단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.
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방법 논문
글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
단백질 아르기닌(R)-메틸화는 RNA 처리, 신호 전달, DNA 손상 반응, miRNA 생물 발생 및 번역을 포함한 여러 세포 경로의 조절에 관여하는 광범위한 단백질 번역 후 변형(PTM)입니다.
최근 몇 년 동안 생화학 및 분석 개발 덕분에 질량분석법(MS) 기반 단백질체학이 단일 부위 분해능으로 세포 메틸-단백질체를 특성화하는 가장 효과적인 전략으로 부상했습니다. 그러나 MS에 의한 생체 내 단백질 R- 메틸화를 식별하고 프로파일 링하는 것은 주로 이러한 변형의 화학 양 론적 특성과 다양한 아미노산 치환의 존재 및 메틸화에 등압 인 산성 잔기의 화학적 메틸 에스테르 화로 인해 여전히 까다롭고 오류가 발생하기 쉽습니다. 따라서 R-메틸-펩타이드의 식별을 향상시키기 위한 농축 방법과 메틸-단백질체학 연구에서 거짓 발견률(FDR)을 줄이기 위한 직교 검증 전략이 필요합니다.
여기에서는 세포의 대사 표지와 중위원소 암호화 메티오닌(hmSILAC) 및 전체 세포 추출물의 이중 프로테아제 용액 내 분해를 결합한 후 안티-pan-R-메틸 항체를 사용한 R-메틸-펩타이드의 오프라인 고pH 역상(HpH-RP) 크로마토그래피 분획 및 R-메틸 펩타이드의 친화성 농축을 결합한 후 세포 샘플에서 신뢰도가 높은 R-메틸 펩타이드 식별 및 정량을 위해 특별히 설계된 프로토콜에 대해 설명합니다. 고분해능 MS 분석 시 원시 데이터는 먼저 MaxQuant 소프트웨어 패키지로 처리된 다음 MaxQuant 출력 파일 내에서 가볍고 무거운 메틸-펩타이드에 해당하는 MS 피크 쌍의 심층 검색을 위해 설계된 소프트웨어인 hmSEEKER에 의해 분석됩니다.
서론
아르기닌 (R)-메틸화는 포유류 프로테옴 1의 약1%를 장식하는 번역 후 변형(PTM)입니다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 라제 (PRMT)는 R의 측쇄의 구아니디노 그룹의 질소 (N) 원자에 하나 또는 두 개의 메틸기를 대칭 또는 비대칭 방식으로 증착하여 R- 메틸화 반응을 촉매하는 효소입니다. 포유류에서 PRMT는 모노메틸화(MMA) 및 비대칭 디메틸화(ADMA), MMA 및 대칭 디메틸화(SDMA) 또는 MMA만 각각 2,3. PRMT는 주로 GAR 모티프로 알려진 글리신 및 아르기닌이 풍부한 영역 내에 위치한 R 잔기를 표적으로 하지만 PRMT5 및 CARM1과 같은 일부 PRMT는 프롤린-글리신-메티오닌이 풍부한(PGM) 모티프를 메틸화할 수있습니다4. R-메틸화는 RNA 스플라이싱5, DNA 복구6, miRNA 생물발생7 및 번역2와 같은 여러 생물학적 과정의 단백질 조절제로 등장하여 이 PTM에 대한 연구를 촉진했습니다.....
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프로토콜
1. 세포 배양 및 단백질 추출 (시간 : 3-4 주 소요)
- HeLa 세포를 각각 경(L) 또는 중(H) 메티오닌이 공급된 배지에서 병렬로 성장시킵니다(배지 구성은 표 1 참조). 최소 8개의 세포 분열 시, 각 SILAC 채널에서 세포의 분취량을 수집하고 혼입 테스트를 수행합니다.
참고: 혼입 효율을 확인하려면 LC-MS/MS 분석으로 중질 채널에서 중질 메티오닌(Met-4)의 비율이 가능한 한 100%에 가까운지 테스트합니다. LC-MS/MS로 중표지된 세포의 분취량을 분석한 다음(설정은 표 2 참조), 표 3에 표시된 파라미터를 사용하여 MaxQuant로 MS 데이터를 처리합니다. Met-4 통합을 확인하려면 https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ 에서 자체 개발 한 스크립트를 사용할 수 있습니다. - 무거운 메티오닌 혼입이 >97 %에 도달하면 완전한 것으로 간주하십시오. 각 채널이 총 약 60 x 10 개의 세포 수에 도달하면 6 개의 세포 (HeLa 세포의 경우 85 % 컨플루언시에서 각각 15cm의 약 40개의 접시에 해당하며 세포 유형에 따라 변이됨)가이를 수확합니다. 조심스럽게 세....
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결과
이 기사에서는 단백질 추출물의 효소 분해와 두 개의 별개의 프로테아제를 병렬로 결합한 후 단백질 분해 펩타이드의 HpH-RP 액체 크로마토그래피 분획화 및 항-pan-R-메틸 항체를 사용한 R-메틸 펩타이드의 면역친화성 농축을 기반으로 하는 글로벌 단백질 R-메틸화의 신뢰도 높은 식별을 위한 워크플로에 대해 설명합니다(그림 1).
세포는 천연 (Light, L, Met-0) 또는 동위 원소 표지 (Heavy, H, Met-4) 메티오닌의 존재하에 성장시켰다. Met-4 단독 추출물의 작은 부분 표본에 대한 MS 분석에 의해 시험 된 전체 동위 원소 표지시, 중질 및 경세포를 수확하고 그림 1A에 도시된 바와 같이 1 : 1 L / H 비율로 혼합했습니다. 13CD3- 메티오닌 대사 표지시, 메틸기는 메틸 공여체 S- 아데노 실 - 메티.......
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토론
글로벌 MS 기반 단백질체학에 의한 생체 내 단백질/펩타이드 메틸화의 높은 신뢰도 식별은 높은 FDR의 위험으로 인해 어려운 일이며, 시료 준비 중에 메틸화에 등압성인 여러 아미노산 치환 및 메틸 에스테르화가 발생하고 직교 MS 검증 전략이 없는 경우 잘못된 할당을 유발할 수 있습니다. 이 PTM의 화학량론적 특성은 글로벌 메틸-단백질체학의 작업을 더욱 복잡하게 만들지만, 변형된 펩타이드(10)의 선택적 농축으로 극복할 수 있다.
여기에서는 HpH-RP 크로마토그래피 펩타이드 분획에 결합된 hmSILAC 전략의 적용 및 항-pan-R-메틸-펩타이드 항체 키트를 사용한 친화성 농축을 통해 R-메틸-펩타이드의 글로벌 MS-분석의 효율성과 신뢰성을 높이도록 설계된 생화학 및 분석 워크플로우를 제시합니다. 전자의 전략은 메틸-펩티드의 직교 검증을 허용하고 식별의 FDR을 강력하게 감소시키는 반면, 후자의 프로토콜은 변형되지 않은.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
MM과 EM은 유럽 분자 의학 학교 (SEMM)의 박사 과정 학생입니다. EM은 3 년 FIRC-AIRC 보조금 (프로젝트 코드 : 22506)의 수혜자입니다. TB 그룹의 R- 메틸 단백질체에 대한 글로벌 분석은 AIRC IG 보조금 (프로젝트 코드 : 21834)에 의해 지원됩니다.
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참고문헌
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
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