질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조

요약

우리는 질산염과 아질산염의 수준을 측정하고 비교하기 위해 쥐 골격근 조직의 4 가지 근육 그룹의 균질화를위한 세 가지 다른 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 또한 조직 샘플 크기가 균질화 결과에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 다양한 샘플 가중치를 비교합니다.

초록

질산염 이온 (NO₃^-)은 한때 산화 질소 (NO) 대사의 불활성 최종 생성물로 생각되었습니다. 그러나 이전의 연구는 질산염 이온이 2 단계 환원 메커니즘을 통해 포유류에서 NO로 다시 전환 될 수 있음을 입증했다 : 질산염은 주로 경구 공생 박테리아에 의해 아질산염 (NO₂^-)으로 환원되고, 아질산염은 헴 또는 몰리브덴 함유 단백질을 포함한 여러 메커니즘에 의해 NO로 환원된다. 이 환원성 질산염 경로는 특히 심혈관계 및 근육 운동 중에 NO 매개 신호 전달 경로를 향상시키는 데 기여합니다. 이러한 활용 전에 신체의 질산염 수준은 주로 식물에서 내인성 NO 산화 및식이 질산염 섭취의 두 가지 다른 원인에 의해 결정됩니다. 생리적 환경에서 복잡한 NO 순환을 설명하기 위해 우리는 NO에 비해 상대적으로 안정적인 대사 산물, 질산염 및 아질산염 이온의 역학을 추가로 조사했습니다. 이전 연구에서 골격근은 포유류에서 질산염 이온의 주요 저장 기관이자 운동 중 NO의 직접적인 공급원으로 확인되었습니다. 따라서 골격근에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 방법론을 수립하는 것이 중요하며 다른 조직 샘플로 적용을 확장하는 데 도움이 되어야 합니다. 이 논문은 질산염 및 아질산염 측정을 위해 세 가지 다른 균질화 방법을 사용하여 골격근 샘플의 준비를 자세히 설명하고 샘플의 크기를 포함하여 균질화 과정과 관련된 중요한 문제에 대해 논의합니다. 질산염과 아질산염 농도는 또한 4 개의 다른 근육 그룹에서 비교되었습니다.

서론

작은 기체 신호 분자인 산화질소(NO)는 생리학적 및 병리생리^{학적 과정에서 중요한} 역할을 합니다1. NO는 질산염 (NO 3-) 및 아마도 혈액 및 조직에서 아질산염 (NO₂^-)으로 빠르게 산화되기 전에 산화 질소 합성 효소 (NOS) 계열의 내인성 효소에 의해 L^- 아르기닌으로부터 생성 될 수있다 ^2,3. 최근에, 이들 음이온은 포유류 시스템⁴에서 NO로 다시 환원되는 것으로 나타났다. 질산염은 주로 타액선에서 분비되고 직접 섭취되는 이온에 작용하는 구강 내 공생 박테리아 질산염 환원 효소 ⁵에 의해 아질산염으로 전환되며, 어느 정도는 크 산틴 산화 환원 효소 ^6,7과 같은 포유류 효소에 의해 전환됩니다. 아질산염은 데옥시헤모글로빈⁸, 데옥시미오글로빈⁹, 몰리브덴 함유 효소(10) 및 양성자의 ....

프로토콜

동물 프로토콜은 NIDDK 동물 관리 및 사용 위원회(ASP K049-MMB-20)에 의해 승인되었다. 동물은 AAALAC 웹사이트에서 무료로 제공되는 현재 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 취급 및 처리되었습니다.

1. 쥐 골격근 수집

1. 쥐가 깊은 마취 (5 % 이소 플루 란, 꼬리 / 다리 꼬집음에 반응이없는 것으로 확인)에있는 동안 19G 바늘을 좌심실의 정점에 놓고 우심방에 흠집을 만들어 헤파린이 함유 된 식염수로 관류를 시작하십시오. 적어도 1.5 리터 / kg이 조직을 통해 흐를 때까지 헤파린이 함유 된 식염수가 내부 장기를 통해 관류되도록하십시오. 이 시점에서 동물은 방혈로 사망하고 시체는 샘플 수집을 위해 처리 할 준비가됩니다.
   알림: 아질산염은 남아 있는 헤모글로빈에 의해 질산염으로 산화되기 때문에 특히 아질산염의 정확한 측정을 위해서는 우수한 관류를 달성하는 것이 중요합니다.
2. 표적 근육 조직을 확인하고 깨끗한 수술 도구를 사용하여 뒷다리⁽²² )로부터 이들을 절제한다. 근육 조직에서 가능한 한 많은 지방과 결합 조직을 제거하십시오.
3. 원하는 양의 근육을 미세 원심 분리기 튜브에 넣은 다음 드라이 아이스에 놓습니다. 티슈....

결과

대표적인 결과를 얻기 위해, 8마리의 Wistar 쥐(수컷 및 암컷, 체중 250 ± 50g)로부터의 골격근 조직을 사용하였다. 래트 골격근 균질물(각 방법에 대해 대둔근 50mg)을 3개의 상이한 균질화 도구(회전 균질화기, 비드 균질화기 및 분쇄기)에 의해 제조하였다. 그런 다음 이러한 균질액의 질산염 및 아질산염 함량을 산화질소 분석기(NOA)를 사용하여 측정했습니다(그림 4). 이 세 가지 균질액 샘플의 질산염 수준(그림 4A)은 39.6에서 45.2nmol/g 범위로 서로 매우 유사했습니다.

흥미롭게도 분쇄기로 제조 한 균질 액 샘플의 아질산염 수준 (그림 4B)이 가장 높은 값 (0.99 ± 0.15 nmol / g)을 보였으며 이는 다른 두 샘플 값과 통계적으로 달랐습니다. 조직의 크기가 균질화 효율과 생성된.......

토론

생리적 개입의 기능으로 NO 대사 산물, 질산염 및 아질산염의 변화를 모니터링하려면 신진 대사에 중요한 여러 기관에서 이러한 이온의 수준을 측정하는 것이 필수적입니다. 혈액 내의 헤모글로빈은 NO 및 그 대사 산물과 반응하므로 가능한 한 조직 샘플에서 혈액을 신속하게 제거하는 것도 중요합니다. 따라서 골격근 조직 (대둔근, TA, EDL, 비복근)을 수집하기 전에 동물을 식염수로 관류시키고 표적 근육 주변의 결합 조직과 지방을 즉시 제거했습니다. 균질화 용액의 경우, '정지 용액'을 페리시안화물, NEM 및 비이온성 계면활성제로 특별히 제조하여 다양한 조직에서 아질산염을 보존하였다(¹⁹). 비이온성 세제의 존재는 세포막의 완전한 파괴에 중요합니다. 이 연구에 사용된 두 개의 균질화 기계인 회전식 균질화기와 비드 균질화기의 경우, 균질화에 필요한 정지 용액의 부피는 조직 중량의 5배로 전체 조직이 용액에 완전히 잠기고 균질하게 처리되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M 튜브	Miltenyi Biotec	130-093-236	길이 : 87 mm; 직경 : 30 mm
헤파린 나트륨	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
메탄올	시그마	646377
Minilys 비드 균질화 기	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N- 에틸 말레 이미드	시그마	4260
산화 질소 분석기	GE	Sievers NOA 280i
NP-40;4- 노닐 페닐 폴리에틸렌 글리콜	시그마	74385
칼륨 페리시아나이드; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	에는 균질화를 위한 2.8mm 세라믹(산화 지르코늄) 비드가 있는 2mL 튜브가 포함되어 있습니다
기 키트	, Cellcrusher	, Cellcrusher 키트

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