사용하기 쉬운 RNA 풀다운 프로토콜은 긴 non-coding RNA와 RNA/RNA 직접 상호 작용에 관여하는 RNA를 식별하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 psoralen을 고정제로 사용하여 RNA/RNA 상호작용만 가교하고 RNA 염기서열분석과 결합할 때 긴 비암호화 RNA의 전체 직접 RNA 상호작용체를 제공합니다.
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방법 논문
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사용하기 쉬운 RNA 풀다운 프로토콜은 긴 non-coding RNA와 RNA/RNA 직접 상호 작용에 관여하는 RNA를 식별하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 psoralen을 고정제로 사용하여 RNA/RNA 상호작용만 가교하고 RNA 염기서열분석과 결합할 때 긴 비암호화 RNA의 전체 직접 RNA 상호작용체를 제공합니다.
요즘 생리학 및 병태생리학에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 역할이 증가함에 따라 분자 파트너, DNA, 단백질 및/또는 RNA를 식별하여 상호 작용체를 특성화하는 것이 중요합니다. 후자는 단백질을 포함하는 네트워크를 통해 lncRNA와 상호 작용할 수 있지만 직접적인 RNA/RNA 상호 작용에도 참여할 수 있습니다. 따라서 우리는 RNA/RNA 상호 작용만 가교하는 분자인 psoralen을 사용하여 lncRNA와 직접 RNA/RNA 상호 작용에 관여하는 RNA를 식별할 수 있는 사용하기 쉬운 RNA 풀다운 절차를 개발했습니다. lncRNA 2차 구조의 생물정보학 모델링을 통해 내부 염기 쌍의 낮은 확률을 나타내는 영역에 대한 강한 친화력을 가진 여러 특정 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 선택할 수 있었습니다. 설계된 특정 프로브는 lncRNA의 길이에 걸쳐 접근 가능한 영역을 표적으로 했기 때문에 RNA 상호 작용 영역은 lncRNA의 순서로 설명할 수 있었습니다. 고처리량 RNA 염기서열분석과 결합하면 이 프로토콜은 관심 있는 lncRNA의 전체 직접 RNA 상호작용체 연구에 사용할 수 있습니다.
긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 길이가 200개 뉴클레오티드보다 긴 비단백질 암호화 전사체입니다. 그들의 수는 계속 증가하고 있으며, 인간의 경우 58,000명 이상입니다. 또한, 생리학 및 병태생리학에서 이들의 중요한 역할은 조절 기능을 구현할 수 있도록 분자 파트너를 특성화하는 것이 필수적입니다. 실제로, lncRNAs의 기능을 이해하는 한개의 접근은 각 lncRNA의 상호 작용하는 분자 파트너를 검출하는 것이다.
lncRNA의 분자 표적은 DNA, 단백질 또는 RNA가 될 수 있으며, 이를 확인하기 위해 다양한 기술이 개발되었습니다. 이와 관련하여, lncRNAs와 상호 작용하는 단백질의 확인은 관심사의 단백질에 대하여 항체가 lncRNAs를 특이적으로 끌어내리기 위하여 이용되는 다른 RNA-immunoprecipitation (RIP) 절차를 포함하여 각종 프로토콜의 목적, (검토1을 위해). RNA Targets2(CHART)의 Capture Hybridization Analysis 또는 ChIRP(Chromatin Isolation by RNA Purification
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1. 프로브 설계
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lncRNA interactome, 즉 lncRNA, 단백질, RNA 및 DNA와 상호 작용하는 세포 구성 요소의 설명은 lncRNA의 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. lncRNA interactome을 특성화하기 위해 RIP, CHART, ChIRP 및 RNA 풀다운을 포함한 다양한 기술이 개발되었습니다. 후자는 lncRNAs의 RNA 표적을 확인하는데 강력한 것으로 보였지만, 이러한 절차는 RNA 파트너가 단백질 네트워크를 통해 간접적으로 상호 작용하는지 또는 직접 RNA/RNA 상호 작용을 통해 직접 상호 작용하는지 여부를 나타내지 않습니다. 그러나, 수많은 lncRNAs가 그들의 기능을 발휘하는 기계장치는 다른 RNAs, 수시로 mRNAs와의 RNA/RNA 상호 작용에 의존하는 지금 믿어지고, 이 직접적인 RNA 표적을 위한 게놈 넓은 발견을 위한 방법의 발달을 결정적으로 만들기. 또한, 염기쌍에 의해 매개되는 이러한 RNA/RNA 상호작용은 psoralen 유도체와 가교결합될 수 있다
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수많은 lncRNA는 mRNA에 대한 상보적인 염기쌍을 통해 기능을 수행합니다. 그러므로, lncRNAs의 직접적인 RNA interactome를 특성화할 수 있는 절차를 개발하는 것이 중요하다. 그러므로, RNA 풀다운 기술과 가교 결합 시약으로 psoralen의 사용을 결합하는 절차가 개발되었습니다.
설명된 RNA 풀다운 프로토콜에서 안티센스 DNA 비오틴화 올리고뉴클레오티드 프로브의 설계 및 선택은 lncRNA 2차 구조의 생물정보학 모델링 및 내부 염기 쌍의 낮은 확률을 나타내는 원하는 lncRNA 영역에 대해 혼성화되는 프로브의 후속 선택을 기반으로 합니다. 사용 가능한 다양한 알고리즘이 서로 다른 2차 구조를 예측한다는 점을 감안할 때, 가장 많은 수의 예측된 2차 구조에서 위의 기준을 충족하는 프로브를 선택해야 합니다. 또한 프로브 선택을 위해 GC의 백분율, 3' 안정성, 복잡성 및 자체 엔드 이량체와 같.......
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이 연구는 Aix-Marseille University와 Centre National Recherche Scientifique의 지원을 받았으며 Sandoz Laboratories의 보조금으로 자금을 지원받았습니다.
오픈 액세스 비용을 위한 자금 지원: Aix-Marseille University 및 Centre National Recherche Scientifique
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4′-Aminomethyltrioxsalen hydrochloride | Sigma | A4330 | Crosslinker 시약 |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Biotynilated probe | IDT | 올리고뉴클레오티드 프로브 | |
| CFX96 실시간 시스템 | BioRad | 4351107 | qPCR 장치 |
| DNA 올리뉴클레오티드 | IDT | qPCR용 프라이머 | |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | 마그네틱 스트렙타비딘 비드 |
| 포름아미드 | Thermo-Fisher | 15515-026 | 포름아 |
| 미드 iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR 시약 |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | Proteinase K |
| RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | 역전사 키트 |
| RNA XS 정제 키트 | Macherey-Nagel | 740902 | RNA 정제키트 |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| tube rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | #400072 | UV crosslinker |
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