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방법 논문

미르머신: 식물 miRNA 주석을 위한 원스톱 상점

2.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62430

⸱

2021년 5월 1일

 ,  , 
1U.S. Department of Agriculture - Agricultural Research Service, Western Regional Research Center, Crop Improvement and Genetics Research Unit, CA, USA, 2Montana BioAgriculture Inc., Missoula, MT, USA

이 논문에서

요약

여기에서는 1) 알려진 miRNA와 새로운 miRNA를 보다 정확하게 식별할 수 있고 2) 완전히 자동화되어 자유롭게 사용할 수 있는 새롭고 완전히 자동화된 miRNA 파이프라인인 mirMachine을 제시합니다. 이제 사용자는 간단한 제출 스크립트를 실행하여 완전히 자동화된 mirMachine 파이프라인을 실행할 수 있습니다.

초록

다양한 유형의 비암호화 RNA 중에서 마이크로RNA(miRNA)는 틀림없이 지난 10년 동안 주목을 받아 왔습니다. 유전자 발현의 전사 후 조절자로서 miRNA는 가뭄 및 질병과 같은 생물학적 스트레스에 대한 발달 및 반응을 포함하여 다양한 세포 경로에서 중요한 역할을 합니다. 고품질 참조 게놈 서열을 보유하면 miRNA 서열이 고도로 보존되는 여러 식물 종에서 miRNA를 식별하고 주석을 달 수 있습니다. 전산 miRNA 식별 및 주석 프로세스는 대부분 오류가 발생하기 쉬운 프로세스이므로 상동성 기반 예측은 예측 정확도를 높입니다. 우리는 지난 10년 동안 miRNA 주석 파이프라인인 SUmir를 개발하고 개선했으며, 그 이후로 여러 식물 게놈에 사용되었습니다.

본 연구는 (i) 2차 구조 예측에 대한 추가 필터링 단계를 추가하고, (ii) 완전 자동화하고, (iii) 이전 파이프라인을 사용하여 작은 RNA 시퀀싱 판독을 기반으로 하는 상동성 또는 새로운 miRNA를 기반으로 알려진 miRNA를 예측하는 새로운 옵션을 도입함으로써 완전 자동화된 새로운 miRNA 파이프라인인 mirMachine (miRNA Machine)을 제시합니다. 새로운 miRNA 파이프라인인 mirMachine은 애기장대 정보 리소스, TAIR10, 애기장대 게놈 방출 및 국제 밀 게놈 시퀀싱 컨소시엄(IWGSC) 밀 참조 게놈 v2를 사용하여 테스트되었습니다.

서론

차세대 염기서열분석 기술의 발전으로 RNA 구조와 조절 요소에 대한 이해가 넓어졌으며 기능적으로 중요한 비코딩 RNA(ncRNA)가 밝혀졌습니다. 다양한 유형의 ncRNA 중에서 마이크로 RNA (miRNA)는 식물 1,2에서 길이가 19에서 24 뉴클레오티드 사이 인 작은 RNA의 기본 조절 클래스를 구성합니다. 선충류에서 최초의 miRNA가 발견 된 이후 Caenorhabditis elegans3, miRNA의 존재와 기능은 동물 및 식물 게놈에서도 광범위하게 연구되었습니다 4,5,6. miRNA는 절단 또는 번역 억제를 위해 mRNA를 표적으로 하여 기능합니다7. 축적된 증거는 또한 miRNA가 성장 및 발달8, 자가 생물 발생9 및 여러 생물학적 및 비생물적 스트레스 반응10을 포함하여 식물의 광범위한 생물학적 과정에 관여한다는 것을 보여주었습니다.

식물에서 miRNA는 처음에 pri-miRNA11이라고 하는 긴 1차 전사체에서 처리됩니다. 핵 내부의 RNA 중합효소 II에 의해 생성된 이들 pri-miRNA는 불완전한 폴드백 구조(12)를 형성하는 긴 전사체이다. pri-miRNA는 나중에 pre-miRNA11이라고 하는 miRNA의 내인성 단일 가닥(ss) 헤어핀 전구체를 생성하기 위해 절단 과정을 거칩니다. pre-miRNA는 단일 가닥이 이중 가닥 구조로 접혀 miRNA 듀플렉스(miRNA/miRNA*)13를 절제하는 헤어핀 유사 구조를 형성합니다. 다이서 유사 단백질은 miRNA/miRNA* 듀플렉스의 두 가닥을 절단하여 2-뉴클레오티드 3'-오버행14,15를 남깁니다. miRNA 듀플렉스는 핵 내부에서 메틸화되어 miRNA의 3'-말단을 분해 및 우리딜화 활성으로부터 보호합니다16,17. 헬리카제는 수출 후 메틸화된 miRNA 이중체를 풀고 성숙한 miRNA를 세포질18의 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)에 노출시킵니다. 듀플렉스의 한 가닥은 RISC에 통합된 성숙한 miRNA인 반면 다른 가닥인 miRNA*는 분해됩니다. miRNA-RISC 복합체는 표적 서열에 결합하여 완전 상보성의 경우 mRNA 분해 또는 부분 상보성의 경우 번역 억제를 유도한다13.

발현 및 생물발생 특징에 기초하여, miRNA 주석에 대한 가이드라인이15,19에 기재되었다. 정의된 가이드라인에 따라 Lucas와 Budak은 식물9에서 상동성 기반 인실리코 miRNA 식별을 수행하기 위해 SUmir 파이프라인을 개발했습니다. SUmir 파이프라인은 SUmirFind 및 SUmirFold라는 두 개의 스크립트로 구성되었습니다. SUmirFind는 2개 이하의 불일치가 있는 히트를 포함하고 더 짧은 히트(blastn-short-unapped -penalty -1 -reward 1)에 대한 편향을 피하기 위해 수정된 매개변수를 사용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST) 스크리닝을 통해 알려진 miRNA 데이터 세트에 대해 유사성 검색을 수행합니다. SUmirFold는 UNAfold21을 사용하여 BLAST20 결과로부터 추정되는 miRNA 서열의 2차 구조를 평가합니다. SUmirFold는 헤어핀 구조의 특성을 식별하여 miRNA를 작은 간섭 RNA와 구별합니다. 또한, 매개 변수, 최소 배 에너지 지수 > 0.67 및 GC 함량 24-71 %에 의해 miRNA를 tRNA 및 rRNA와 같은 다른 ssRNA와 구별합니다. 이 파이프라인은 (i) 민감도 증가, (ii) 주석 정확도 증가, 및 (iii) 예측된 miRNA 유전자(22)의 게놈 분포를 제공하기 위한 2개의 추가 단계를 추가함으로써 최근에 업데이트되었다. 식물 miRNA 서열23의 높은 보존성을 감안할 때, 이 파이프라인은 원래 상동성 기반 miRNA 예측을 위해 설계되었습니다. 그러나 새로운 miRNA는 밀접하게 관련된 종 간의 miRNA의 서열 보존에 크게 의존했기 때문에 이 생물정보학 분석으로 정확하게 식별할 수 없었습니다.

이 논문은 1) 알려진 miRNA와 새로운 miRNA를 보다 정확하게 식별할 수 있고(예를 들어, 파이프라인은 이제 sRNA-seq 기반 새로운 miRNA 예측 및 상동성 기반 miRNA 식별을 사용함) 2) 완전히 자동화되고 자유롭게 사용할 수 있는 새롭고 완전히 자동화된 miRNA 파이프라인인 mirMachine을 제시합니다. 출력에는 예측된 miRNA의 게놈 분포도 포함되었습니다. mirMachine은 밀 및 애기장대 게놈에서 상동성 기반 및 sRNA-seq 기반 예측 모두에 대해 테스트되었습니다. 처음에는 자유 소프트웨어로 출시되었지만 UNAfold는 지난 10년 동안 상용 소프트웨어가 되었습니다. 이 업그레이드를 통해 2차 구조 예측 도구가 UNAfold에서 RNAfold로 전환되어 mirMachine을 자유롭게 사용할 수 있습니다. 이제 사용자는 간단한 제출 스크립트를 실행하여 완전히 자동화된 mirMachine 파이프라인을 실행할 수 있습니다(예제는 https://github.com/hbusra/mirMachine.git 에서 제공됨).

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프로토콜

1. 소프트웨어 종속성 및 설치

  1. 홈 사이트에서 또는 conda를 사용하여 소프트웨어 종속성을 설치합니다.
    1. Perl이 아직 설치되지 않은 경우 홈 사이트(https://www.perl.org/get.html)에서 다운로드하여 설치합니다.
      참고: 표시된 결과는 Perl v5.32.0을 사용하여 예측되었습니다.
    2. 정렬 프로그램인 Blast+를 홈 사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/)에서 실행 파일 및 소스 코드로 다운로드합니다.
      참고: 표시된 결과는 BLAST 2.6.0+를 사용하여 예측되었습니다.
    3. https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/ 에서 RNAfold의 미리 컴파일 된 패키지를 설치하십시오.
    4. 또는 다음 conda를 사용하여 이러한 소프트웨어를 설치하십시오: i) conda install -c bioconda blast; ii) conda install -c bioconda viennarna.

2. 미르머신 설정 및 테스트

  1. https://github.com/hbusra/mirMachine.git GitHub에서 최신 버전의 mirMachine 스크립트 및 mirMachine 제출 스크립트를 다운로드한 다음 스크립트 경로를 PATH로 설정합니다.
  2. GitHub에 제공된 테스트 데이터를 사용하여 mirMachine과 모든 종속성이 올바르게 다운로드되었는지 확인합니다.
  3. 아래 표시된 테스트 데이터에서 mirMachine을 실행합니다.
    bash mirMachine_submit.sh -f iwgsc_v2_chr5A.fasta -i mature_high_conf_v22_1.fa.filtered.fasta -n 10
    참고: 테스트 데이터에 밀 게놈의 염색체가 하나만 포함되어 있으므로 -n 옵션을 10으로 설정합니다. 기본적으로 -n 옵션은 20으로 설정됩니다.
  4. 예측된 성숙한 miRNA, 예측된 전구체 및 염색체에서의 위치에 대한 hairpins.tbl.out.tbl 출력 파일을 제어합니다.
  5. 로그 파일에서 프로그램 출력 및 경고를 확인합니다.

3. 상동성 기반 miRNA 동정

  1. 아래 표시된 bash 스크립트를 사용하여 mirMachine을 실행합니다.
    bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -m $mismatches -n $number_of_hits
  2. 예측된 miRNA를 확인합니다. 예측된 miRNA에 대해 $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl이라는 출력 파일을 찾습니다. pre-miRNA FASTA 서열에 대해 $input_file.results.tbl.hairpins.fsa라는 출력 파일을 찾습니다. 헤어핀 로그 파일에 대해 $input_file.results.tbl.hairpins.log 라는 출력 파일을 찾습니다.

4. 새로운 miRNA 식별

  1. sRNA-seq FASTQ 파일을 적절한 FASTA 형식으로 전처리합니다. 필요한 경우 어댑터를 다듬습니다. 품질이 낮은 읽기를 다듬지 마십시오. 대신 제거하십시오. N이 포함된 읽기를 제거합니다. FASTQ 파일을 FASTA 파일($input_파일)로 변환합니다.
  2. 아래 표시된 bash 스크립트를 사용하여 mirMachine을 실행합니다.
    bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -n $number_of_hits -sRNAseq -lmax $lmax -lmin $lmin -rpm $rpm
    참고: $mismatches 은 sRNA-seq 기반 예측을 위해 0으로 설정되었습니다.
  3. 예측된 miRNA를 확인합니다. 예측된 miRNA에 대해 $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl이라는 출력 파일을 찾습니다. pre-miRNA FASTA 서열에 대한 $input_file.results.tbl.hairpins.fsa라는 출력 파일을 찾습니다. 헤어핀 로그 파일에 대해 $input_file.results.tbl.hairpins.log 라는 출력 파일을 찾습니다.

5. 고급 매개 변수

참고: 기본값은 게놈 파일과 입력 miRNA 파일을 제외한 모든 매개변수에 대해 정의됩니다.

  1. -db 옵션을 blast 데이터베이스로 설정하여 파이프라인 내에서 빌드 참조 데이터베이스를 건너뜁니다.
  2. -m 옵션을 허용되는 불일치 수로 설정합니다.
    참고: 디폴트로, - m 옵션은 상동성 기반 예측의 경우 1로 설정되고 sRNA-seq 기반 예측의 경우 0으로 설정되었습니다.
  3. -n을 정렬 후 제거할 적중 횟수로 설정합니다(기본값은 20). 종에 따라 변경하십시오.
  4. -long을 사용하여 의심 목록에 대한 보조 구조를 평가합니다.
  5. -s를 사용하여 sRNA-seq 데이터를 기반으로 한 새로운 miRNA 예측을 활성화합니다.
  6. -lmax 옵션을 스크리닝에 포함할 sRNA-seq 판독의 최대 길이로 설정합니다.
  7. -lmax 옵션을 스크리닝에 포함할 sRNA-seq 판독의 최소 길이로 설정합니다.
  8. -rpm 옵션을 사용하여 백만개당 읽기 수(RPM) 임계값을 설정합니다.
    참고: pri-miRNA/pre-miRNA의 길이와 같은 고급 매개변수의 경우 숙련된 사용자는 관심 연구를 위해 스크립트를 수정하는 것이 좋습니다. 또한 사용자가 일부 단계를 건너뛰거나 수정된 출력을 사용하려는 경우 줄 시작 부분에 # 을 추가하여 해당 줄을 건너뛰어 제출 스크립트를 수정할 수 있습니다.

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결과

상술한 miRNA 파이프라인인 mirMachine을 파이프라인의 성능을 빠르게 평가하기 위한 테스트 데이터에 적용하였다. miRBase v22.1에 침착된 신뢰도가 높은 식물 miRNA만이 IWGSC 밀 RefSeq 게놈 v224의 염색체 5A에 대해 스크리닝되었습니다. mirMachine_find 최대 1개의 불일치가 허용되는 189개의 고신뢰도 miRNA의 비중복 목록에 대해 312개의 히트를 반환했습니다(표 1). mirMachine_fold 2차 구조 평가에 따라 이들 중 49개를 추정 miRNA로 분류했습니다. 가장 많이 대표되는 miRNA 그룹은 miR9666이었으며 총 18개의 miRNA가 확인되었습니다(그림 1). 일부 miRNA는 동일한 성숙 miRNA를 공유하지만 다른 pre-miRNA 서열에서 처리되었습니다. 이러한 miRNA는 miRNA 패밀리 이름 뒤에 고유 번호(예: miR156...

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토론

당사의 miRNA 파이프라인인 SUmir는 지난 10년 동안 많은 식물 miRNA의 식별에 사용되었습니다. 여기에서 우리는 완전히 자동화되고 자유롭게 사용할 수 있는 새로운 miRNA 식별 및 주석 파이프라인인 mirMachine을 개발했습니다. 더욱이, 이전 파이프라인을 포함하되 이에 제한되지 않는 다수의 miRNA 식별 파이프라인은 UNAfold 소프트웨어(21)에 의존했는데, 이는 한때 자유롭게 이용가능했음에도 불구하고 시간이 지남에 따라 상용 소프트웨어가 되었다. 이 새롭고 완전히 자동화된 미르머신은 더 이상 UNAfold에 의존하지 않습니다. 대신에, 비엔나RNA 패키지(27 )로부터 자유롭게 이용가능한 RNAfold가 2차 구조 예측을 위해 사용된다. 또한 mirMachine의 모든 스크립트는 조정 가능한 매개 변수가있는 bash 스크립트로 수집되어 mirMachine을 완전히 자동화되고 자유롭게 사용할 수있는 miRNA 예측 및 주...

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/Blast+
https://github.com/hbusra/mirMachine.gitmirMachine 제출 스크립트
https://www.perl.org/get.htmlPerl
https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/RNAfold
Arabidopsis TAIR10
Triticum aestivum (밀, IWGSC RefSeq v2)

참고문헌

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