이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
석회성 대동맥 판막 질환(CAVD)은 노인 인구의 거의 3분의 1에 존재합니다. 대동맥 판막의 비후, 경화 및 석회화는 대동맥 협착을 유발하고 심부전 및 뇌졸중에 기여합니다. 질환 발병기전은 염증, 세포외 기질 리모델링, 난류, 및 기계적 스트레스 및 변형과 같은 다인성 및 스트레스가 판막 내피 및 판막 간질 세포의 골형성 분화에 기여한다. 그러나 건강한 세포의 석회화 세포로의 골형성 전이를 유도하는 정확한 개시 인자는 완전히 정의되지 않았습니다. 또한, CAVD 유발 대동맥 협착증에 대한 유일한 현재 치료법은 대동맥 판막 치환술이며, 이에 따라 천연 판막을 제거하거나(외과적 대동맥 판막 치환술, SAVR) 카테터를 통해 완전히 접을 수 있는 판막을 삽입한다(경피적 대동맥 판막 치환술, TAVR). 이러한 수술 절차에는 높은 비용과 심각한 위험이 따릅니다. 따라서 약물 발견을 위한 새로운 치료 표적을 식별하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 본 연구는 환자에서 외과적으로 제거된 조직과 기증자 사체 조직을 사용하여 체외 질환 모델링을 위한 판막 세포의 환자 특이적 기본 라인을 만드는 워크플로를 개발합니다. 이 프로토콜은 장기 이식에 일반적으로 사용되는 냉장 보관 용액의 활용을 도입하여 조직 절제와 실험실 처리 사이의 종종 긴 조달 시간으로 인한 손상을 줄이고 절제된 조직의 세포를 크게 안정화시키는 이점을 제공합니다. 본 연구의 결과는 단리된 판막 세포가 공여자로부터 판막을 제거한 후 수일 이상 배양물에서 그의 증식 능력 및 내피 및 간질 표현형을 유지한다는 것을 입증한다. 이러한 물질을 사용하면 대조군 및 CAVD 세포를 수집 할 수 있으며, 이로부터 대조군 및 질병 세포주가 모두 확립됩니다.
서론
석회성 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 염증, 섬유증 및 대동맥 판막 전단지의 거대 석회화를 특징으로하는 만성 병리학입니다. 전단지의 점진적인 리모델링 및 석회화 (대동맥 경화증이라고 함)는 뇌졸중에 기여하고 심부전으로 이어지는 혈류 차단 (대동맥 협착증)으로 이어질 수 있습니다. 현재 CAVD에 대한 유일한 치료법은 외과적 또는 경피적 대동맥 판막 치환술(각각 SAVR 및 TAVR)입니다. CAVD 진행을 중단하거나 역전시킬 수 있는 비수술적 옵션은 없으며, 판막 교체 없이 사망률은 2-3년 내에 50%에 접근합니다 1,2,3. 이 병리를 주도하는 기본 메커니즘을 정의하면 잠재적인 새로운 치료 접근 방식을 식별할 수 있습니다.
건강한 성인의 경우 대동맥 판막 전단지의 두께는 약 1mm이며 주요 기능은 좌심실4에서 혈액의 단방향 흐름을 유지하는 것입니다. 세 개의 전단지는 각각 전단지의 외부 표면을 감싸고 장벽 역할을하는 판막 내피 세포 (VEC) 층으로 구성됩니다. VEC는 투과성, 염증 세포 부착 및 파라 크린 신호 전달
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프로토콜
모든 환자 샘플은 헬싱키 선언에 따라 피츠버그 대학의 기관 검토위원회가 승인 한 연구에 등록 된 개인으로부터 수집됩니다. 장기 회복 및 교육 센터 (CORE)를 통해 얻은 사체 조직은 피츠버그 대학 사망자와 관련된 연구 및 임상 교육 감독위원회 (CORID)의 승인을 받았습니다.
1. 승인 및 안전
- 헬싱키 선언에 따라 환자 샘플 또는 사체 조직 수집에 대한 기관 검토 위원회(IRB) 승인 또는 면제 메모를 얻습니다.
- 혈액 매개 병원체 교육, 생물 의학 인간 대상 연구, 개인 정보 보호 및 정보 보안, 생물학적 물질의 운송 및 배송과 같은 인간 조직과 함께 작동하는 데 필요한 기관 교육을 받으십시오.
2. 물류 및 준비
- 수술 샘플
- 냉장고를 사용할 수 있고 수술실 근처에 있는지 확인하십시오. 수술진이 사용할 수 있도록 냉장 보관 용액의 멸균 분취액 40mL가 포함된 식별되지 않은 명명법이 미리 표시된 50mL 원추형 튜브를 이 냉장고에 보관하십시오. 이 튜브는 원래 패키지의 만료일까지 4 ° C에서 안정적입니다.
- 추출 시이 튜브에 밸브 조직을 넣으십시오. 누출 방지 비닐 봉지 또는 생물학적 위험 라벨이....
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결과
위의 프로토콜은 인간 판막 조직의 취급 및 이러한 조직으로부터 생존 가능한 세포주의 분리 및 확립에 필요한 단계를 설명합니다. 대동맥 판막의 전단지는 파라핀 포매를 위해 처리되고, 생화학 적 또는 유전 적 분석을위한 장기 보관을 위해 스냅 냉동되고, VEC와 VIC의 분리를 위해 소화됩니다 (그림 1). 수술 표본은 대동맥 협착증의 임상 진단을 받을 가능성이 높으며 육안으로 볼 수 있는 석회화의 무거운 결절을 나타낼 수 있지만 대동맥 판막 석회화는 상당수의 노인(>65세)32명에게 존재하며, 이러한 유병률로 인해 모든 조직(수술 및 사체)은 석회화가 있는지 여부를 평가하기 위해 Von Kossa 염색 또는 유사한 절차를 거칩니다(그림 2).
냉장 보관 용액을 사용하면 절제된 판막 조직의 세포가 크게 안정화되는 것으로 나타났습니.......
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토론
인간으로부터 제어 및 질병 조직을 얻는 것은 시험관 내 및 생체 외 질병 모델링에 중요합니다. 그러나 벤치와 침대 옆 사이의 간격을 메우는 어려움에 대해 자주 이야기하는 반면, 수술실에서 벤치로 이동하는 역순은 종종 그 격차를 벅차게 만듭니다. 기초 과학자가 1차 인체 조직 표본을 얻는 데 필수적인 것은 간호사, 외과 기술자, 의사 보조, 의대생 및 레지던트, 임상 프로토콜 관리자로 구성된 팀을 보유한 투자한 외과의사 과학자와의 협력으로, 환자를 등록 및 동의하고, 절제된 조직의 적절한 취급에 참여하고 지원하며, 조직 픽업에 필요한 물류를 조정합니다. 절제에서 세포 분리까지의 시간을 줄이기 위해 관련된 모든 사람의 최대한의 노력이 없으면 중요한 세포 물질과 그 안에 포함 된 정보가 돌이킬 수 없을 정도로 변경되거나 손실됩니다.
조직 표본의 생존력을 유지하는 데 중요한 것은 냉장 보관 용액을 사용하는 것입니다. 이것은 UPMC 및 기타 이식 의료 센터의 장기 이식 팀에서 사용하는 .......
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공개 사항
IS는 Atricure와 Medtronic으로부터 기관 연구 지원을 받고 Medtronic Vascular의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. 이러한 갈등 중 어느 것도 이 작업과 관련이 없습니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 원고에 대한 통찰력 있는 토론과 비판적 읽기에 대해 Jason Dobbins에게 감사드립니다. 우리는 장기 회복 및 교육 센터의 도움과 지원에 감사하고 이 연구를 가능하게 한 조직 기증자와 그 가족에게 감사드립니다. 모든 환자 샘플은 헬싱키 선언에 따라 피츠버그 대학의 기관 검토위원회가 승인 한 연구에 등록 된 개인으로부터 수집됩니다. 장기 회복 및 교육 센터 (CORE)를 통해 얻은 사체 조직은 피츠버그 대학 사망자와 관련된 연구 및 임상 교육 감독위원회 (CORID)의 승인을 받았습니다.
Biorender.com 로 만든 일부 그림.
CSH는 National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 및 R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111에 의해 지원된다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 0.45 &무; m 필터 | Thermo Scientific | 7211345 | 콜라겐 코팅이 된 준비 플레이트 |
| 10cm 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-One | 664160 | 세포 배양/세포주 확장 |
| 10mL 혈청학적 피펫 | Fisher | 14955234 | VEC/VIC 분리, 세포 배양, 세포주 확장 |
| 1000 μ L 필터 팁 | VWR | 76322-154 | 세포 배양/세포주 확장 |
| 10XL 필터 팁 | VWR | 76322-132 | 세포 배양/세포주 확장 |
| 15 mL 원추형 튜브 | Thermo Scientific | 339650 | 조직 저장, VIC/VEC 분리 |
| 16% 파라포름알데히드 수용액 | 전자 현미경 과학 | 15710S | 조직 및 세포 고정액 |
| 190 증거 에탄올 | Decon | 2801 | 소독 |
| 1x DPBS: 칼슘 없음, 마그네슘 | 없음 Gibco | 14190250 | 식염수. VIC/VEC 절연 |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | 식염수 용액. 조직 준비, VIC/VEC 격리 |
| 20 μ L 필터 팁 | VWR | 76322-134 | 세포 배양/세포주 확장 |
| 200 프루프 에탄올 | Decon | 2701 | 탈파라핀화 조직 샘플 |
| 2-프로판올 | Fisher | A416P 4 | 콜라겐 코팅 플레이트 만들기 |
| 5 mL 혈청학적 피펫 | Fisher | 14955233 | VEC/VIC 분리, 세포 배양, 세포주 확장 |
| 50 mL 코니컬 튜브 | Thermo 과학적 | 339652 | 조직 저장, VIC/VEC 절연 |
| 60mm 접시 | GenClone | 25-260 | VEC 절연 |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | Corning | 3516 | 세포 배양/세포주 확장 |
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| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | Gibco | 15140163 | 항생제. VIC 팽창 |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | 항마이코플라스마. VIC/VEC 분리 및 팽창 |
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| 표준 패턴 가위 | Fine Science Tools | 14001-14 | 조직 준비, VIC/VEC 절연 |
| 멸균 면봉 | Puritan | 25806 10WC | VEC 절연 |
| Swingsette 인체 조직 카세트 | Simport Scientific | M515-2 | 조직 포매 용기 |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | 조직 준비, VIC / VEC 분리 |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | Gibco | 15250061 | 세포 계수 용액 |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
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| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | 탈파라핀 조직 샘플 |
| &알파;SMA 항체 | Abcam | ab7817 | 1차 항체(VIC 양성 염색) |
참고문헌
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al.
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재인쇄 및 허가
