방법 논문

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

DOI:

10.3791/62409

⸱

2022년 4월 28일

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology IRCCS (IEO), 2European School of Molecular Medicine (SEMM), c/o Campus IFOM-IEO

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

초록

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단백질 아르기닌(R)-메틸화는 RNA 처리, 신호 전달, DNA 손상 반응, miRNA 생물 발생 및 번역을 포함한 여러 세포 경로의 조절에 관여하는 광범위한 단백질 번역 후 변형(PTM)입니다.

최근 몇 년 동안 생화학 및 분석 개발 덕분에 질량분석법(MS) 기반 단백질체학이 단일 부위 분해능으로 세포 메틸-단백질체를 특성화하는 가장 효과적인 전략으로 부상했습니다. 그러나 MS에 의한 생체 내 단백질 R- 메틸화를 식별하고 프로파일 링하는 것은 주로 이러한 변형의 화학 양 론적 특성과 다양한 아미노산 치환의 존재 및 메틸화에 등압 인 산성 잔기의 화학적 메틸 에스테르 화로 인해 여전히 까다롭고 오류가 발생하기 쉽습니다. 따라서 R-메틸-펩타이드의 식별을 향상시키기 위한 농축 방법과 메틸-단백질체학 연구에서 거짓 발견률(FDR)을 줄이기 위한 직교 검증 전략이 필요합니다.

여기에서는 세포의 대사 표지와 중위원소 암호화 메티오닌(hmSILAC) 및 전체 세포 추출물의 이중 프로테아제 용액 내 분해를 결합한 후 안티-pan-R-메틸 항체를 사용한 R-메틸-펩타이드의 오프라인 고pH 역상(HpH-RP) 크로마토그래피 분획 및 R-메틸 펩타이드의 친화성 농축을 결합한 후 세포 샘플에서 신뢰도가 높은 R-메틸 펩타이드 식별 및 정량을 위해 특별히 설계된 프로토콜에 대해 설명합니다. 고분해능 MS 분석 시 원시 데이터는 먼저 MaxQuant 소프트웨어 패키지로 처리된 다음 MaxQuant 출력 파일 내에서 가볍고 무거운 메틸-펩타이드에 해당하는 MS 피크 쌍의 심층 검색을 위해 설계된 소프트웨어인 hmSEEKER에 의해 분석됩니다.

서론

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아르기닌 (R)-메틸화는 포유류 프로테옴 1의 약1%를 장식하는 번역 후 변형(PTM)입니다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 라제 (PRMT)는 R의 측쇄의 구아니디노 그룹의 질소 (N) 원자에 하나 또는 두 개의 메틸기를 대칭 또는 비대칭 방식으로 증착하여 R- 메틸화 반응을 촉매하는 효소입니다. 포유류에서 PRMT는 모노메틸화(MMA) 및 비대칭 디메틸화(ADMA), MMA 및 대칭 디메틸화(SDMA) 또는 MMA만 각각 2,3. PRMT는 주로 GAR 모티프로 알려진 글리신 및 아르기닌이 풍부한 영역 내에 위치한 R 잔기를 표적으로 하지만 PRMT5 및 CARM1과 같은 일부 PRMT는 프롤린-글리신-메티오닌이 풍부한(PGM) 모티프를 메틸화할 수있습니다4. R-메틸화는 RNA 스플라이싱5, DNA 복구6, miRNA 생물발생7 및 번역2와 같은 여러 생물학적 과정의 단백질 조절제로 등장하여 이 PTM에 대한 연구를 촉진했습니다.

질량분석법(MS)은 단백질, 펩타이드 및 부위 분해능에서 글로벌 R-메틸화를 체계적으로 연구하는 가장 효과적인 기술로 인정받고 있습니다. 그러나 이 PTM은 MS에 의한 높은 신뢰도 식별을 위해 몇 가지 특별한 예방 조치가 필요합니다. 첫째, R- 메틸화는 화학 양 론적이며, 변형되지 않은 형태의 펩타이드는 변형 된 것보다 훨씬 풍부하므로 데이터 종속 수집 (DDA) 모드에서 작동하는 질량 분석기는 고강도 변형되지 않은 펩타이드를 저강도 메틸화 대응 물보다 더 자주 단편화합니다8. 또한 R-메틸화 부위 식별을 위한 대부분의 MS 기반 워크플로우는 생물정보학적 분석 수준에서 한계가 있습니다. 실제로, 메틸 펩타이드의 전산 식별은 높은 거짓 발견률 (FDR)을 갖기 쉽는데,이 PTM은 다양한 아미노산 치환 (예 : 글리신을 알라닌으로) 및 화학적 변형 (예 : 아스 파르 테이트 및 글루타메이트9)의 메틸 에스테르 화에 등압하기 때문입니다. 따라서 세포 배양에서 아미노산을 사용한 중질 메틸 안정 동위원소 표지(hmSILAC)와 같은 메틸기의 동위원소 표지를 기반으로 하는 방법은 생체 내 메틸화의 신뢰할 수 있는 MS 식별을 위한 직교 전략으로 구현되어 위양성 주석의 비율을 크게 줄였습니다10.

최근에는 R-메틸화 단백질을 연구하기 위한 다양한 프로테옴 전체 프로토콜이 최적화되었습니다. R-메틸-펩티드의 면역-친화성 농축을 위한 항체-기반 전략의 개발은인간 세포에서 수백개의 R-메틸화 부위의 주석을 달게 하였다11,12. 또한 많은 연구 3,13에서 항체 기반 농축을 HpH-RP 크로마토그래피 분획과 같은 펩타이드 분리 기술과 결합하면 식별된 메틸 펩타이드의 전체 수를 늘릴 수 있다고 보고했습니다.

이 논문은 hmSILAC 표지 세포에서 단백질 추출, 트립신 및 리사르기나제 프로테아제를 사용한 병렬 이중 효소 분해, MMA-, SDMA-, 및 ADMA-함유 펩티드를 포함한다. 그런 다음 모든 친화도가 풍부한 펩타이드는 DDA 모드에서 고분해능 액체 크로마토그래피(LC)-MS/MS로 분석되고 원시 MS 데이터는 R-메틸 펩타이드 식별을 위해 MaxQuant 알고리즘으로 처리됩니다. 마지막으로, MaxQuant 출력 결과는 무겁고 가벼운 메틸 펩타이드 쌍을 검색하기 위해 자체 개발 한 생물 정보학 도구 인 hmSEEKER로 처리됩니다. 간단히 말해서, hmSEEKER는 msms 파일에서 메틸-펩타이드 식별을 읽고 필터링한 다음 각 메틸-펩타이드를 allPeptides 파일의 해당 MS1 피크와 일치시키고, 마지막으로 중/경량 펩타이드 대응물의 피크를 검색합니다. 각 추정 헤비라이트 쌍에 대해 Log2 H/L 비율(LogRatio), 머무름 시간 차이(dRT) 및 질량 오차(ME) 매개변수가 계산되고 사용자 정의 컷오프 내에 있는 이중선은 참양성으로 레이블이 지정됩니다. 생화학 프로토콜의 워크 플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다.

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프로토콜

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1. 세포 배양 및 단백질 추출 (시간 : 3-4 주 소요)

  1. HeLa 세포를 각각 경(L) 또는 중(H) 메티오닌이 공급된 배지에서 병렬로 성장시킵니다(배지 구성은 표 1 참조). 최소 8개의 세포 분열 시, 각 SILAC 채널에서 세포의 분취량을 수집하고 혼입 테스트를 수행합니다.
    참고: 혼입 효율을 확인하려면 LC-MS/MS 분석으로 중질 채널에서 중질 메티오닌(Met-4)의 비율이 가능한 한 100%에 가까운지 테스트합니다. LC-MS/MS로 중표지된 세포의 분취량을 분석한 다음(설정은 표 2 참조), 표 3에 표시된 파라미터를 사용하여 MaxQuant로 MS 데이터를 처리합니다. Met-4 통합을 확인하려면 https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ 에서 자체 개발 한 스크립트를 사용할 수 있습니다.
  2. 무거운 메티오닌 혼입이 >97 %에 도달하면 완전한 것으로 간주하십시오. 각 채널이 총 약 60 x 10 개의 세포 수에 도달하면 6 개의 세포 (HeLa 세포의 경우 85 % 컨플루언시에서 각각 15cm의 약 40개의 접시에 해당하며 세포 유형에 따라 변이됨)가이를 수확합니다. 조심스럽게 세고 1:1 비율로 혼합하고 335 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 만듭니다.
    참고: 적절한 1:1 L/H 혼합을 평가하려면 분취량을 유지하고 R-메틸화 단백질(예: 피브릴라린)이 많이 함유된 것으로 알려진 젤 조각에 실행합니다. 라벨링이 성공하고 1:1 혼합이 달성되면 샘플에 존재하는 R-메틸화 펩타이드의 가벼운 버전과 무거운 버전의 1:1 비율이 있어야 합니다. 또는 LC-MS/MS로 분석할 혼합 샘플의 분취량을 유지한 다음 표 3 에 표시된 매개변수를 사용하여 MaxQuant로 MS 데이터를 처리하고 그림 2C에 표시된 대로 Log2 H/L 비율의 분포를 플로팅합니다. 프로토콜은 펠릿을 스냅 냉동하고 -80 ° C에서 저장하여 여기에서 중지 할 수 있습니다.
  3. 세포 펠릿 부피에 대하여 세포 펠릿을 4부피의 용해 완충액(용해 완충액 조성에 대해서는 표 1 참조)에 재현탁시킨다. 예를 들어, 1.5mL 부피에 해당하는 120 x 10 6 Hela 셀(60 x 10 6 Light + 60 x 106 Heavy)의 펠릿에 6mL의 용해 버퍼를 사용합니다.
    알림: 단백질 추출은 실온(RT)에서 수행해야 하는데, 용해 완충액에는 얼음 온도에서 침전되는 카오트로픽 에이전트 9M 요소가 포함되어 있기 때문입니다. 따라서, 단백질 분해 분해 및 탈인산화로부터 단백질을 동시에 보호하기 위해 포스파타제 억제제뿐만 아니라 광범위한 스펙트럼의 세린 및 시스테인 프로테아제 억제제의 첨가가 중요하며, 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 칵테일은 소형 정제로서 시판되고 있다( 표 1 및 재료 표 참조).
  4. 마이크로팁 세포 파괴기 초음파 처리기로 샘플을 15초 ON 및 30초 OFF의 최소 5주기 동안 초음파 처리하여 세포막과 DNA 방출 및 전단의 효율적인 파손을 보장합니다. 용액을 위아래로 피펫팅하여 추출물의 점도를 확인하십시오. 불완전한 DNA 전단 및 막 가용화로 인해 너무 점성이 있으면 초음파 처리 사이클을 반복하십시오.
    알림: 고온이 단백질을 손상시킬 수 있으므로 초음파 처리 중에 샘플이 과열되지 않도록하십시오. 그러나 초음파 처리 사이클 사이에 샘플을 얼음 위에 놓는 것은 불가능합니다., 9M Urea의 존재 때문에; 따라서 다른 초음파 처리 주기 사이에 60초 동안 일시 중지하는 것이 좋습니다. 또한, 초음파 처리 효율을 감소시키기 때문에 초음파 처리 중에 기포의 형성을 피하십시오.
  5. 추출물을 RT에서 10분 동안 3,000 x g 로 원심분리하여 파편을 펠릿화하고 상청액을 새 15mL 튜브에 옮깁니다.
  6. Bradford 또는 bicinchoninic acid (BCA)와 같은 비색 분석으로 추출물의 단백질 함량을 측정합니다.14,15. 이 프로토콜에 대한 단백질 추출물의 최적 시작량은 20-30mg입니다.
    참고: 고농도 요소를 포함하는 용해 완충액은 Bradford 및 BCA 정량 분석과 호환됩니다. 고농도의 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함하는 것과 같은 다른 유형의 Lysis 완충액은 Bradford와 호환되지 않습니다.

2.  용해물 소화 (표시 시간 2 시간 소요)

  1. 초순수에 용해된 디티오트레이톨(DTT)의 원액을 최종농도 4.5mM로 사용하여 단백질의 티올기(-SH)의 환원을 수행하고 55°C에서 30분간 반응시켰다.
    참고: 1M 스톡 DTT 용액을 준비하고 -20°C에서 최대 1개월 동안 보관하여 각 실험에 필요한 분취량만 해동할 수 있습니다. 대안적으로, 설프 하이 드릴 환원제 트리스 - (2- 카르복시 에틸) - 포스 핀 (TCEP)을 사용하여 -SH 기의 환원을 수행 할 수있다. 특히 단백질의 장기 보관의 경우, TCEP는 완충액에 EGTA와 같은 금속 킬레이트가없는 DTT보다 훨씬 더 안정한 반면, DTT는 금속 킬레이트가 존재하는 경우 더 안정하다16.
  2. 10mM 농도의 요오도 아세트 아미드 (IAA)를 첨가하여 단백질의 티올 그룹 (-SH)의 알킬화를 수행하고 어두운 곳에서 RT에서 15 분 동안 배양합니다. IAA는 감광성이므로 어두운 곳에서 IAA 용액으로 추출된 단백질의 배양을 수행합니다.
    참고 : 100mM의 IAA 스톡 용액은 각 실험 전에 신선하게 준비해야합니다. 대안적으로, 클로로아세트아미드는 -SH 기의 알킬화를 수행하기 위해 사용될 수 있는데, 특히 실험의 목표가 메틸화와 유비퀴틴화 사이의 혼선을 분석하는 것이라면 IAA-유도 인공물이 유비퀴틴화17을 모방하기 때문이다.
  3. 단백질 분해 단계를 진행하기 전에 SDS-PAGE Coomassie 염색 겔에 대한 후속 분석 및 분해시 해당 양의 샘플과 비교하기 위해 단백질 추출물의 분취량 (소화되지 않은 용해물의 1/1,000)을 저장하십시오. 이 시험은 단백질 분해 효율을 검증하는 역할을 한다(점 4 참조).
  4. 나머지 단백질 추출물을 20mM hepes pH 8.0의 4 부피로 희석하여 2M의 최종 요소 농도 (프로테아제의 효소 활성과 호환되는 농도)에 도달합니다. 샘플을 두 부분으로 나눕니다: 첫 번째 부분에 시퀀싱 등급 변형 트립신을 추가하고 두 번째 부분에 LysargiNase 프로테아제( 재료 표 참조)를 출발 물질 mg에 대해 1:100(w/w) 비율로 추가합니다. 효소 소화를 허용하기 위해 600rpm의 열혼합기에서 37°C에서 밤새 방치합니다.
    참고: 단백질체학에서 가장 흔한 소화 효소인 트립신은 R과 라이신(K)의 C-말단에서 절단되어 충돌 유도 해리(CID) 시 y형 이온이 지배하는 단편화 스펙트럼을 초래하는 전하 분포를 가진 펩타이드를 생성합니다. 따라서 LysargiNase는 R 및 K의 N- 말단에서 절단되어 트립신 절단 특이성을 반영하고 CID 단편화시 주로 b 형 이온을 방출하는 펩타이드를 생성합니다. 이 결합 된 분석은 펩타이드 서열 커버리지를 훨씬 증가시키고 R- 메틸화18의 부위 특이 적 식별에 대한 신뢰도를 높입니다.

3. 펩타이드 정제 (지시 시간 1 시간 소요)

  1. 두 반응에서 소화된 펩타이드의 분취량을 유지하고 단백질 분해효소 분해 효율을 평가하기 위해 SDS-PAGE Coomassie 염색 겔에서 비교하기 위해 포인트 2.3에서와 동일한 부피를 수집합니다(포인트 4 참조).
  2. 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 샘플을 최종 농도 5%로 산성화하여 소화를 중지합니다. 잘 혼합하고 리트머스 종이로 샘플 pH를 측정합니다(pH는 약 3이어야 함). 와동을 잠시 하고 산성화된 샘플을 스핀다운한 후 새 15mL 튜브로 옮깁니다.
  3. 두 개의 C18 vac 카트리지(흡착제 무게 1g, 재료 표 참조)를 통해 샘플을 세척하며, 하나는 트립신으로 분해된 샘플용이고 다른 하나는 LysargiNase로 분해된 샘플용입니다. 용매 A, 용매 B 및 세척 완충액을 준비합니다(완충액 조성은 표 1 참조).
  4. 유리 피펫을 사용하여 각 카트리지에 6mL의 ACN 100 %로 3 회 재수화합니다. 그런 다음 각 카트리지를 3-9-18mL의 용매 A와 순차적으로 평형을 이루고 샘플을 로드합니다(수지가 노란색이 되어야 함). 3-9-18mL의 용매 A로 순차적으로 다시 세척한 다음 6mL의 세척 완충액을 추가합니다. 각 컬럼을 깨끗한 15mL 튜브로 옮기고 7mL의 용매 B로 샘플을 용리합니다. 최종 부피 14mL에 대해 용매 B 7mL로 용리 단계를 반복합니다.
    알림: 버퍼와 용액이 중력에 의해 컬럼을 통과하도록 하여 이 모든 단계를 수행하십시오. 컬럼을 통한 완충액의 흐름을 선호하려면 주사기로 각 용액을 천천히 밀어 진공을 모방합니다.
  5. SDS-PAGE에 의한 후속 펩타이드 평가를 위해 용출된 펩타이드 50μL, 플로우스루(FT) 50μL, 용매 A로 세척 50μL, 마지막 세척 50μL를 저장합니다(포인트 4 참조).

4. 쿠마시 염색 SDS-PAGE 젤 (표시 시간 2 시간 필요)

  1. 수집된 분취량을 17.5% SDS-PAGE 젤에 실행하고 인스턴트 블루 쿠마시 염색으로 염색합니다( 재료 표 참조). 예상 결과는 그림 2A에 나와 있습니다.

5. 펩타이드 동결건조 (지시 시간 2 일)

  1. 용출된 펩타이드가 들어 있는 15mL 튜브를 파라핀 필름으로 덮은 다음 20G 바늘로 구멍을 뚫어 3-5개의 구멍을 만듭니다. 샘플이 완전히 얼 때까지 튜브를 최소 30분 동안 드라이아이스에 넣습니다.
  2. 동결 분획을 48시간 동안 동결건조하는데, 이는 동결 건조기 성능으로 인해 약간의 변동성이 발생할 수 있더라도 샘플의 완전한 동결건조를 보장하기에 일반적으로 충분한 시간 간격입니다.
    참고: 여기에서 실험을 일시 중지하여 동결건조된 샘플을 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

6. 펩타이드의 오프라인 HpH-RP 크로마토그래피 분획 (지시 시간 4일)

  1. 펩타이드를 60개의 분획으로 분획하려면 C12-RP HPLC 컬럼(250 x 4.6mm, 4μm Proteo 90A)이 장착된 HPLC 시스템을 사용하여 HpH-RP 액체 크로마토그래피를 사용합니다.
  2. 실행하기 전에 새로운 버퍼 A와 버퍼 B를 준비하십시오(버퍼의 구성은 표 1에 설명되어 있음).
  3. 0.22 μm 필터로 모든 용액을 여과하고 적어도 30 분 동안 초음파 처리기 욕조에서 가스를 제거하십시오.
  4. 동결건조된 펩티드를 완충액 A 1 mL에 용해시키고, 주사기를 사용하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 0.45 μm 필터를 통해 펩티드를 여과한다.
  5. 분획 속도를 1mL/분 흐름으로 설정하고 다음 크로마토그래피 그래디언트를 사용하여 1mL의 분획을 수집합니다: 60분 내에 5% B에서 30% B; 2 분 안에 30 % B 내지 60 %; 3 분 동안 70 % B.
  6. 이 시점에서 분획 수집이 중단되고 그래디언트를 70% 버퍼 B에서 5분 동안 유지한 후 최대 100% 버퍼 B까지 빠른 그래디언트로 컬럼을 광범위하게 세척한 다음 최종 세척(10분 동안 100% 버퍼 B)이 되도록 HPLC를 설정합니다.
    참고: 각 크로마토그래피 실행이 끝나면 항상 100% 버퍼 A로 컬럼을 20분 동안 평형을 유지하십시오.
  7. 포인트 6.5에 설명된 바와 같이 오프라인 HpH RP 크로마토그래피 구배에 의해 트립신 및 리사르기나스제로 개별적으로 소화된 두 샘플을 분획화합니다.
  8. 각 크로마토그래피 그래디언트에 대해 모든 분획을 깊은 96웰 플레이트에 수집합니다.
  9. 그래디언트 전에 수집된 분수를 PRE라는 하나의 단일 분수로 풀링합니다. HpH-RP 액체 크로마토그래피(LC) 그래디언트에서 60개의 분획을 인접하지 않은 방식으로 풀링하여 14개의 최종 분획으로 연결합니다. 이러한 비연속 연접을 얻으려면, 하기 반응식에 따라 HpH-RP 분획을 풀링한다.
    1. 분획 1 (최종 부피 5 mL) : 풀 1-15-29-43-57
    2. 분획 2 (최종 부피 5 mL) : 풀 2-16-30-44-58
    3. 분획 3(최종 부피 5mL): 풀 3-17-31-45-59
    4. 분획 4 (최종 부피 5 mL) : 풀 4-18-32-46-60
    5. 분획 5 (최종 부피 4 mL) : 풀 5-19-33-47
    6. 분획 6 (최종 부피 4 mL) : 풀 6-20-34-48
    7. 분획 7 (최종 부피 4 mL) : 풀 7-21-35-49
    8. 분획 8 (최종 부피 4 mL) : 풀 8-22-36-50
    9. 분획 9 (최종 부피 4 mL) : 풀 9-23-37-51
    10. 분획 10 (최종 부피 4 mL) : 풀 10-24-38-52
    11. 분획 11 (최종 부피 4 mL) : 풀 11-25-39-53
    12. 분획 12 (최종 부피 4 mL) : 풀 12-26-40-54
    13. 분획 13 (최종 부피 4 mL) : 풀 13-27-41-55
    14. 분획 14 (최종 부피 4 mL) : 풀 14-28-42-56
      참고: 비연속 연결은 초기, 중기 및 후기 용리 분획을 결합하는 것으로 구성되며, 이는 풀링된 분획 내에서 펩타이드 조성의 이질성을 증가시킬 수 있습니다. 결과적으로, 각 풀링된 분획의 펩타이드 혼합물은 질량분석기에 직접 결합된 후속 나노플로우 저pH-RP-LC 크로마토그래피에서 제한된 동시 용리로 효율적으로 분리됩니다.
  10. 그래디언트 후에 수집된 분수를 POST라는 고유한 분수로 풀링합니다.
    참고: 분획 PRE 및 POST 그래디언트를 포함하면 15mL 튜브에서 총 16개의 분획을 얻을 수 있습니다( 그림 3A 참조).
  11. 15mL 튜브를 파라핀 필름으로 덮고 20G 바늘로 펀칭하여 3-5개의 구멍을 만듭니다. 각 분획이 완전히 얼 때까지 원심 분리 튜브를 드라이 아이스에서 배양하여 동결시킵니다.
  12. 분획을 약 48 시간 동안 동결 건조시킨다. 동결 건조기를 중지하기 전에 각 샘플이 완전히 건조되었는지 확인하십시오.
    참고: 여기에서 실험을 일시 중지하여 동결건조된 샘플을 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

7. R- 메틸화 펩타이드 면역 친화성 농축 (표시 시간 2 일)

  1. 항 -pan-R- 메틸화 항체를 갖는 변형 된 펩티드의 순차적 면역 친화도 농축을 병렬로 수행하되, 트립신 및 LysargiNase 소화로부터의 두 샘플에 대해 각각 별도로 수행한다. 면역 친화성 정제 (IAP) 버퍼는 변형 된 펩타이드 친화도 농축을위한 항 -pan-R- 메틸 항체를 구매하는 회사에서 제공합니다 (자세한 내용은 표 재료 및 시약 참조). IAP 버퍼는 10배 농축되며 사용하기 전에 10배 희석해야 합니다.
    참고: IAP 버퍼 1x는 -20°C에서 최대 1년까지 보관할 수 있습니다.
  2. 동결건조된 펩타이드를 RT에서 5분 동안 2,000 x g 로 원심분리하여 펩타이드를 15mL 튜브의 바닥으로 스핀다운합니다. 동결건조된 펩타이드를 15mL 튜브당 250μL의 1x IAP 버퍼로 재현탁하고 1.5mL 저결합 튜브에 옮깁니다. pH가 >6인지 리트머스 종이를 사용하여 확인하십시오.
  3. 후속 MS 분석을 위한 입력으로 각 분획의 작은 부분 표본(부피의 약 5%)을 유지하십시오.
  4. 비대칭 디메틸화(ADMA) 및 대칭 디메틸화(SDMA) 펩타이드의 면역 농축을 병렬로 수행하기 위해 각 분획을 두 개의 분취량으로 분할합니다.
  5. 초기 단백질 추출물 10 mg 당 단백질 A 아가로스 비드에 접합된 선택된 항-R-메틸화 항체의 3개 바이알을 사용한다.
  6. 각 바이알을 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 비드로부터 완충액을 제거하여 아가로스 비드에 접합된 정확한 양의 항체를 준비합니다. 비드를 항상 1x PBS 1mL로 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 세 번 세척합니다.
  7. 마지막 세척 후, 비드를 각각의 바이알에 대해 40 μL 1x PBS에 재현탁시키고; 그것들을 모아서 마지막으로 16 개의 분획으로 균등하게 나눕니다 (각 분획에 2.5 μL의 항체 비드가 추가되도록).
  8. 각 튜브에 250μL의 1x IAP 버퍼를 추가하고 뒤집어 혼합한 다음 4°C에서 2시간 동안 회전 휠에서 배양합니다.
    알림: 비드가 손상되거나 손실될 수 있는 마이크로팁으로 피펫팅하는 대신 1.5mL 튜브를 뒤집어 샘플을 혼합하십시오.
  9. 2시간 배양 시, 펩타이드 및 pan-R-메틸-항체-접합 비드를 함유하는 1.5mL 튜브를 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하고; 각 분획의 FT를 깨끗한 1.5mL 저결합 튜브로 옮깁니다.
  10. R-모노메틸화(MMA)에 대한 항체에 접합된 비드를 FT에 추가하고 7.7 내지 7.9단계를 반복한다.
  11. MMA-비드를 사용하여 펩타이드 샘플을 인큐베이션하는 동안 이전에 항-ADMA 및 SDMA로 면역침전된 분획을 250μL IAP 버퍼로 2회 세척하고(피펫팅이 아닌 반전), 세척할 때마다 상청액을 폐기합니다.
  12. LC-MS 등급H2O로 3회 세척을 반복한다.
  13. 각 튜브에 0.15% TFA 50μL를 첨가하여 아가로스 비드로부터 친화성이 풍부한 대칭 및 비대칭 R-디메틸화 펩타이드를 용리시킨다(강산 조건은 실제로 항체로부터 항원의 방출을 유도하는 에피토프를 변성시킨다). 이 용액을 RT에서 10분 동안 그대로 두고 2-3분마다 튜브를 뒤집습니다.
  14. 첫 번째 용출을 깨끗한 1.5mL 저결합 튜브로 옮기고 50μL 0.15% TFA로 용리를 반복합니다. 하나의 튜브에 2 개의 분획을 풀링합니다.
  15. 항-MMA 항체 비드와 함께 인큐베이션된 R-모노메틸화 펩티드에 대해 7.11 내지 7.14의 단계를 반복한다.

8. C18 마이크로 컬럼에 의한 친화성이 풍부한 메틸 펩타이드의 탈염 및 농축 (표시 시간 30 분 필요)

  1. MS 분석 전에 펩타이드 탈염 및 농축을 위해 3M 고체상 추출 카트리지로 만든 C18-RP 마이크로컬럼을 메탄올과 평형화합니다19.
  2. 600 x g 에서 6분 동안 원심분리하여 두 단계(각 C18 마이크로컬럼에서 50μL + 50μL)로 C18 마이크로컬럼에 샘플(별도의 면역친화성 농축 분획 및 입력 분획에 해당)을 로드합니다.
  3. 마이크로 컬럼을 55μL 버퍼 A(버퍼 조성은 표 1 참조)로 세척하고 항상 약 900 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    참고: 여기서 실험을 일시 중지하고 C18-RP 마이크로컬럼을 4°C에 두어 최대 2주까지 보관할 수 있습니다.

9. 두 번째 효소 소화 (표시 시간 3 시간 소요)

  1. C18-RP 마이크로컬럼을 55μL의 버퍼 A(버퍼 조성은 표 1 참조)로 2회 세척하고 약 850 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  2. 펩티드를 20 μL의 완충액 B(완충액 조성은 표 1 참조)로 2회 용리하고 2개의 분획을 풀링한다.
  3. 용출된 펩타이드를 진공 농축기에서 건조시킵니다(자세한 내용은 표 재료 및 시약 참조). 한편, 새로 만든 50M 스톡 용액에서 희석된 1mM 중탄산암모늄으로 구성된 분해 용액을 준비합니다( 표 1 참조).
  4. 트립신 또는 리사르기나스제를 각 샘플에 첨가하여 최종 농도 25ng/μL가 되도록 합니다. 각 샘플을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  5. 소화를 멈추기 위해 1 μL의 5 % TFA를 첨가하십시오. 소용돌이를 일으키고 샘플을 스핀 다운합니다.
    참고: 트립신에 의한 효소적 절단은 메틸화된 R 및 K의 C-말단에서 억제될 수 있으며, 이는 펩타이드 길이와 전하를 증가시키는 절단을 놓치게 하여 펩타이드 식별 및 메틸화 부위의 부위 특이적 귀속을 방해하는 복잡하고 불완전한 단편화 스펙트럼을 생성합니다. 제2 효소 소화는 개선된 서열 커버리지 및 부위-귀속(site-attribution)20과 함께 그러한 누락된 절단의 빈도를 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다.

10. 탈염 펩타이드 (표시 시간 30 분 소요)

  1. 산성화된 펩타이드 용액을 포인트 8에 설명된 것과 동일한 단계에 따라 이전에 평형화된 새로운 C18-RP 마이크로컬럼에 로드합니다.
  2. C18-RP 마이크로컬럼에 로딩된 펩타이드는 LC-MS/MS 분석을 위해 용리될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.

11. 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS) 분석 (표시 시간 5 일)

  1. 10μL의 완충액 B를 통과시켜 C18-RP 마이크로컬럼으로부터 펩티드를 용리시키고, RT에서 5분 동안 615 x g 로 원심분리한다. 이 단계를 두 번 반복하고 용출액을 결합한다.
  2. 진공 농축기에서 용리액이 거의 건조될 때까지 용리액의 부피를 줄이고 과도한 건조를 피하십시오.
  3. LC-MS/MS 분석을 위해 펩타이드를 10μL의 완충액 A에 재현탁시킨다.
  4. 나노 플로우 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템에 연결된 고분해능 질량분석기( 재료 표 참조)에서 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)으로 R-메틸 펩타이드의 각 분획을 분석합니다. 표 2에 설명된 대로 기기 매개변수를 설정합니다.
  5. C18-RP 수지(입자 크기 2μm)로 채워진 나노 분석 컬럼(쉬운 스프레이 컬럼 내경 75μm, 길이 25cm)에 각 샘플 2μL를 로드합니다.
  6. 샘플은 300 nL / min의 유속으로 C18 RP 나노 컬럼을 통과하며, 89 분 동안 3 % -30 % B, 5 분 동안 30 % -60 % B, 1 분 동안 60 % -95 % B, 5 분 동안 95 % B.
  7. 질량분석기는 데이터 종속 수집(DDA) 모드에서 작동하여 전체 스캔 MS와 MS/MS 수집 간에 자동으로 전환됩니다. 분광계 검출기에서 분석할 측량 전체 스캔 MS를 분해능 R = 70,000으로 설정합니다. 15 개의 가장 강렬한 펩타이드 이온은 3 x 106 의 목표 값으로 순차적으로 분리되고 28 %의 상대 충돌 에너지에 의해 단편화됩니다. 최대 허용 이온 축적 시간을 전체 스캔의 경우 20ms, MS/MS의 경우 50ms로 설정하고 MSMS의 목표 값을 1 x 106으로 고정합니다. 동적 제외 시간은 20초로 설정됩니다.

12. MaxQuant 및 hmSeeker 데이터 분석 실행

  1. LC-MS/MS 실행이 완료되면 MS 원시 데이터를 펩타이드 검색 엔진으로 가져와 참조 데이터베이스에 대한 확률 기반 접근 방식으로 메틸 펩타이드를 식별합니다. 이 프로토콜에서는 MaxQuant 버전 1.6.2.10이 분석에 사용되었습니다. MaxQuant를 실행하려면 최소 2GB의 RAM과 모든 원시 데이터와 모든 출력 파일을 저장할 수 있는 충분한 디스크 공간이 필요합니다.
    참고: 설치 및 하드웨어 및 소프트웨어 요구 사항에 대한 자세한 내용은 https://www.maxquant.org 의 공식 설명서를 참조하십시오.
  2. 각 원시 데이터 파일을 복제합니다. 이름에 "_light"을 추가하여 원본의 이름을 바꾼 다음 "_heavy"을 추가하여 복사본의 이름을 바꿉니다.
    참고: 다운스트림 분석용 스크립트인 hmSEEKER는 대소문자를 구분합니다.
  3. 표 3에 표시된 설정으로 펩타이드 식별을 위한 MaxQuant/Andromeda 검색을 시작합니다. MaxQuant에서 생성된 여러 출력 데이터 중 allPeptides.txt 및 msms.txt 파일(결합된/txt 하위 폴더에 있음)만 후처리 단계에 필요합니다.
  4. MaxQuant 출력 데이터의 사후 처리는 알고리즘 hmSEEKER에 의해 수행됩니다. hmSEEKER 다운로드 : https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. 이 스크립트는 Python 3.7로 작성된 Jupyter 노트북으로 제공되며 테스트 목적으로 샘플 데이터 세트와 함께 제공됩니다. 신규 사용자의 경우 Anaconda 플랫폼 (https://www.anaconda.com/products/individual)을 다운로드하여 설치하는 것이 좋습니다. 최신 릴리스에는 기본적으로 파이썬 3.8, Jupyter 및 hmSEEKER를 실행하는 데 필요한 모든 패키지 (예 : Scikit-learn 0.23.1)가 포함되어 있습니다.
  5. 폴더를 만들고 MaxQuant 출력에서 allPeptides.txt 및 msms.txt 파일을 저장합니다.
  6. Jupyter를 시작하십시오 (명령 줄 또는 아나콘다 네비게이터에서).
  7. hmSEEKER 폴더로 이동하여 hmSEEKER.ipynb를 엽니다.
  8. 노트북의 입력 매개 변수 섹션에서 FASTA 데이터베이스 및 MaxQuant 텍스트 파일이 포함된 폴더의 경로를 표시합니다.
  9. 셀을 선택하고 Jupyter 인터페이스 상단의 재생 버튼을 클릭하여 각 셀 내부의 코드를 실행합니다.
  10. 스크립트는 분석된 각 데이터 세트에 대해 쉼표로 구분된 출력 파일과 결합된 파일을 생성합니다. 최종 더블릿 목록은 "[날짜]-[시간]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv" 파일에서 찾을 수 있습니다.
    (표 4 에는 출력 테이블의 열에 대한 간략한 설명이 포함되어 있습니다.)

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결과

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이 기사에서는 단백질 추출물의 효소 분해와 두 개의 별개의 프로테아제를 병렬로 결합한 후 단백질 분해 펩타이드의 HpH-RP 액체 크로마토그래피 분획화 및 항-pan-R-메틸 항체를 사용한 R-메틸 펩타이드의 면역친화성 농축을 기반으로 하는 글로벌 단백질 R-메틸화의 신뢰도 높은 식별을 위한 워크플로에 대해 설명합니다(그림 1).

세포는 천연 (Light, L, Met-0) 또는 동위 원소 표지 (Heavy, H, Met-4) 메티오닌의 존재하에 성장시켰다. Met-4 단독 추출물의 작은 부분 표본에 대한 MS 분석에 의해 시험 된 전체 동위 원소 표지시, 중질 및 경세포를 수확하고 그림 1A에 도시된 바와 같이 1 : 1 L / H 비율로 혼합했습니다. 13CD3- 메티오닌 대사 표지시, 메틸기는 메틸 공여체 S- 아데노 실 - 메티...

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토론

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글로벌 MS 기반 단백질체학에 의한 생체 내 단백질/펩타이드 메틸화의 높은 신뢰도 식별은 높은 FDR의 위험으로 인해 어려운 일이며, 시료 준비 중에 메틸화에 등압성인 여러 아미노산 치환 및 메틸 에스테르화가 발생하고 직교 MS 검증 전략이 없는 경우 잘못된 할당을 유발할 수 있습니다. 이 PTM의 화학량론적 특성은 글로벌 메틸-단백질체학의 작업을 더욱 복잡하게 만들지만, 변형된 펩타이드(10)의 선택적 농축으로 극복할 수 있다.

여기에서는 HpH-RP 크로마토그래피 펩타이드 분획에 결합된 hmSILAC 전략의 적용 및 항-pan-R-메틸-펩타이드 항체 키트를 사용한 친화성 농축을 통해 R-메틸-펩타이드의 글로벌 MS-분석의 효율성과 신뢰성을 높이도록 설계된 생화학 및 분석 워크플로우를 제시합니다. 전자의 전략은 메틸-펩티드의 직교 검증을 허용하고 식별의 FDR을 강력하게 감소시키는 반면, 후자의 프로토콜은 변형되지 않은...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MM과 EM은 유럽 분자 의학 학교 (SEMM)의 박사 과정 학생입니다. EM은 3 년 FIRC-AIRC 보조금 (프로젝트 코드 : 22506)의 수혜자입니다. TB 그룹의 R- 메틸 단백질체에 대한 글로벌 분석은 AIRC IG 보조금 (프로젝트 코드 : 21834)에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
중탄산 암모늄 (AMBIC)시그마 - 알드리치09830
과황산 암모늄 (APS)시그마 - 알드리치497363
C18 Sep-Pak 컬럼 vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
콜로이드 Coomassie 염색 인스턴트시그마 - 알드리치ISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA 프리로슈 시그마 알드리치11836170001프로테아제 억제제
투석 태아 소 세럼 (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisher요청  안정 글루타민 포함 및 메티오닌 미포함
EASY-nano LC 1200 크로마토그래피 시스템ThermoFisher
EASY-Spray HPLC 컬럼ThermoFisherES907
글리세롤로시그마-알드리치G5516
HeLa 세포ATCCATCC CCL-2
HEPES시그마-알드리치H3375
요오드아세트아미드(IAA)시그마-알드리치144-48-9
목성 C12-RP 기둥페노메넥스00G-4396-E0
L-메티오닌시그마-알드리치M5308라이트(L) 메티오닌
L-메티오닌-(메틸-13C,d3)시그마-알드리치299154 헤비 (H) 메티오닌
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
마이크로팁 세포 파괴자 소닉파이어 250Branson
N,N,N′,N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS 솔벤트 B
피어스  0.1% 포름산 (v/v) in water, LC-MS 등급ThermoFisher85170LC-MS 솔벤트 A
피어스  아세토니트릴 (ACN), LC-MS 등급ThermoFisher51101
피어스  물, LC-MS 등급ThermoFisher51140
폴리아크릴아미드Sigma-Aldrich92560
정밀 플러스 단백질  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan 항체 α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan 항체 α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan 항체 α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass 분광계ThermoFisher
염기서열분석 등급 변형 트립신PromegaV5113
트리플루오로아세트산Sigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
진공 농축기 5301EppendorfSpeed vac

참고문헌

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