R-Loops 및 RNA:DNA 하이브리드를 S9.6 기반 면역침전법을 사용한 매핑

요약

R-loops는 DNA 염기서열과 위상학적 호의성에 따라 모든 게놈에서 발생하는 전사 유도 non-B DNA 구조의 일반적인 부류를 구성합니다. 최근 몇 년 동안 R-loops는 다양한 적응 및 부적응 역할과 관련이 있으며 인간 장애의 맥락에서 게놈 불안정성과 관련이 있습니다. 결과적으로, 게놈에서 이러한 구조를 정확하게 매핑하는 것은 많은 연구자들에게 높은 관심사입니다. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation에 이은 고처리량 염기서열분석)가 여기에 설명되어 있습니다. R-루프의 정확한 반정량적 매핑을 허용하는 강력하고 재현 가능한 기술입니다. 이 방법의 최근 반복은 R-루프의 가닥 특이적 및 고해상도 매핑을 허용하는 초음파 처리(sDRIP-seq)를 사용하여 단편화가 수행되는 방식도 설명되어 있습니다. 따라서 sDRIP-seq는 해상도 및 좌초 측면에서 DRIP-seq 방법의 일반적인 제한 사항 중 일부를 해결하여 R-루프 매핑에 선택되는 방법입니다.

초록

R-loops는 DNA 염기서열과 위상학적 호의성에 따라 모든 게놈에서 발생하는 전사 유도 non-B DNA 구조의 일반적인 부류를 구성합니다. 최근 몇 년 동안 R-loops는 다양한 적응 및 부적응 역할과 관련이 있으며 인간 장애의 맥락에서 게놈 불안정성과 관련이 있습니다. 결과적으로, 게놈에서 이러한 구조를 정확하게 매핑하는 것은 많은 연구자들에게 높은 관심사입니다. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation에 이은 고처리량 염기서열분석)가 여기에 설명되어 있습니다. R-루프의 정확한 반정량적 매핑을 허용하는 강력하고 재현 가능한 기술입니다. 이 방법의 최근 반복은 R-루프의 가닥 특이적 및 고해상도 매핑을 허용하는 초음파 처리(sDRIP-seq)를 사용하여 단편화가 수행되는 방식도 설명되어 있습니다. 따라서 sDRIP-seq는 해상도 및 좌초 측면에서 DRIP-seq 방법의 일반적인 제한 사항 중 일부를 해결하여 R-루프 매핑에 선택되는 방법입니다.

서론

R-루프는 초기 RNA 전사체가 주형 DNA 가닥에 혼성화될 때 전사하는 동안 주로 형성되는 3가닥 핵산 구조입니다. 그 결과 RNA:DNA 하이브리드가 형성되고 단일 가닥 루프 상태에서 비템플릿 DNA 가닥이 변위됩니다. 생화학적 재구성 ^1,2,3,4 및 수학적 모델링⁵은 다른 생물물리학적 측정^6,7과 함께 R-루프가 특정 유리한 특성을 나타내는 영역에서 발생할 가능성이 더 높다는 것을 확인했습니다. 예를 들어, 구아닌(G)과 시토신(C)의 분포에서 가닥 비대칭을 나타내어 RNA가 G-rich인 영역, 즉 positive GC skew라고 하는 특성은 DNA duplex⁸에 비해 DNA:RNA hybrid의 열역학적 안정성이 더 높기 때문에 전사할 때 R-loops를 형성하는 데 선호됩니다. 많은 진핵생물 유전자 <....

프로토콜

다음 프로토콜은 배양에서 성장한 인간 Ntera-2 세포주에 최적화되어 있지만, 다른 인간 세포주(HEK293, K562, HeLa, U2OS), 일차 세포(섬유아세포, B 세포) 및 변형이 적은 다른 유기체(마우스, 파리)에 변형 없이 성공적으로 적용되었습니다.

1. 세포 수확 및 용해

1. Ntera-2 세포를 75%-85% 포화도로 배양합니다. 최적의 세포 수가 5-600만 개의 세포이고 >90%의 생존 가능한 세포로 DRIP 절차를 시작할 수 있는지 확인합니다.
2. 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 1.5mL의 Trypsin-EDTA 1x를 첨가한 다음 세포가 접시에서 분리될 때까지 37°C에서 2분 동안 배양합니다.
3. 5mL의 따뜻한 배지와 피펫 웰을 첨가하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 재현탁합니다. 내용물을 새 15mL 튜브에 옮기고 300 x g 에서 3분 동안 세포를 부드럽게 펠릿화합니다.
4. 5mL의 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 300 x g 에서 3분 동안 세포를 부드럽게 펠릿화합니다.
5. 1.6mL의 TE 완충액(10mM Tris-Cl pH 7....

결과

DRIP과 sDRIP은 qPCR(그림 2A) 및/또는 염기서열분석(그림 2B)을 통해 분석할 수 있습니다. 면역침전 단계 후에는 먼저 양성 및 음성 대조군 유전자좌에 대한 qPCR과 RNase H 처리 대조군으로 실험의 품질을 확인해야 합니다. 여러 인간 세포주에서 자주 사용되는 유전자 자리에 해당하는 프라이머는 표 2에 나와 있습니다. qPCR의 결과는 입력의 백분율로 표시되어야 하며, 이는 주어진 유전자 자리에 대한 용해 시 R-루프를 운반하는 세포의 백분율에 해당합니다. 성공적인 DRIP 실험에서 음성 유전자좌의 수율은 0.1% 미만이어야 하는 반면, RPL13A 와 같이 고도로 전사된 유전자좌의 경우 양성 유전자좌는 1%에서 10% 이상까지 다양할 수 있습니다(그림 2A). sDRIP의 경우, 수율은 DRIP-qPCR.......

토론

여기에는 S9.6 항체를 사용하여 잠재적으로 모든 유기체에서 R-loop 구조를 매핑하는 두 가지 프로토콜이 설명되어 있습니다. DRIP-seq는 개발된 최초의 게놈 전체 R-루프 매핑 기술을 나타냅니다. 이는 쉽고 강력하며 재현 가능한 기술로, 모든 게놈을 따라 R-루프의 분포를 매핑할 수 있습니다. sDRIP-seq라고 하는 두 번째 기술도 견고하고 재현성이 높지만 초음파 처리 단계와 좌초 염기서열분석 라이브러리 구성 프로토콜이 포함되어 있어 더 높은 해상도와 가닥 특이성을 달성합니다. 두 기술 모두 면역침전 전 RNase H 처리에 매우 민감하며, 신호가 주로 정품 RNA:DNA 하이브리드에서 파생됨을 확인합니다. 마지막으로, R-loop positive 유전자좌와 R-loop negative loci 간의 면역침전 수율을 비교할 때 두 기술 모두 여러 인간 세포주에서 최대 100배의 차이를 제공하여 낮은 background에서 높은 특이성 매핑을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 튜브, 고밀도 Maxtract 위상 잠금 젤	Qiagen	129065
2 mL 튜브, 위상 잠금 젤 라이트	, VWR	10847-800
아가로스 A/G 비드,	ThermoFisher Scientific	20421
Agencourt AMPure XP 비드,	Beckman Coulter	A63881
AmpErase Uracil N-glycosylase	ThermoFisher Scientific	N8080096
인덱스 어댑터	Illumina		TrueSeq Single 인덱스
Klenow fragment (3' to 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S
NEBNext End Repair module	New England BioLabs	E6050
라이브러리 증폭			용 PCR 프라이머프라이머 1.0 P5 (5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
		을 위한 PCR 프라이머	PCR 프라이머 2.0 P7 (5' CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT 3')
페놀/클로로포름 이소아밀 알코올 25:24:1	Affymetrix	75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR 마스터 믹스	ThermoFisher Scientific	F548S
퀵 라이게이션 키트	New England BioLabs	M2200S
리보뉴클레아제 H	New England BioLabs	M0297S
S9.6 항체	Kerafast	ENH001	이 세 가지 소스는
S9.6 항체	Millipore/Sigma	MABE1095
S9.6 항체	Abcam	ab234957

, , 에 해당 라이브러리 증폭과 동일합니다.