여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
중증 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 인한 COVID-19 전염병이 계속 진화함에 따라 바이러스에 대한 항체중화의 존재가 향후 감염에 대한 보호를 제공할 수 있다는 것이 명백해지고 있다. 따라서 효과적인 COVID-19 백신의 생성 및 번역이 전례 없는 속도로 계속됨에 따라 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법의 개발은 이전에 감염되고 예방 접종된 개인 모두에 대한 감염에 대한 장기적인 보호를 결정하는 것이 점점 더 중요해질 것이다. 본 논문은 최근 COVID-19에서 회복된 환자로부터 회복세럼에서 항체를 중화시키는 존재를 측정하기 위해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 함께 가시성 성 정맥성 구내염 바이러스(VSV)를 이용한 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 복제 의사유형 바이러스를 사용하면 SARS-CoV-2 처리에 필요한 봉쇄 레벨 3 시설의 필요성을 제거하여 이 프로토콜을 거의 모든 봉쇄 수준 2 실험실에 액세스할 수 있게 합니다. 96웰 형식을 사용하면 24h의 짧은 처리 시간으로 많은 샘플을 동시에 실행할 수 있습니다.
서론
2019년 12월, 새로운 코로나바이러스가 확인되었으며, 현재 코로나바이러스 질환의 원인제인 SARS-CoV-2(COVID-19)1로알고 있다. SARS-CoV-2는 코로나비대 가문에 속하는 베타코로나바이러스입니다. 이러한 봉투바이러스는 큰 양성감지 RNA 게놈을 포함하며 인간과동물2 모두에서 호흡기 및 장 감염에 대한 책임이 있다. 2021년 5월 현재 전 세계적으로 1억 5,700만 건이상의 COVID-19사례가 보고되었으며 320만 명 이상이 사망했다. 효과적인 백신의 발달은 적어도 77의 전임상 백신을 조사하고 90현재 임상 시험을 겪고 있는 전 세계 연구원의 1차 목표가 되었습니다4.
코로나바이러스는 스파이크 단백질(S), 뉴클레오캡시드(N), 봉투 단백질(E), 막 단백질(M)을 포함한 4가지 구조 단백질을 인코딩한다. SARS-CoV-2의 진입은 숙주 수용체와 S의 수용체 결합 도메인(RBD), 인간 혈관신생-변환 효소 2(hACE2), 및 후속 멤브레인 융합다음의 상호 작용이 필요하며, 숙주 세포 세린 프로테제, 트랜스멤브레인 프로테아제 세린 ....
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프로토콜
1. SARS-CoV-2 의사 바이러스의 생산 및 정량화를 위한 도금 세포(1일)
- 조직 배양 준비
- 따뜻한 1x 덜벡코의 인산염 완충식식(DPBS); 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/연쇄절제술(선택 사항)을 함유하고 있습니다. 및 약 15분 동안 수조에서 37°C까지 트립신-에틸렌디아민 테트라아세틱산(EDTA)을 0.25% 하였다.
- 70% 에탄올로 조직 배양 후드를 소독하고, 필요에 따라 조직 배양 후드에 조직 배양 접시, 파스퇴르 파이펫 및 세로지학적 파이펫을 배치합니다. PBS, DMEM 및 트립신을 수조에서 제거하고 조직 배양 후드에 넣기 전에 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- 세포 도금 및 유지 관리
- T75 조직 배양 플라스크에서 DMEM(10% FBS 함유)에서 베로 E6 세포를 성장시키고, 37°C 인큐베이터에서 15cm 조직 배양식을 5%CO2로성장한다. 세포가 80-90% 컨할 때 필요에 따라 세포를 통과합니다.
- 각 접시에 1x PBS의 10mL를 추가하고 부드럽게 4-5 번 흔들어 세포를 씻어; PBS를 흡인합니다. 각 접시에 트립신-EDTA 3mL을 추가하고 접시를 흔들어 전체 ....
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결과
이 프로토콜은 VSV-S-eGFP 의사 바이러스 감염의 억제를 통해 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 중화 항체를 검출하는 신속하고 효과적인 방법을 간략하게 설명합니다(eGFP 포시의 손실에 의해 정량화 가능). 프로토콜의 회로도 표현은 그림 1에묘사됩니다. 분석이 실행될 때마다 상용화 가능한 항체를 양성 대조군으로 사용하여 분석의 일관성을 보장하는 것이 좋습니다. 여기서, 우리는 IGG 대조군에 비해 SARS-CoV-2 스파이크 RBD에 대하여 시판적으로 이용 가능한 중화 IgG 항체를 사용하여 희석 곡선을 보여줍니다(두 항체에 대한 세부 사항은 재료의 표 참조; 그림 2).
회복 환자 샘플은 SARS-CoV-2 감염 후 약 3개월 동안 수집되었으며, 상기에 기재된 방법을 사용하여 의사바이러스 중화가 결정되었다(도
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토론
여기에 설명된 방법은 필요에 따라 다양한 실험실 환경과 리소스에 맞게 조정될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜의 주요 한계는 봉쇄 수준 2 공간 및 조직 배양 후드에 대한 필요성이다. VSV-S-eGFP와 같은 SARS-CoV-2 스파이크를 사용하여 가시형RNA 바이러스를 복제하는 응용은, 봉쇄 수준 3 작업 영역을 필요로 하지만, 일부 그룹에 대한 제한으로 남아있을 수 있는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 강력한 대안이다. 여기에 설명된 다른 모든 단계는 매우 유연하며 거의 모든 봉쇄 수준 2 실험실에서 수행될 수 있습니다. 예를 들어 자동 계수 기능을 사용하는 형광 이미저를 사용할 필요는 없습니다. 여기서 사용되는 96웰 형식은 사용 가능한 가장 낮은 목표(2배)를 사용하여 거의 전체를 이미지화하기 위해 약 4개의 뷰 필드만 필요하다는 것을 의미합니다.
수동 형광 현미경은 각 우물의 여러 필드를 이미지하는 데 사용될 수 있으며, ImageJ (무료 소프트웨어)는 .......
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공개 사항
저자는이 출판물과 관련된 경쟁 금융 이익이 없습니다.
감사의 글
우리는 관대이 프로토콜에 사용되는 VSV-S-eGFP 바이러스를 제공 Whelan 실험실감사 (케이스 외. 2020에 설명). 우리는 또한 환자 혈액 샘플을 수집한 빌 카메론 박사와 주타포르 코완 (및 팀)에게 감사드립니다 (REB 프로토콜 ID 20200371-01H). 저자는 이 기사의 연구, 저자 및/또는 출판에 대한 다음과 같은 재정적 지원의 수신을 공개합니다: 이 작품은 오타와 병원 재단의 관대 한 지원과 캐나다 보건 연구 원 (#448323)의 보조금과 COVID-19 과학을위한 엉겅퀴 재단의 빠른 보조금에 의해 조달되었으며, 온타리오 대학원 장학금 및 미택 펠로우십에 자금을 지원합니다. JP는 클러스터 미탁스 펠로우십에 의해 지원됩니다. T.A.는 CIHR 반팅 펠로우십의 지원을 받습니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 참가하고 그들의 혈액 견본을 기증한 모든 개별에게 감사하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's 매체 (분말) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 중화 항체, 마우스 Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| 베로 E6 셀 | ATCC& | nbsp; CRL-1586 |
참고문헌
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource....
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재인쇄 및 허가
