합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
슈도모나스 아에루기노사(Pa)는 낭포성 섬유증(CF)과 관련된 가장 흔한 기회성 병원균 중 하나입니다. 일단 Pa 식민지가 확립되면, 감염박테리아의 큰 비율은 기도 가래 내의 생물막을 형성합니다. CF 가래로부터 분리된 Pa 생물막은 공간적으로 조직되고 항균 내성과 같은 임상적으로 관련된 표현형을 나타내는 ~ 10-1,000개의 세포의 작고 조밀한 응집체에서 성장하는 것으로 나타났습니다. Pa aggregates가 변화하는 가래 환경에 어떻게 반응하는지 연구하는 가장 큰 과제 중 하나는 집계 형성을 촉진하는 영양적으로 관련성이 있고 견고한 시스템이 부족하다는 것입니다. 합성 CF 가래 매체(SCFM2)를 사용하여 Pa 골재의 수명 기록은 단일 셀의 해상도에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM) 및 이미지 분석을 사용하여 관찰될 수 있다. 이 체외 계통은 실시간으로, 3 차원, 그리고 미크론 규모에 다양한 크기의 집계의 수천의 관찰을 할 수 있습니다. 개인 및 인구 수준에서, 표현형 및 위치에 의해 골재를 그룹화하는 능력을 갖는 것은 다른 발달 단계에서 골재의 관찰과 항생제 치료와 같은 미세 환경의 변화에 대한 반응을 정밀하게 분화할 수 있도록 용이하게 한다.
서론
슈도모나스 아에루기노사(Pa)는 면역이 손상된 개인에 있는 만성 감염을 설치하는 기회성 병원체입니다. 유전 질환 낭포성 섬유증 (CF)을 가진 사람들을 위해, 이 감염은 일생의 과정을 걸이 수 있습니다. CF는 시간이 지남에 따라 다양한 미생물 병원균에 의해 식민지화되는 기도에 점성영양이 풍부한 가래의 축적을 유발합니다. Pa는 가장 널리 퍼진 CF 병원체 중 하나이며, 어린 시절에 기도를 식민지화하고 치료하기 어려운 감염1을확립합니다. Pa는 중요한 임상 문제로 남아 있으며 최근2,3에서개선 된 치료 요법에도 불구하고 CF를 가진 사람들의 사망의 주요 원인으로 간주됩니다. 이러한 지속성 표현형과 항생제 내성이 증가하는 Pa는 새로운 치료 전략인 ESKAPE 병원균4의개발을 위한 연구 우선 순위로서 질병통제센터(CDC)와 세계보건기구(WHO)에 의해 확인된 병원균 군에서 Pa를 한 자리에 얻었다.
다른 ESKAPE 병원체와 마찬가지로, 취득한 항생제 내성은 Pa에서일반적이지만....
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프로토콜
1. 합성 낭포성 섬유증 물질 준비 (SCFM2)
참고: SCFM2의 준비는 아래에 설명된 세 가지 주요 단계로구성됩니다(그림 2). 자세한 내용 및 참조는9,10,12를참조하십시오.
그림 2: SCFM2 매체의 준비 및 접종. (A)완충염염은 표 1과 표 2에나열된 염과 아미노산을 사용하여 제조된다. 완충 된 베이스는 최대 30 일 동안 4 °C에 저장할 수 있지만 빛 노출로부터 보호해야합니다. (B)Mu....
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결과
이 작품은 CF 폐9,10,12의만성 감염과 유사한 환경에서 고해상도 및 환경에서 Pa 골재를 관찰하는 방법을 자세히설명합니다. SCFM2는 실제감염(10)동안 관찰된 것과 유사한 크기로 Pa 세포의 자연적인 응집을 촉진하는 체외 시스템을 제공한다. 정의된 매체로 SCFM2의 적응성은 많은 연구 도로에 접근하는 데 활용할 수 있습니다. 이 작업의 목표는 향후 연구, 협업 및 응용 프로그램에 대한 사용을 장려하기 위한 목적으로 현미경 검사법과 FACS의 조합을 포함하는 워크플로우를 강조하는 것입니다.
CLSM의 사용은 세균성 인구 개발의 역학을 연구하는 데 사용할 수있는 시간적, 고해상도 이미징을 허용합니다. 이 작품은
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토론
이 작품은 항생제 치료의 존재와 부재에서 세균 성 집계 인구를 연구하기 위해 결합 될 수있는 방법론을 도입했다. 고해상도 CLSM은 항생제에 노출될 때 골재의 변화와 실시간으로 응집물의 구조적 방향을 시각화할 수 있게 합니다. 또한, 항생제로 치료 한 후 남아있는 바이오매스의 물리적 및 구조적 특징은 RNA-seq를 활용한 미래 유전자 발현 연구와 이러한 관찰을 상호 연관시키는 것을 목표로 정량화 될 수 있습니다. GFP 표현 세포의 사용은 항생제 내성 세포의 집단적 및 개별 적인 행동의 시각화를 허용하는 동안, 그것은 전체 적인 그림의 일부만 제공합니다. 많은 항생제 치료를 살아남지 못한 세포의 공간 포지셔닝에서 배울 수 있습니다.
시간 경과 현미경 검사법은 많은 양의 데이터를 생성합니다. SCFM2에서 Pa 골재의 관측을 위한 18-h 실험은 시간이 지남에 따라 ~50,000개의 골재를 식별하며, 이는 볼륨 및 공간 포지셔닝을 특징으로 할 가능성이 있습니다. .......
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공개 사항
저자는 이해상충이 없습니다.
감사의 글
S.E.D는 분자 의학과, 사우스 플로리다 대학, N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, 첸) 및 미생물군유전체에 대한 USF 연구소에서 제공하는 창업 기금에 의해 지원됩니다. 이 원고와 관련된 데이터 세트와 관련된 지속적인 협업에 대해 Whiteley 연구소에 감사드립니다. FACS 분류를 촉진해 주신 찰스 세케레스 박사에게 감사드립니다. 수치는 Biorender.com 사용하여 A.D.G와 S.E.D에 의해 만들어졌습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알라닌 | Acros 유기물 | 56-41-7 | |
| 아르기닌 HCl | MP | 1119-34-2 | |
| 아스파라긴 | Acros 유기물 | 56-84-8 | 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| 글루탐산 HCl | Acros 유기물 | 138-15-8 | |
| 글리신 | 아크로스 오가닉스 | 56-40-6 | |
| 히스티딘 HCl H2O | 알파 아자르 | A17627 | |
| 이소류신 | 아크로스 오가닉스 | 73-32-5 | |
| 류신 | 알파 아사르 A12311 | ||
| 라이신 HCl | 알파 아이사르 | J62099 | |
| 메티오닌 | 아크로스 오가닉스 | 63-68-3 | |
| 오르니틴 HCl | 알파 아 | A12111 | |
| 페닐알라닌 | 아크로스 유기물 | 63-91-2 | |
| 프롤린 | 알파 아 | A10199 | |
| 세린 | 알파 아사르 | A11179 | |
| 트레오닌 | 아크로스 유기물 | 72-19-5 | |
| 트립토판 | 아크로스 유기물 | 73-22-3 | 0.2m에서 준비 |
| 티로신 | Alfa Aesar | A11141 | 1.0 m NaOH |
| 발린 | Acros 유기물 | 72-18-4 | |
| 항생제 | |||
| 카르베니실린 | Alfa Aesar | J6194903 | |
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| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| 포도당 (D-포도당) | 피셔 화학 | 50-99-7 | |
| 1,2- 디올레올 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DOPC) | 피셔 (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | 37 °C에서 15-20 분 쉐이크; C 클로로포름 |
| sub>4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | 이 재고는 1 mg/mL와 동일하며, |
| NaOH MgCl | |||
| 2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| 준비된 고형물 | |||
| 돼지 점액 | 시그마 | M1778-100G | UV 살균 |
| 연어 정액 DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
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| Propidium 요오드화물 | Alfa Aesar | J66764MC | |
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| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | 완충 염기에 직접 고체 추가 |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | 완충 염기에 직접 고체 추가 |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | 고체 추가 완충 염기에 직접 |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | 완충된 염기에 고체를 직접 추가합니다 |
| . | |||
| 소모품원뿔형 튜브(15mL) | 올림푸스 플라스틱 | 28-101 | |
| 원뿔형 튜브(50mL) | 올림푸스 플라스틱 | 28-106 | |
| 배양 튜브(공기 흐름 캡 포함 | ) 올림푸스 플라스틱 | 21-129 | |
| 35mm 4챔버 유리 바닥 접시 | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani(LB) 육수 | Genessee Scientific | 11-118 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| 혈청학적 피펫(5mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| 혈청학적 피펫(25mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| 혈청학적 피펫(50mL) | Olympus 플라스틱 | 12-107 | |
| 초순수(RNase/DNase 없음); 나노순수 | Genessee Scientific | 18-194 | 용액 준비에 사용되는 나노 순수표 1 |
| 주사기(10 mL) | BD | 794412 | |
| 주사기(50mL) | BD | 309653 | |
| 0.22mm PES 주사기 필터 | Olympus 플라스틱 | 25-244 | |
| PS 큐벳 세미 미코 | 올림푸스 플라스틱 | 91-408 | |
| 소프트웨어 | |||
| Biorender | 그림을 준비하려면 | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | 버전 9.6 | |
| Zen Black | |||
| 장비 | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Zeiss |
참고문헌
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data....
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