Method Article

전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 마우스의 기도에서 아스퍼질러스 퓨미가투스 코니디아 (크기 3 μm)의 분포의 정량적 분석을위한 방법을 설명합니다. 또한 이 방법은 다양한 병리학적 상태 모델에서 기도내의 미세입자 및 나노입자 응집 분포의 분석에 사용될 수 있다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아스퍼 질러스 fumigatus 코니디아는 인간의 기도를 관통 할 수있는 공중 병원체입니다. 알레르기가없는 면역 능력이있는 사람들은 저항력과 면역 학적 내성을 나타내며 면역 손상 환자에서는 conidia가 기도를 식민지화하고 심각한 침습적 호흡기 질환을 일으킬 수 있습니다. 다른 기도 구획에 있는 각종 세포는 곰팡이 침략을 방지하는 면역 반응에서 관련시킵니다; 그러나 병원체 제거의 현세안-측두형 측면은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 광학적으로 클리어된 전산 기관, 특히 실험용 마우스의 폐의 3차원(3D) 이미징은 감염 후 다른 시점에서 기도에 형광으로 표지된 병원균의 검출을 허용합니다. 본 연구에서는, 우리는 기도에서 A. fumigatus conidia 분포의 정량적 분석을 수행하기 위한 실험 적인 설정을 기술합니다. 형광 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)를 사용하여, 우리는 기관지 가지에 형광 표지 코니디아의 위치를 추적하고 폐포 구획 6 마우스에 구비 후 시간. 여기서 설명된 접근법은 면역 반응의 상이한 단계에서 병원균 상호 작용 세포의 정확한 병원체 위치 및 식별의 검출을 위해 이전에 사용되었습니다. 실험 설정은 다른 병리학 적 조건에서 병원체 제거의 운동학을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

매일, 사람들은 호흡기1을관통할 수 있는 기회성 곰팡이 아스퍼질러스 훈가투스(A.fumigatus conidia)의 포자를 포함하여 공중 병원균을 흡입한다. 포유동물의 호흡기는 기도벽2,3,4의상이한 구조를 특징으로 하는 다양한 세대의 기도 시스템이다. 기관막 벽은 점액 통관5를제공하는 섬모 세포인 여러 세포 유형으로 구성된다. 폐포에서는, 점액 통관6에의해 제거될 수 없고 관통폐포 공간 병원체가 없는 ciliated 세포 및 관통폐공간 병원체가 없습니다. 더욱이, 각 기도 생성은 다중 면역 세포 인구를 위한 틈새 시장이고 이 인구의 하위 집합은 특정 기도 구획을 위해 유일합니다. 따라서, 폐포 대식세포는 폐포 구획에 상주하며, 기관및 전도기도는 모두 상피 수지상 세포7,8로줄지어 있다.

A. fumigatu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 실험실 동물에 관한 모든 방법은 생물 유기 화학의 Shemyakin 및 Ovchinnikov 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다, 과학의 러시아 아카데미 (프로토콜 번호 226/2017).

1. A. 후미가투스 코니디아 응용 프로그램

  1. 형광으로 표기 된 A. fumigatus conidia를 얻으려면, 코니디아 펠릿에 3 %의 파라 포름알데히드의 1 mL을 추가하여 5 × 108 코니디아를 수정합니다. 실온에서 셰이커에 2 시간 동안 50 mL 테스트 튜브에서 인큐베이션.
  2. 20mL의 인산염 완충식식염(PBS)으로 코니디아를 세척: 원심분리기는 1,000 x g에서 15분 동안 1,000xg로 부드럽게 제거하고, 20mL의 부피에 신선한 PBS를 추가합니다. 반복하다.
  3. 0.1 M NaHCO3의900 μL에서 코니디아를 녹입니다.
  4. 디메틸 설프리산화물 의 100 μL에 594 nm 형광 염료의 succinimidyl 에스테르를 녹이고 코니디아에 추가합니다.
  5. 실온에서 150 rpm에서 셰이커에 1 시간 동안 염료로 코니디아를 인큐베이션하....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상기 프로토콜에 따라, 마우스의 폐엽에서 기도 및 A. 후미가투스 코니디아를 보여주는 3D 영상을 얻었다(도1A). 스트렙타비딘 (기도 시각화에 사용 된) 라벨 기관지 및 기관지15. 또한, 그들의 형태에 의해 기도와 쉽게 구별할 수 있는 대형 선박, 및 흉막은 기도 채널(그림1A-C)에서시각화된다. 기도 표면과 마스크의 생성은 기도 채널에서 선박과 흉막 투영의 제거를 허용; 그러나, 기도 표면의 무결성은 여러 기관지 가지(도1B-C)에서스트렙타비딘의 약한 신호로 인해 파괴된다. 기도 마스크의 추가 처리는 누락 된 조각의 수리를 허용(도 1D).

마우.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전장기 3D 이미징은 시편의 해부 없이 데이터를 얻는 것을 허용하며, 이는 유기체에서 병원체의 해부학적 분포의 공간 적 측면을 조사하는 데 매우 중요합니다. 레이저 광 산란을 극복하고 전신 학습자 이미징15, 16,18,19를허용하는 데 도움이되는 조직 광학 클리어링의 몇 가지 기술 및 변형이 있습니다. 사용자 지정 조직 청산 접근법 중 하나는 메탄올 기반 조직 탈수 및 탈지, 그리고 BABB로 광학 클리어링으로 구성됩니다. 이 접근법은 100여 년 전에 개발되었으며 몇 가지 수정 사항이 있습니다. 우리의 작업에서, 우리는 Scott 등에서 설명 한 가장 간단한 수정을 사용합니다. 15 이러한 접근법은 형광으로 표지된 병원균을 사용하일 때 최적.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는이 작품에 대한 이해 상충을보고합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 아스퍼질러스 후미가투스 코니디아 균주 AfS150을 제공한 스벤 크라프만 교수(대학 병원 에를랑겐과 FUA 에를랑겐-뉘른베르크, 독일)에게 감사를 표합니다. 저자는 MIPT 프레스 오피스에 감사드립니다. V.B. 러시아 연방 과학 고등 교육부 (#075-00337-20-03, 프로젝트 FSMG-2020-0003)를 인정합니다. A. fumigatus 코니디아 이미징 및 정량화에 관한 작업은 RSF No 19-75-00082에 의해 지원되었다. 기도 화상 진찰에 관하여 일은 RFBR No 20-04-60311에 의해 지원되었습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS 에스테르ThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus 분생자ATCC46645균주 AfS150, ATCC 46645 유도체
벤질 알코올Panreac141081.161198.0-100 %
벤질 벤조 에이트 AcrosAC10586-001099 + %
C57Bl / 6 마우스Pushchino 동물 사육 센터 (러시아)수컷.12-30 주령.
카테터VenisystemsG715-A0118G
Cell imaging coverglass-bottom chamberEppendorf307420284 or 8 well chamber with coverglass bottom
CentrifugeEppendorf5804R제공된 모든 원심분리기 1000 g 사용 가능
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경ZEISSZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich276855≥ 99.9%
FIJI 이미지 프로세싱 패키지FIJI무료 소프트웨어
집게B. Braun AesculapBD557R톱니
집게B. Braun AesculapBD321R세밀
집게 집게Bochem1727부드러운
유리병DURAN242101304바닥 뚜껑 그래픽
편집기 PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris 현미경 이미징 소프트웨어Oxford Instruments무료 평가판은
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
오브젝티브ZEISS420640-9800-000  Plan-Apochromat, 10 × (개수 = 0.3)
파라포름알데히드시그마-알드리치158127
PBS파네코P060Π
피펫ProLine7220205 to 50 μ L
분유RothT145.2
샘플 믹서DynalMXIC1
가위B. BraunBC257R블런트
셰이커ApexlabGS-2050-300 rpm
SkalpelBochem12646
실크 스레드B. Braun3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 접합체ThermoFisherS11223
시험관SPL Lifesciences5005050 mL
Tris (하이드록시메틸 아미노메탄)헬리콘H-1702-0.5  막 121.14; CAS 번호 : 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
ZEN 현미경 소프트웨어ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html
한 https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial 사용할 수 있습니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Laser MicroscopyAspergillus Fumigatus ConidiaOptical ClearingMouse Lung ImagingQuantitative AnalysisAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Related Articles