Method Article

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

DOI:

10.3791/62452

⸱

April 13th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, School of Medicine, 2Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 3Center for Critical Care Nephrology, University of Pittsburgh, School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 신장 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 주 이내에 신장 오가노이드를 생성합니다. 생성된 신장 오가노이드는 병렬 약물 테스트 접근법을 위해 대규모 스피너 플라스크 또는 다중 웰 자기 교반 플레이트에서 배양될 수 있다.

Abstract

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hPSCs에서 생성 된 신장 오가노이드는 신장 조직의 무한한 공급원을 제공했습니다. 인간 신장 오가노이드는 신장 질환 및 부상을 연구하고, 세포 기반 치료법을 개발하고, 새로운 치료법을 테스트하는 데 매우 유용한 도구입니다. 이러한 적용을 위해서는 많은 수의 균일 한 오가노이드와 재현성이 높은 분석이 필요합니다. 우리는 오가노이드의 전반적인 건강을 개선하기 위해 이전에 발표 된 신장 오가노이드 프로토콜을 기반으로합니다. 이 간단하고 견고한 3D 프로토콜은 지질, 인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민 보충제 및 GSK3 억제제(CHIR99021)를 함유한 폴리비닐알코올을 함유하는 최소 성분 배지에서 3일 동안 균일한 배아체를 형성한 다음, 녹아웃 혈청 대체(KOSR) 함유 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 또한, 교반 분석은 배아체의 응집을 줄이고 균일 한 크기를 유지할 수있게하며, 이는 오가노이드 간의 변동성을 줄이는 데 중요합니다. 전반적으로이 프로토콜은 다량의 신장 오가노이드를 생성하기위한 빠르고 효율적이며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.

Introduction

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최근 몇 년 동안, 인간 다능성 줄기 세포를 신장 오가노이드로 분화시키기 위한 다수의 프로토콜이 개발되었다 1,2,3,4,5. 신장 오가노이드는 새로운 재생 의학 접근법에 대한 연구를 돕고, 신장 관련 질병을 모델링하고, 독성 연구 및 치료 약물 개발을 수행하는 데 중요한 도구를 제공했습니다. 그들의 광범위한 적용성에도 불구하고, 신장 오가노이드는 성숙의 부족, 시험관 내에서의 제한된 장기 배양 능력, 및 인간 신장6,7,8에서 발견되는 여러 세포 유형의 소박함과 같은 한계를 갖는다. 최근의 연구는 오가노이드 성숙 수준을 향상시키고, 배양 기간을 연장하며, 기존 프로토콜 9,10,11,12를 수정하여 신장 세포 집단의 복잡성

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Protocol

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hPSCs를 사용한 모든 실험은 제도적 지침에 따라 수행되었고, 적절한 개인 보호 장비를 갖는 클래스 II 생물안전 후드에서 수행되었다. 모든 시약은 달리 언급되지 않는 한 세포 배양 등급이다. 모든 배양물은 37°C, 5%CO2 공기 분위기에서 배양된다. 분석의 모든 단계에서, 배아체 또는 신장 오가노이드를 수집하고, 고정시키거나 분석을 위해 준비할 수 있다. 이 데이터를 생성하는 데 사용되는 hPSC 라인은 완전히 특성화되고 공개되었다(18).

1. 배양접시 준비

참고: hPSC를 분할하기 약 1시간 전에, 2 x 100 mm 조직 배양 플레이트를 줄기 세포 적격 기저막 매트릭스 추출물(BME)로 코팅하십시오. 플레이트를 미리 코팅하고 파라핀 필름으로 밀봉한 다음 제조업체의 지침에 따라 4°C에서 보관할 수 있습니다.

  1. 클래스 II 생물안전 후드에서 2 x 100 mm 조직 배양 처리된 플레이트 (신장 오가노이드 분석을 위해 1개, 세포주를 유지하기 위해 1개) 및 15 mL 원뿔형 튜브를 준비한다.
  2. 8 mL의 차가운 혈청이 없는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 15 mL 원뿔형 튜브에 넣고....

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Results

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이 프로토콜의 가장 최신 버전에서, 신장 오가노이드 분화는 정의 된 저단백질 배지에서 시작됩니다. 상기 분석은 전적으로 현탁액에서 수행되며, 세뇨관 형성의 개시를 위한 hPSCs 분화 및 조직의 선천적 능력에 의존한다. 100 mm ∼60% 합류성 hPSC 배양 플레이트로부터 기원한 단일 검정은 우리의 이전 간행물 5에 나타난 바와 같이 일상적으로 500-1,000개의 신장 오가노이드를 산출한다. 이렇게 많은 수의 오가노이드가 생성되기 때문에, 이 프로토콜은 화합물 테스트에 매우 적합하다. 우리는 일상적으로 복합 테스트를 위해 6-well 형식을 사용하지만,이 프로토콜은 두 번째 단계 (3 일 이후)에서 더 높은 처리량의 복합 테스트를 위해 다른 멀티 웰 형식으로 쉽게 확장 될 수 있습니다. 파라핀 절편의 면역형광은 오가노이드, 즉 간세포 핵 인자-1 베타 (HNF1B) 및 연꽃 테트라고놀로버스 렉틴 (LTL) (도 3A - HNF1B, LTL)을 발현하는 신장 세뇨관에서 네프론 세그먼.......

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Discussion

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이전의 연구들은 초기 프로토콜 단계들이 중간 중배 엽 분화 5,19,20에 매우 중요하며, 따라서, 이 단계에서 엄격한 배지 조성물을 구현하는 것이 필수적이라는 것을 보여주었다. 프로토콜의 첫 번째 단계로부터 혈청, 알부민, 단백질 프리 하이브리도마 배지 II와 같은 정의되지 않은 성분을 제거하는 것은 분석(21) 사이의 일관된 분화 효율을 향상시키는 데 도움이 될 수 있다.

신장 세포의 대사 상태는 그 기능에 매우 중요하며, 포도당 변화는 변화된 대사 상태(22)로 이어질 수 있다. 이전의 연구들은 높은 수준의 포도당 (최대 25mM)이 내피 세포 기능 장애를 유도하고 신장 세포의 성장 및 산화 능력을 변화시킬 수 있다고 기술.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 국립 보건원 R01 DK069403, UC2 DK126122 및 P30-DK079307 및 ASN 신장 연구 재단 Ben J. Lipps Research Fellowship Program에서 AP에 자금을 지원했습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolThermo Fisher21-985-023
항접착 헹굼 용액STEMCELL Technologies7010
CHIR99021STEMCELL Technologies7205410 mM 재고 in DMSO
Corning  일회용 스피너 플라스크Fisher Scientific07-201-152
Corning 초저 부착 6웰 플레이트Fisher Scientific07-200-601
코닝 저속 교반기Fisher Scientific11-495-03스피너 플라스크 배양을 위한 다중 플레이트 마그네틱 교반기
DispaseSTEMCELL Technologies7923부분 표본 및 동결
DMEM, 저포도당, 피루브산, 글루타민 없음, 페놀 레드없음 Thermo Fisher11054020
DPBS 1x, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Thermo Fisher14-190-250
계란 / 타원형 교반 바2magPI20106
Excelta 범용 핀셋Fisher Scientific17-456-103세포 배양 후드에서 멸균 유지
EZBio 일회용 배지 병, 250mLFoxx Life Sciences138-3211-FLSPVA 10%
Falcon Standard Tissue Culture Dish (100 mm)Thermo Fisher08-772E
Fisherbrand  멸균 흡인 피펫 2mL피셔 사이언티픽14-955-135
피셔브랜드  셀 리프터 - 셀 리프터Fisher Scientific08-100-240
Fisherbrand  다기능 3D 회전 장치Fisher Scientific88-861-047궤도 셰이커
Geltrex LDEV-Free 감소 성장 인자 기저층 멤브레인 매트릭스Thermo FisherA1413302BME. 얼음에 분취하고 얼립니다. 또 다른 적합한 매트릭스 대안은 Matrigel 또는 Cultrex입니다.
부드러운 세포 해리 시약STEMCELL Technologies7174GCDR
GlutaMAX 보충제Thermo Fisher35-050-061L-글루타민 보충제.
HEPES (1M)Thermo Fisher15-630-080
인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민Thermo Fisher51-500-056ITSE
KnockOut  혈청 대체품 - 다종Thermo FisherA3181502KOSR. 부분 표본 및 동결
지질 혼합물 1, 화학적으로 정의된Millipore-SigmaL0288-100ML
MEM 비필수 아미노산 용액Thermo Fisher11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP 멸균 진공 여과 시스템 500mLFisher ScientificS2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup 퀵 릴리즈-GP 멸균 진공 여과 시스템 250mLFisher ScientificS2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP 제어 유닛2magVMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP 마이크로플레이트 교반 드라이브2magVMF 406006MSP
MP Biomedicals  7X 클리닝 솔루션Fisher ScientificMP0976670A4조직 배양에 적합한 세제. 물에 5% 용액 만들기
mTeSR1STEMCELL Technologies85850hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium도 테스트되었으며 적합한 대안입니다.
Nunc 50 mL 원뿔형 멸균 원심분리기 튜브Fisher Scientific12-565-270
Nunc 15mL 원뿔형 멸균 원심분리기 튜브FisherScientific 12-565-268
페니실린-스트렙토마이신써모 Fisher15-140-122부분 표본 및 동결
플라즈모신인비보젠ant-mptAnti-mycoplasma reagent. 부분 표본 및 동결
pluriStrainer® 200 µ mFisher ScientificNC0776417 세포 여과기
pluriStrainer® 500 µ mFisher ScientificNC0822591 세포 여과기
폴리(비닐 알코올) 87-90% 가수분해  (PVA)Millipore-SigmaP8136-250G10%를 DPBS에서 98도 C에서 젓다가 용해됨, 138-3211-FLS
ROCK 억제제 Y-27632 (ROCKi)STEMCELL Technologies7230410 mM 재고를 DPBS
멸균 일회용 혈청학 피펫으로 만들기  - 10mLFisher Scientific13-678-11E
멸균 일회용 혈청학 피펫 - 25mLFisher Scientific13-678-11
멸균 일회용 혈청학 피펫 - 5 mLFisher Scientific13-678-12D
TeSR-E5STEMCELL Technologies5916E5-ILP
Variomag distriBOX 2 유통 업체2magVMF 90512하나 이상의 MIXdrive를 사용하는 경우
를 만드는 데 사용됨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney ....

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