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방법 논문

긴 non-coding RNA와 직접적인 RNA-RNA 상호 작용에 관여하는 RNA의 확인

1.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62475

⸱

2021년 7월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculté des Sciences Médicales et Paramédicales, Aix Marseille Univ, CNRS, INP

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

사용하기 쉬운 RNA 풀다운 프로토콜은 긴 non-coding RNA와 RNA/RNA 직접 상호 작용에 관여하는 RNA를 식별하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 psoralen을 고정제로 사용하여 RNA/RNA 상호작용만 가교하고 RNA 염기서열분석과 결합할 때 긴 비암호화 RNA의 전체 직접 RNA 상호작용체를 제공합니다.

초록

요즘 생리학 및 병태생리학에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 역할이 증가함에 따라 분자 파트너, DNA, 단백질 및/또는 RNA를 식별하여 상호 작용체를 특성화하는 것이 중요합니다. 후자는 단백질을 포함하는 네트워크를 통해 lncRNA와 상호 작용할 수 있지만 직접적인 RNA/RNA 상호 작용에도 참여할 수 있습니다. 따라서 우리는 RNA/RNA 상호 작용만 가교하는 분자인 psoralen을 사용하여 lncRNA와 직접 RNA/RNA 상호 작용에 관여하는 RNA를 식별할 수 있는 사용하기 쉬운 RNA 풀다운 절차를 개발했습니다. lncRNA 2차 구조의 생물정보학 모델링을 통해 내부 염기 쌍의 낮은 확률을 나타내는 영역에 대한 강한 친화력을 가진 여러 특정 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 선택할 수 있었습니다. 설계된 특정 프로브는 lncRNA의 길이에 걸쳐 접근 가능한 영역을 표적으로 했기 때문에 RNA 상호 작용 영역은 lncRNA의 순서로 설명할 수 있었습니다. 고처리량 RNA 염기서열분석과 결합하면 이 프로토콜은 관심 있는 lncRNA의 전체 직접 RNA 상호작용체 연구에 사용할 수 있습니다.

서론

긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 길이가 200개 뉴클레오티드보다 긴 비단백질 암호화 전사체입니다. 그들의 수는 계속 증가하고 있으며, 인간의 경우 58,000명 이상입니다. 또한, 생리학 및 병태생리학에서 이들의 중요한 역할은 조절 기능을 구현할 수 있도록 분자 파트너를 특성화하는 것이 필수적입니다. 실제로, lncRNAs의 기능을 이해하는 한개의 접근은 각 lncRNA의 상호 작용하는 분자 파트너를 검출하는 것이다.

lncRNA의 분자 표적은 DNA, 단백질 또는 RNA가 될 수 있으며, 이를 확인하기 위해 다양한 기술이 개발되었습니다. 이와 관련하여, lncRNAs와 상호 작용하는 단백질의 확인은 관심사의 단백질에 대하여 항체가 lncRNAs를 특이적으로 끌어내리기 위하여 이용되는 다른 RNA-immunoprecipitation (RIP) 절차를 포함하여 각종 프로토콜의 목적, (검토1을 위해). RNA Targets2(CHART)의 Capture Hybridization Analysis 또는 ChIRP(Chromatin Isolation by RNA Purification3)와 같은 다른 기술을 사용하면 관련 단백질 복합체와 함께 lncRNA를 풀다운할 수 있습니다. 이러한 후자의 기술에서는 lncRNA가 미끼로 사용됩니다. CHART와 ChIRP는 또한 lncRNA 점유 2,3을 보여주는 게놈 지도를 식별하는 강력한 기술입니다. 더하여, 이 RNA 풀다운 방법은 lncRNA의 RNA 파트너를 확인하는 것을 가능하게 한다. lncRNA에 의해 표적화된 RNA의 포획을 허용하는 절차가 설명되었습니다. Antisense DNA 비오틴화 올리고뉴클레오티드 프로브는 lncRNA 2차 구조4의 생물정보학 모델링에 의해 결정된 바와 같이 내부 염기쌍의 확률이 낮은 영역에 대해 설계되었습니다. 그러나, 이 절차는 RNA 파트너가 단백질 네트워크를 통해 간접적으로 상호 작용하는지 또는 lncRNA와의 직접적인 RNA/RNA 상호 작용을 통해 직접 상호 작용하는지 여부를 구별하지 않습니다. psoralen 유도체와의 가교결합은 염기쌍(base-pairing)에 의해 매개되는 직접 RNA/RNA 상호작용을 선택하기 위해 선택되는 방법인것으로 나타났습니다 5. Psoralen 유도체는 실제로 이중 가닥 DNA 또는 RNA로 삽입하고 자외선(365nm)을 조사한 후 피리미딘을 공유 결합할 수 있습니다6. 비오틴화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 RNA 풀다운을 psoralen과의 가교결합과 결합하는 것은 lncRNA와 직접적인 RNA/RNA 상호 작용에 관여하는 RNA를 식별하기 위해 여기에서 제안하는 사용하기 쉬운 절차입니다. 더욱, 이 절차는 lncRNA의 길이를 따라서 디자인된 다른 oligonucleotide 조사가 이용되는 경우에 lncRNA의 순서에 있는 RNA 상호 작용 지역을 묘사하는 것을 허용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 프로브 설계

  1. 전문 무료 웹 서버 소프트웨어를 사용하여 lncRNA의 2차 구조를 생성합니다: RNAstructure software7 또는 Vienna RNA web suite8. 내부 염기쌍의 확률이 낮은 영역을 선택하고 이 lncRNA의 다른 영역에 대해 25개의 염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계합니다.
  2. 무료 학술 소프트웨어인 AmplifX(https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr)로 설계된 모든 올리고뉴클레오티드를 확인하여 이러한 프로브에 대한 다양한 정보를 얻고 최상의 매개변수를 가진 프로브를 선택하십시오.
    알림: 다음과 같이 소프트웨어에서 최적의 매개변수를 확인하십시오. GC의 백분율 : 40에서 60 사이, 3 '안정성, 복잡성, 자체 엔드 이량체 : "양호". 용융 온도(TM)는 친화력이 실온에서 수행되기 때문에 중요하지 않습니다.
  3. 정렬 검색 도구(즉, Blast 등)를 사용하여 선택한 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브가 선택한 세포에서 발현된 다른 RNA의 뉴클레오티드 염기서열을 인식하지 않는지 확인합니다.
    1. 25개 염기 길이의 비특이적 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계합니다. 이 프로브가 관심 있는 lncRNA에 대한 친화력이나 관심 게놈의 다른 RNA 염기서열에 대한 친화성을 나타내지 않는지 확인합니다.
  4. 트리에틸렌글리세롤 스페이서(TEG)와 함께 3'-말단에 비오틴 변형이 추가된 모든 프로브를 주문하십시오. 이 스페이서는 입체 장애를 피하기 위해 올리고-비오틴 거리를 증가시킵니다.
    알림: 최적의 결과를 얻고 풀다운 결과의 특이성을 평가하려면 동일한 영역에 최소 두 개의 서로 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계한 다음 효율성을 실험적으로 비교하십시오.

2. 가교

  1. 78.5cm2 세포 배양 접시에서 합류할 때까지 세포(예: 이 실험에 사용된 GH4C1 세포)를 성장시킵니다. 세포 배양 배지를 제거한 후 Ca2+ 및 Mg2+ (PBS+)가 풍부한 저온 인산염 완충 식염수 5mL로 세포층을 헹구고 PBS+ 에서 0.1mg/mL 농도로 제조된 소랄렌 유래 분자(4'Aminomethyltrioxsalen hydrochloride) 용액 3mL를 추가합니다.
  2. 배양 플레이트를 37°C의 포유류 세포 배양 인큐베이터에 5% CO2로 30분 동안 놓습니다. 30분 후 뚜껑을 열고 365nm UV 튜브에서 2.5cm 떨어진 얼음 위에 배양 접시를 UV 가교제에 10분 동안 놓습니다. 접시를 섬세하게 저어주고 추가로 10분 동안 UV 노출을 복원합니다.
  3. 흡인에 의해 배지를 버리고 PBS+ 1mL를 추가하여 세포 스크레이퍼로 세포를 수집한 다음 마이크로 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리기 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 펠릿을 -80 °C에서 비축하십시오.

3. 세포 용해

  1. 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.0, 1mM EDTA, 0.5% SDS 및 5μL/mL RNase 억제제를 첨가하여 Proteinase K 완충액을 준비합니다.
  2. 이 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁합니다(1 x 107 개 세포당 약 200μL). proteinase K를 최종 농도 0.1 μg/μL에 추가하고 50 °C에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 95°C에서 10분 동안 배양하여 단백질 분해 효소 K를 비활성화합니다.

4. 초음파 처리

  1. 이 용해물 100 μL (5.106 세포에 해당)을 두 개의 마이크로 튜브에 분배하고 200 μL의 혼성화 완충액 (700 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA, 1.25 % SDS, 5 μL / mL RNase 억제제 용액 및 15 % 포름 아미드)을 각 튜브에 첨가합니다.
  2. 초음파 발생기의 4 ° C 수조에 튜브를 놓고 30 초 꺼짐으로 분리 된 2 시리즈의 30 초 펄스 (고강도)로 초음파 처리를 시작합니다.
  3. 입력 제어 샘플로 사용할 20μL의 샘플을 수집하고 -80°C에서 보관합니다.
    참고 :이 초음파 처리 절차는 이전에 2,000 개의 뉴클레오티드9 범위의 RNA 단편을 얻기 위해 GH4C1 세포주에 최적화되었습니다. 다른 세포주의 경우 초음파 처리 절차를 최적화해야 합니다. 이 기술이 매우 긴 비 코딩 RNA의 RNA 파트너를 연구하기 위해 수행 될 때, 초음파 처리 단계는 lncRNA의 적절한 회수를 얻는 데 필수 불가결한 것으로 입증되었습니다. 따라서 이 경우 lncRNA 길이를 따라 최대 4,000개의 뉴클레오티드마다 결합 부위가 있는 여러 프로브를 설계해야 합니다. lncRNA의 전체 길이를 복구하려면 몇 가지 특정 probe의 풀을 사용하십시오. 그러나 RNA-RNA 결합에 관여하는 lncRNA의 영역을 확인하는 것이 목적인 경우 특정 프로브를 별도로 사용해야 합니다. 또한, 더 작은 lncRNA의 RNA 파트너를 연구하는 경우, 초음파 처리 단계가 필요한지 결정하기 위해 실험을 수행해야합니다.

5. RNA 풀다운

  1. 1일차 - 하이브리드화 단계
    1. 각 시료 튜브에 150 pmol(100 μM 원액 1.5 μL)의 비오틴화 특이적 또는 비특이적 프로브를 추가합니다. 실온(RT)(약 30rpm)에서 튜브 회전기에서 교반하면서 4시간 동안 배양합니다.
    2. 필요한 양의 마그네틱 비드(즉, 프로브 혼성화 반응 150pmol당 비드 40μL)를 취합니다. 자석 지지대를 사용하여 상업용 매체에서 비드를 분리합니다. 상층액을 버리고 비드를 900μL의 혼성화 완충액으로 세척합니다. 완료되면 동일한 부피의 Hybridization buffer에 마그네틱 비드를 다시 현탁시킵니다.
    3. 각 샘플 튜브에 마그네틱 비드를 추가합니다(프로브 혼성화 반응 150pmol당 비드 40μL). RT(약 30rpm)의 튜브 회전기에서 교반하면서 밤새 배양합니다.
  2. 2일차 - RNA 분리 단계
    1. 자석 지지대를 사용하여 세포 용해물에서 비드를 분리합니다(2-3분). 상등액을 버리고 900μL의 세척 완충액(0.5% SDS, 2x SSC)으로 비드를 RT의 회전기에서 교반하면서 5분 동안 배양합니다. 이 세척을 5회 반복합니다.
    2. 마지막 세척을 제거한 후 비드에 95μL의 Proteinase K buffer를 추가합니다. 입력 샘플을 해동하고 75μL의 Proteinase K 완충액을 추가합니다. 모든 튜브(시료 및 입력 시료)에서 최종 농도 1μg/μL에 5μL의 proteinase K를 추가합니다. 45 ° C에서 45 분 동안 배양 한 다음 95 ° C에서 10 분 동안 배양합니다.
    3. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 자기 지지체를 사용하여 상층액에 존재하는 RNA에서 비드를 분리합니다. DNase 분해 단계가 포함된 RNA 정제 키트로 RNA를 정제합니다. 정제된 RNA는 -80°C에서 보관하십시오.
      참고: 용리된 RNA는 RT-qPCR 또는 고처리량 RNA 염기서열분석을 통해 농축된 전사체를 검출할 수 있습니다. RNA 염기서열분석 분석의 경우, STAR10 또는 HISAT211과 같은 무료 소프트웨어를 사용하여 판독값을 관심 게놈에 정렬할 수 있으며, FeatureCounts12 또는 HTSeq count13을 사용하여 정량화를 수행할 수 있습니다.

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결과

lncRNA interactome, 즉 lncRNA, 단백질, RNA 및 DNA와 상호 작용하는 세포 구성 요소의 설명은 lncRNA의 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. lncRNA interactome을 특성화하기 위해 RIP, CHART, ChIRP 및 RNA 풀다운을 포함한 다양한 기술이 개발되었습니다. 후자는 lncRNAs의 RNA 표적을 확인하는데 강력한 것으로 보였지만, 이러한 절차는 RNA 파트너가 단백질 네트워크를 통해 간접적으로 상호 작용하는지 또는 직접 RNA/RNA 상호 작용을 통해 직접 상호 작용하는지 여부를 나타내지 않습니다. 그러나, 수많은 lncRNAs가 그들의 기능을 발휘하는 기계장치는 다른 RNAs, 수시로 mRNAs와의 RNA/RNA 상호 작용에 의존하는 지금 믿어지고, 이 직접적인 RNA 표적을 위한 게놈 넓은 발견을 위한 방법의 발달을 결정적으로 만들기. 또한, 염기쌍에 의해 매개되는 이러한 RNA/RNA 상호작용은 psoralen 유도체와 가교결합될 수 있다

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토론

수많은 lncRNA는 mRNA에 대한 상보적인 염기쌍을 통해 기능을 수행합니다. 그러므로, lncRNAs의 직접적인 RNA interactome를 특성화할 수 있는 절차를 개발하는 것이 중요하다. 그러므로, RNA 풀다운 기술과 가교 결합 시약으로 psoralen의 사용을 결합하는 절차가 개발되었습니다.

설명된 RNA 풀다운 프로토콜에서 안티센스 DNA 비오틴화 올리고뉴클레오티드 프로브의 설계 및 선택은 lncRNA 2차 구조의 생물정보학 모델링 및 내부 염기 쌍의 낮은 확률을 나타내는 원하는 lncRNA 영역에 대해 혼성화되는 프로브의 후속 선택을 기반으로 합니다. 사용 가능한 다양한 알고리즘이 서로 다른 2차 구조를 예측한다는 점을 감안할 때, 가장 많은 수의 예측된 2차 구조에서 위의 기준을 충족하는 프로브를 선택해야 합니다. 또한 프로브 선택을 위해 GC의 백분율, 3' 안정성, 복잡성 및 자체 엔드 이량체와 같...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Aix-Marseille University와 Centre National Recherche Scientifique의 지원을 받았으며 Sandoz Laboratories의 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

오픈 액세스 비용을 위한 자금 지원: Aix-Marseille University 및 Centre National Recherche Scientifique

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4′-Aminomethyltrioxsalen hydrochlorideSigmaA4330Crosslinker 시약
Bioruptor PlusDiagenodeB01020001Sonicator
Biotynilated probeIDT올리고뉴클레오티드 프로브
CFX96 실시간 시스템BioRad4351107qPCR 장치
DNA 올리뉴클레오티드IDTqPCR용 프라이머
Dynabeads My OneThermo-Fisher65001마그네틱 스트렙타비딘 비드
포름아미드Thermo-Fisher15515-026포름아
미드 iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad1725124qPCR 시약
Proteinase KSigmaP2308Proteinase K
RNA to DNAThermo-Fisher4387405역전사 키트
RNA XS 정제 키트Macherey-Nagel740902RNA 정제키트
RNAseOUTThermo-Fisher10777-019RNAse inhibitor
tube rotatorStuartSB2Eppendorf tube rotator
UV Stratalinker 1800Stratagene#400072UV crosslinker

참고문헌

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