니다.
   5. 침전된 RNA를 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 마이크로피펫으로 상층액을 완전히 제거합니다.
   6. RNA 펠릿을 70% 에탄올을 사용하여 세척하고 5-10회 반전합니다. 12,000 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기.
   7. RNA 펠릿을 방해하지 않고 마이크로피펫으로 상층액을 완전히 제거합니다.
   8. 펠릿이 반투명해질 때까지 펠릿을 실온에서 건조시킵니다. 그런 다음 펠릿을 60-75 μL의 RNase-free 물에 다시 현탁시킵니다.
7. 정제된 RNA를 위한 품질 관리
   1. 부량
      1. 마이크로 분광 광도계를 사용하여 정제된 RNA 농도와 품질을 측정합니다.
         참고: 반응당 예상 RNA 수율은 비변형 RNA의 경우 140-180 μg, me1Ψ-UTP 변형 RNA의 경우 100-150 μg이며, 이는 관심 유전자의 크기와 IVT DNA 템플릿의 품질에 따라 달라집니다. 최적의 품질은 약 1.9-2.0 및 OD₂₆₀/OD₂₃₀ 비율 >2.0 정도의 OD₂₆₀/OD₂₈₀이어야 합니다. RNA를 -20°C에서 짧은 시간 동안 보관하십시오.
   2. 변성 RNA 아가로스 겔 전기영동
      참고: 이 실험은 합성된 RNA의 길이가 정확하고 IVT 부산물 오염이 없는지 확인하기 위해 수행됩니다.
      1. 1% 아가로스 젤을 준비하려면 원뿔형 플라스크에 아가로스 0.5g과 1x TAE 50mL를 추가합니다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 용액을 전자레인지에 돌립니다. 아가로스 용액을 실온에 5분 동안 보관하여 식히십시오.
      2. 50mL의 1% 아가로스 용액에 대해 1μL의 핵산 염색제를 추가합니다.
      3. 아가로스 용액을 빗으로 젤 주조 트레이에 붓고 젤이 응고될 때까지 그대로 둡니다.
      4. 젤에서 빗을 꺼내고 젤을 1x TAE 완충 탱크에 보관합니다.
      5. RNA loading dye sample을 표 4에 기재된 바와 같이 준비한다.
      6. 샘플을 65°C에서 10분 동안 가열한 다음 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
      7. 각 샘플을 해당 웰에 로드하고 최소 45-60분 동안 100V에서 실행합니다.
      8. 겔 문서화 기기에서 RNA 밴드를 시각화합니다(그림 3).
8. 효소 기반 캡핑(capping) 및 폴리-A 테일링(poly-A tailing)에 의한 me1Ψ-UTP 변형 mRNA의 합성
   참고: 효소 방법을 사용한 IVT RNA의 캡핑 효율은 100%입니다. 따라서 이 프로토콜에서 mRNA 합성에서 Cap-1의 효소 캡핑을 사용했습니다. mRNA의 번역 효율을 개선하기 위해 분자당 >150A 염기 길이에 poly-A 꼬리를 추가했습니다.
   1. 정제된 IVT RNA 55-60 μg을 추가하고 1.5 mL 튜브에 RNase free water를 사용하여 최대 72 μL까지 만듭니다.
   2. 65°C에서 열혼합기로 10분 동안 RNA를 변성시킨 다음 즉시 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다.
   3. 한편, 표 5와 같이 캡핑 반응 혼합물을 제조한다.
   4. 변성된 RNA에 캡핑 반응 혼합물과 캡핑 효소 4 μL를 첨가하고 마이크로피펫으로 잘 혼합합니다. 마이크로퓨지에서 튜브를 10초 동안 돌립니다.
   5. 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   6. 2시간 후 튜브를 얼음 위에 놓고 표 6과 같이 Poly A 테일링 마스터 믹스를 준비합니다.
   7. 뚜껑이 있는 RNA 용액에 Poly A tailing master mix를 추가하고 마이크로피펫으로 잘 혼합합니다. 마이크로퓨지에서 튜브를 10초 동안 돌립니다.
   8. 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
      참고: mRNA는 즉시 추가로 정제할 수 있으며, 미처리 mRNA는 -20°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.
9. IVT mRNA 정제
   1. 프로토콜 섹션 1.6에 주어진 대로 유기 추출/아세트산 암모늄 침전으로 mRNA를 정제합니다.
   2. mRNA 펠릿을 60μL의 RNase-free 물로 다시 현탁시킵니다.
10. 정제된 mRNA에 대한 품질 관리
    1. 프로토콜 섹션 1.7에 설명된 대로 품질 관리 프로토콜을 따릅니다.
       참고: mRNA 밴드는 변성 RNA 아가로스 겔 전기영동에서 Poly-A 테일링이 추가되기 때문에 RNA 밴드 위에 나타나야 합니다(그림 3). 또한 Poly-A tailing은 mRNA 수율을 증가시킵니다(RNA 농도가 >이어야 함). 정량 후 mRNA의 여러 부분 표본을 1 μg/μL 농도로 넣고 즉시 -80 °C에서 보관합니다. 합성된 mRNA의 분해를 방지하기 위해 RNA의 여러 동결 및 해동 주기를 피하십시오.

2. 양이온성 리포좀의 제조 및 in vitro mRNA transfection 특성의 평가

1. 리포좀 제제
   1. 1mM 양이온 리포솜을 준비하려면 양이온 성 지질: DOPE: 콜레스테롤을 1:1:0.5의 몰 비율로 사용합니다.
   2. 양이온성 지질, 콜레스테롤 및 DOPE(1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민)의 클로로포름(200μL)의 적절한 몰비를 유리 바이알에 용해합니다.
   3. 용매 제거를 위해 수분이 없는 질소 가스의 얇은 흐름을 사용하십시오.
   4. 건조된 지질을 고진공 상태에서 2시간 동안 더 건조시킬 수 있도록 보관하십시오.
   5. 진공 건조 후 건조된 지질에 멸균 탈이온수 1mL를 추가하고 혼합물이 밤새 팽창하도록 합니다.
   6. 바이알을 실온에서 소용돌이쳐 다단층 소포(MUV)를 만듭니다.
   7. 수조 초음파 처리 후 25W 전력에서 프로브 초음파 처리를 사용하여 다중 단층 소포(MUV)에서 작은 단층 소포(SUV)를 만듭니다.
      참고: SUV는 반투명 리포좀 용액처럼 보여야 합니다. 그렇지 않은 경우 30분 간격으로 1초 펄스를 켜고 끄는 횟수를 늘리십시오. 유체역학적 직경과 표면 전위는 입자 크기 분석기에서 측정됩니다(그림 4).
2. mRNA/리포좀 복합체 형성 및 겔 지연 분석
   1. 1:1에서 8:1까지 다양한 지질-RNA 전하 비율을 준비하려면 표 7과 같이 mRNA와 양이온성 리포좀을 탈이온수에 별도로 희석합니다.
   2. 표 7에 나타난 바와 같이 희석된 mRNA를 리포좀 용액에 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양하여 리포플렉스 형성을 한다.
   3. 20μL의 2x RNA loading dye를 복합체에 추가하고 well에 로드합니다. mRNA만이 대조군 역할을 합니다.
   4. 1x TAE 버퍼의 1% 아가로스 겔에 샘플을 로드하고 100V에서 45분 동안 실행합니다.
   5. 겔 문서화 기기에서 RNA 밴드를 시각화합니다(그림 5).
3. In vitro mRNA 트랜스펙션
   1. 48웰 플레이트의 웰당 45,000개의 포유류 세포를 완전한 배지에 파종한 다음 37°C에서 16-20시간 동안 형질 주입을 위해 배양합니다.
   2. 16-20시간 후에 세포 밀도를 확인합니다. 형질주입 시 세포 합류점은 약 80%여야 합니다.
   3. 0.5 mL 튜브에 양이온성 리포좀과 mRNA의 1:1 전하 비율로 혈청이 없는 DMEM 배지에 150 ng의 GFP 단백질 인코딩 mRNA 복합체를 추가합니다. 총 부피는 최대 20μL입니다.
   4. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   5. 세포에 리포플렉스를 추가하고 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.
   6. 세포를 방해하지 않고 매체를 제거하십시오. 각 웰에 10% FBS가 포함된 250μL의 완전한 배지를 추가합니다(표 8).
   7. transfection 72시간 후 형광 현미경에서 GFP 발현을 확인합니다(그림 6, 7).
   8. GFP 발현을 정량화하려면 유세포분석기 분석을 위해 세포를 처리합니다.
   9. 미디어를 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다. 세포를 트립신화하고 세포를 처리하여 유세포분석기에서 GFP 양성 세포의 비율을 정량화합니다.
   10. Laser 488을 사용하여 유세포 분석기에서 세포를 획득합니다. 그것으로부터 살아있는 모집단을 게이트하고 GFP 양성 세포의 백분율을 분석합니다. 평균 형광 강도(MFI)를 정량화합니다(그림 6, 7).

결과

me1Ψ-UTP 변형 mRNA 생산, 리포좀 제제 및 양이온성 리포좀을 사용하여 여러 포유류 세포에 대한 mRNA 형질 주입 실험을 위해 프로토콜을 최적화했습니다(그림 1). mRNA를 합성하기 위해 mEGFP-N1 포유류 발현 벡터에서 포유류 코돈에 최적화된 eGFP IVT 템플릿을 증폭하고 유기 추출/에탄올 침전 방법으로 정제했습니다(그림 2). 나중에, me1Ψ-UTP 변형 RNA와 mRNA가 IVT 과정에 의해 생성되었습니다. 변성 RNA 아가로스 겔 전기영동 데이터는 이러한 합성된 RNA가 우수한 무결성과 올바른 길이(RNA ladder에 대해 750 염기 RNA 및 ~1000 염기 mRNA)를 가진다는 것을 보여주었습니다(그림 3).

양이온 성 리포좀을 제조하기 위해 박막 수화 방법 및 초음파 처리를 사용하여 ...

토론

변형되지 않은 mRNA의 치료 적용은 반감기가 짧고 세포 내 선천성 면역 반응을 활성화하는 능력으로 인해 제한되어 왔으며, 이는 차례로 형질주입된 세포에서 단백질 발현을 저하시킵니다¹¹. Katalin 등은 m5C, m6A, ΨU 및 me1Ψ-UTP와 같은 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNA가 TLR 활성화를 피할 수 있음을 입증했습니다¹². 더 중요한 것은 IVT mRNA에 ΨU 또는 me1Ψ-UTP를 통합하면 표적 단백질의 우수한 번역 효율이 나타나고 실온에서 안정성이 향상되며 뉴클레아제의 분해가 방지된다는 것입니다^{13, 14}.

이 비디오에서는 여러 배양 세포로의 지질 지원 me1Ψ-UTP 변형 mRNA 전달 프로토콜을 시연했...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agarose	Lonza	50004
목욕 초음파 발생기	DNMANM 산업	USC-100
		에서 합성	양이온 성 지질
: Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"주의"
, 콜레스테롤	Himedia	GRM335
DEPC, 물	, SRL, BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA 사다리	GeneDireX	DM010-R50C
도프	TCI	D4251
EDTA 나트륨 염	MP 생물 의학	194822
에탄올	헤이만	F204325	"주의"
태아 소 혈청	Gibco	10270
유세포 분석	BD	FACS Celesta
Fluroscence 현미경	Leica	MI6000B
Gel 문서화 시스템	Cell Biosciences	Flurochem E
빙하 아세트산	Fisher Scientific	85801	"주의"
mEGFP-N1, 포유류 발현 벡터	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알콜 (25 : 24 : 1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"주의"
인산염 완충액 식염수 (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
프로브 초음파 발생기	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA ladder	NEB	N0362S
RNase 억제제	Thermo Scientific	N8080119
SafeView 염료	abm	G108
아세트산나트륨	Sigma	S7545
Thermocycler	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056