Method Article

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

DOI:

10.3791/62410

⸱

April 2nd, 2021

 , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

Abstract

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산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 망막병증(ROP), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR) 및 망막 정맥 폐색(RVO)을 포함한 허혈성 망막 질환에서 비정상적인 혈관 성장을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 대부분의 OIR 연구는 특정 시점에서 망막 신생 혈관을 관찰합니다. 그러나 OIR 관련 혈관 질환을 이해하는 데 필수적인 시간 경과에 따른 살아있는 마우스의 동적 혈관 성장은 연구되지 않았습니다. 여기에서는 OIR 마우스 모델의 유도를 위한 단계별 프로토콜을 설명하고, 잠재적인 위험을 강조하며, 면역형광 염색을 사용하여 혈관 소색(VO) 및 신생혈관(NV) 영역을 신속하게 정량화하는 개선된 방법을 제공합니다. 더 중요한 것은 OIR 마우스 모델에서 플루오레세인 안저 혈관조영술(FFA)을 수행하여 P15에서 P25까지의 살아있는 마우스에서 혈관 재성장을 모니터링했다는 것입니다. OIR 마우스 모델에 FFA를 적용하면 혈관 재성장 중 리모델링 과정을 관찰 할 수 있습니다.

Introduction

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새로운 병리학 혈관이 기존 망막 정맥에서 시작되는 상태로 정의되는 망막 신생 혈관 형성 (RNV)은 일반적으로 망막의 내부 표면을 따라 확장되어 유리체 (또는 일부 조건에서는 망막 하 공간)로 성장합니다 1. 이는 미숙아 망막병증(ROP), 망막 정맥 폐색(RVO) 및 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)을 포함한 많은 허혈성 망막병증의 특징이자 공통적인 특징입니다2.

수많은 임상 및 실험 관찰에 따르면 허혈이 망막 신생 혈관의 주요 원인입니다 3,4. ROP에서 신생아는 생존율을 높이기 위해 밀폐 된 인큐베이터에서 높은 수준의 산소에 노출되며, 이는 혈관 성장을 막는 중요한 동인이기도합니다. 치료가 끝나면 신생아의 망막은 상대적으로 저산소 기간을 경험합니다5. RVO에서 중앙 또는 가지 망막 정맥의 폐색에서 다른 상황이 나타나고 PDR2에서 미세 혈관 병증으로 인한 망막 모세 혈관의 손상도 관찰됩니다. 저산소증은 저산소증 유도 인자 -1α (HIF-1α) 신호 전달 경로를....

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Protocol

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마우스 사용과 관련된 모든 절차는 중국 쑨원대학교 중산 안과 센터의 동물 실험 윤리 위원회(승인 번호: 2020-082)와 중산 안과 센터의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인된 지침과 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 협회(ARVO) 성명서의 승인에 따라 승인되었습니다.

1. 마우스 OIR 모델의 유도

  1. 눈의 선천성 기형 비율이 낮은 마우스(예: C57BL/6J 마우스)를 사용하고 수컷/암컷 = 1:2의 비율로 짝짓기합니다. 같은 날 태어난 새끼를 데리고 P7에서 OIR 모델을 유도하기 시작합니다. 모델링하기 전에 마우스 강아지의 체중을 엄격하게 기록하십시오.
    참고: 생년월일은 P0으로 기록해 둡니다. 각 마우스의 무게를 정기적으로 기록하십시오. 신생아 새끼의 체중은 산소에 대한 다른 상태의 마우스의 민감도가 다르기 때문에 OIR을 유도하는 동안 매우 중요합니다. 비교 가능한 결과를 얻으려면 P5에서 7g 이상의 새끼를 제외하십시오.
  2. 온도를 23 ° C± 2 ° C로 설정하고, 습도를 40 % -65 %로 제어하고, 매일 12 시간의 빛과 12 시간의 어둠을 번갈아 가며, 둥지를 짓기 위해 새장에 면봉을 추가하고, 적절한 살균 된 음식과 물을 보장하고, 개별 환기 케이지 (IVC)에....

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Results

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OIR 마우스 모델에서 가장 중요하고 기본적인 결과는 VO 및 NV 영역의 정량화입니다. P7로부터 5일 동안 과산소 환경에서 생활한 후, 새끼의 중심 망막은 가장 큰 비관류 면적을 보였다. 또 다른 5 일 동안 저산소증의 자극 하에, 망막 신생 혈관이 점차적으로 생성되어 주변의 정상 혈관보다 더 강하게 형광을 발했습니다. P17 이후, 병리학적 신생혈관의 형광 신호는 망막의 리모델링으로서 빠르게 퇴행하였다(도 5A). 새끼의 깔짚 크기와 출생 후 체중 증가를 제어함으로써 OIR 마우스 모델의 VO 및 NV 영역은 우수한 반복성과 안정성을 보였으며 망막 신생 혈관의 피크는 P17에서 발생했으며 이는 이전 연구와 일치했습니다 (그림 5B, C).

FFA는 망막 혈관계를 연구하는 데 이상적인 도구입니다. 생체 내에서 FFA의 적용을.......

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Discussion

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OIR에 대한 마우스의 감수성은 많은 요인에 의해 영향을받습니다. 다른 유전 적 배경과 균주의 새끼는 비교할 수 없습니다. BALB/c 알비노 마우스에서 혈관은 VO 영역으로 빠르게 재성장하여 신생 혈관 술38이 크게 감소하여 연구에 약간의 어려움을 가져옵니다. C57BL/6 마우스에서, BALB/cJ 마우스 균주39,40과 비교할 때 광수용체 손상이 증가하였다. 다른 유형의 형질 전환 마우스41,42,43도 마찬가지입니다. 게다가, C57BL/6 마우스는 129S3/SvIM 마우스(44)와 비교할 때 더 낮은 수준의 혈관신생을 나타낸다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기술 지원에 대해 우리 실험실과 중산 안과 센터의 안과 동물 실험실의 모든 구성원에게 감사드립니다. 또한 실험적 지원에 대해 Chunqiao Liu 교수에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC : 81670872; 중국 베이징), 중국 광둥성 자연과학재단(보조금 No.2019A1515011347), 중산 안과 센터 국가 안과학연구소의 고위급 병원 건설 프로젝트(보조금 No. 303020103; 광저우, 광동성, 중국).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL 멸균 주사기SolarbioYA0550망막 플랫 마운트 및 복강 내 주사 준비를 위해
1× 인산염 완충 식염수(PBS)Transgen Biotech  FG701-01막 플랫 마운트 준비용
2ml 마이크로 원심분리기 튜브CorningMCT-200-C망막 플랫 마운트 준비용
48 웰 투명 TC 처리 다중 웰 플레이트Corning3548망막 플랫 마운트 준비용
접착 현미경 슬라이드다양한망막 플랫 마운트 준비용
Adobe Photoshop CC 2019어도비 주식회사이미지 분석용
이산화탄소 가스다양한희생용
커버 슬라이드다양한망막 플랫 마운트 준비용
곡선형 집게World Precision Instruments14127망막 플랫 마운트 준비용
DAPI 염색 용액Abcamab228549망막 플랫 마운트의 핵 라벨링용
해부 현미경OlmpusSZ61망막 플랫 마운트 준비용
Fluorescein sodiumSigma-AldrichF6377in vivo 이미징
형광 현미경  ZeissAxioImager.Z2망막 플랫 마운트의 형광 이미지 획득용
Fluoromount-G 마운팅 미디어SouthernBiotech  0100-01막 플랫 마운트 준비
용 하이드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스Maya89161in vivo< / em> 이미징
용 Isolectin B4 594 항체InvitrogenI21413막 플랫 마운트의 망막 혈관 구조 라벨링 용
마우스 C57 / BL6JGemPharmatechOIR 모델 유도
가위-직선 블레이드World Precision Instruments503242망막 플랫 마운트
No.4 직선 펜치준비를 위한 World Precision Instruments  501978-6망막 플랫 마운트 준비
Normal 당나귀 혈청Abcamab7475망막 플랫 마운트 준비
O2 센서다양O2
OxyCyclerBiospherixA84XOVOIR 모델 유도
파라포름알데히드(PFA)SigmaP6148-1KG조직 고정용
펜토바르비탈 나트륨다양마취용
소다 라임다양한산소실에서 과도한 CO2 흡수용
SPECTRALIS HRA+OCT하이델베르크HC00500002 <em>in vivo 이미징
SPSS Statistics 22.0IBM통계 분석용
Tansference decloring shakerKylin-BellZD-2008망막 플랫 마운트 준비용
조직 배양 접시 (낮은 첨부)Corning3261-20EA레티날 플랫 마운트 준비용
트랜스퍼 피펫다양한망막 플랫 마운트 준비용
Triton X-100Sigma-Aldrich  SLBW6818망막 플랫 마운트 준비용
Tropicamide다양한in vivo 이미징
ZEN 이미징 소프트웨어ZEISS이미지 획득 및 내보내기용
망용 망 망장쑤성마이크로 해부 용 용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (20....

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